Piastredi tipizzazione HLA
Istruzioni per l’uso
Per uso diagnostico in vitro
1
Introduzione:
Le piastredi tipizzazione HLA di Invitrogen™ sono intese per l’utilizzo ai fini del rilevamento e della definizione degli antigeni
di istocompatibilità e per la tipizzazione delle cellule HLA.
Il test di microlinfocitotossicità impiega quale target i linfociti. Le cellule vitali vengono facilmente estratte dal sangue periferico,
dai linfonodi, dalla milza, ecc. Questa prova sierologica misura la morte cellulare mediante attivazione del complemento
(coniglio) in presenza di combinazioni specifiche anticorpo-antigene. La reazione complemento-anticorpo-antigene viene
misurata mediante osservazione microscopica con ingrandimento 150 x con illuminazione tramite tecnica di contrasto di fase ed
un colorante vitale quale l’eosina Y o lo ioduro di propidio. Le cellule morte (ovvero le cellule contenenti l’antigene rilevato
dagli antisieri specifici) assorbono il colorante ed esibiscono un’opportuna modificazione del colore. Le cellule negative (ovvero
le cellule prive dell’antigene rilevato dagli antisieri specifici) rimangono vitali ed escludono il colorante.
Le piastre di tipizzazione HLA di Invitrogen™ sono intese per l’utilizzo nelle prove di microlinfocitotossicità ai fini della
definizione degli antigeni HLA. Nella confezione sono inclusi degli antisieri operativamente monospecifici e multispecifici
rispetto agli antigeni HLA. In ogni piastra sono inclusi i controlli negativi e positivi.
ATTENZIONE: MANIPOLARE QUALI MATERIALI IN GRADOPOTENZIALMENTE DI TRASMETTERE
MALATTIE INFETTIVE
Il plasma e/o siero da cui è stato derivato il prodotto quivi descritto è stato analizzato ed è risultato negativo all’HBsAg,
all’HIV-1, e all’HCV mediante metodo di prova approvato dall’Ente statunitense preposto al controllo degli alimenti e dei
farmaci (Food and Drug Administration, FDA). Tuttavia, non esiste alcun test in grado di garantire in termini assoluti l’assenza
dell’HIV, del virus dell’epatite B e di altri agenti infettivi. Essi devono pertanto essere manipolati quali campioni di sangue
umano potenzialmente infettivi.
2
2.1
2.2
2.3
3
Componenti del kit:
Piastreda 72 pozzetti contenenti 1 μl per pozzetto di antisieri contenenti sodio azide allo 0,1% come conservante e rosso
fenolo come indicatore del PH, sotto uno strato di olio minerale di 4-5 μl. Conservare a -55°C o ad una temperatura
inferiore in un CONGELATORE NO-FROST.
Complemento di coniglio, 3 ml vial(s). Conservare a -55°C o ad una temperatura inferiore in un CONGELATORE NOFROST.
Foglio di lavoro / Certificato di analisi
Materiali, Reagenti ed Apparecchiature non inclusi:
3.1
3.2
3.3
3.4
Centrifuga da banco
Microscopio ottico
Microscopio invertito a contrasto di fase o a fluorescenza
Pipette Pasteur da 152 mm e 229 mm
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
Siringhe per microtitolazione da 50 μl, 100 μl, 250 μl
Provette da 12 x 75 mm e 17 x 100 mm
Contaglobuli
Vetrino di copertura da 20 x 30 mm
Microsfere magnetiche, Preparato di cellule HLA Dynabeads® I di Invitrogen™ (codice di prodotto 21902-USA,
21002D-Tutti gli altri) e Preparato di cellule HLA Dynabeads® II della Invitrogen™ (codice di prodotto 21903-USA,
21003-Tutti gli altri)
Destrano al 5%
Soluzione Ficoll-Hypaque
RPMI-1640 con tampone HEPES e Penicillina/Streptomicina aggiunta
Soluzione Salina Bilanciata di Hank (Hank’s Balanced Salt Solution, HBSS)
Trypan Blue
Soluzione a base di eosina Y o di CFDA
Formalina neutralizzata al 12-37% con PH 7,0±0,2 o ioduro di propidio in soluzione di quenching
Siero umano proveniente da donatori plurimi (Pooled Human Serum, PHS), N. codice prodotto Invitrogen™ 34005100
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
3.17
4
Requisiti per il campione:
4.1
Preparare una sospensione di linfociti derivati da 10 ml di sangue intero prelevato in una provetta vacutainer eparinizzata,
contenente acido citrato destrosio o citrato di sodio. Regolare la concentrazione cellulare a 2-3 x 106 cellule/ml. La
sospensione linfocitaria va preparata entro le 48 ore successive al prelievo del campione di sangue intero ai fini della
vitalità ottimale. La sospensione deve essere conservata a temperatura ambiente fino all’utilizzo.
Una vitalità superiore all’80% senza contaminazione eccessiva delle cellule non linfocitarie è essenziale ai fini della
performance ottimale dei sieri di tipizzazione linfocitaria.
La contaminazione granulocitaria o un sottofondo elevato di linfociti non vitali potrebbero dare adito ad una reazione
falsa positiva.
La contaminazione piastrinica potrebbe comportare una lisi incompleta dei linfociti con conseguente reazione falsa
negativa.
Per la preparazione dei linfociti ci si può attenere alla procedura descritta qui di seguito o agli altri metodi alternativi
elencati nel Manuale delle procedure di laboratorio redatto dalla Società Americana Istocompatibilità e Immunogenetica
(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, ASHI).
4.2
4.3
4.4
4.5
5
Preparazione della sospensione linfocitaria:
5.1
5.2
5.2.1
5.2.1.1
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
5.10
5.10.1
5.10.2
5.10.3
5.10.4
Prelevare 10 ml di sangue intero in una provetta vacutainer eparinizzata, contenente acido citrato destrosio o citrato di
sodio. (È stato accertato che l’acido etilene diamino tetracetico (ethylenediaminetetraacetic, EDTA) non è un
anticoagulante accettabile.) Mantenere il campione a temperatura ambiente fino all’utilizzo.
Centrifugare il sangue per 10 minuti a
700-900 x g per ottenere la formazione di buffy-coat.
Ciò può anche essere eseguito mediante impiego di un agente aggregante quale il destrano al 5% nel modo seguente:
Miscelare 2 ml di destrano al 5% con 10 ml di sangue intero e lasciare sedimentare i globuli rossi a 37°C per 15
minuti.
Usando una pipetta Pasteur, asportare cautamente il buffy-coat (2 ml circa) e trasferirlo in una provetta pulita da 17 x 100
mm contenente 5 ml di Soluzione Salina Bilanciata di Hank (Hank’s Balanced Salt Solution, HBSS). Miscelare
accuratamente.
Dispensare 4 ml di soluzione a base di gradiente Ficoll-Hypaque (FH) (22°C) in un una provetta pulita da 17 x 100 mm.
Trasferire cautamente la sospensione con il buffy-coat al di sopra della soluzione a base di gradiente FH.
Centrifugare per 20 minuti a 700 x g. In seguito alla centrifugazione, le cellule mononucleari saranno rinvenibili come
banda sottile all’interfaccia tra il plasma/diluente e la soluzione a base di gradiente.
Aspirare l’intero strato di cellule mononucleari e trasferirlo in una provetta da 17 x 100 mm. Diluire con 4 ml di HBSS.
Centrifugare per 10 minuti a 600 x g. Rimuovere il supernatante, risospendere delicatamente il pellet cellulare,
aggiungere 4 ml di HBSS e quindi centrifugare per 10 minuti a
600 x g.
Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in RPMI-1640 con soluzione fisiologica al 20%.
Analizzare la sospensione cellulare con un contaglobuli. Determinarne la purezza ed eseguire la conta citologica.
Regolare la concentrazione cellulare a
2-3 x 106 cellule/ml.
Eseguire un test di vitalità conformemente alla procedura riportata qui di seguito.
Aggiungere una goccia di Trypan Blue ed una goccia di sospensione cellulare in una provetta pulita, quindi miscelare
accuratamente.
Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 min.
Esaminare le cellule all’emocitometro. Le cellule vitali hanno la membrana cellulare intatta e pertanto sono lisce; sono
in grado di escludere il colorante Trypan blu e pertanto risulteranno incolori. Le cellule non vitali non hanno la
membrana cellulare intatta e percio non sono lisce; non sono in grado di escludere il Trypan blu e pertanto risulteranno
colorate.
Le sospensioni linfocitarie sono pronte per l’uso nel Test di microlinfocitotossicità della classe I mediante il metodo di
esclusione del colorante
6
6.1
6.2
6.2.1
6.2.2
6.2.3
7
7.1
7.2
7.2.1
7.3
7.4
7.5
Separazione dei linfociti B e T:
Procedura con lana di nylon:
I linfociti B e T sono facilmente separabili per mezzo dell’utilizzo della tecnica della lana di nylon. I macrofagi ed i
linfociti B aderiscono alla lana di nylon, mentre i linfociti T non possiedono questa proprietà. Per ulteriori informazioni
sulla procedura di separazione dei linfociti B e T pregasi consultare la 4a Edizione del Manuale delle procedure di
laboratorio redatto da ASHI, Sezione 1.A.6 “Separazione tramite lana di nylon dei linfociti B e T”.
Procedura tramite microsfere:
Le microsfere magnetiche sono acquistabili presso diversi produttori.
Il Preparato di cellule HLA I ed il Preparato di cellule HLA II (Invitrogen™) sono stati testati per l’uso con le
piastredelle classi I e II. Pregasi consultare le Istruzioni per l’uso fornite da ciascun produttore.
I linfociti B e T purificati mediante microsfere sono generalmente pre-colorati con diacetato carbossi-fluoresceina
(Carboxyfluorescein Diacetate, CFDA) o bromuro di etidio.
Test di microlinfocitotossicità:
Preparare una sospensione linfocitaria con una vitalità minima dell’80% senza contaminazione eccessiva delle cellule
non linfocitarie.
Estrarre le piastredi tipizzazione HLA di Invitrogen™ dal congelatore, scongelare e lasciare che le piastreraggiungano la
temperatura ambiente per l’esecuzione immediata del test. Riporre le restanti piastrecongelate in un congelatore no-frost
impostato su una temperatura pari o inferiore a -55°C.
Le piastre di cui sia stata aperta la confezione devono essere utilizzate immediatamente o possono essere conservate per
un periodo massimo di un mese ad una temperatura pari o inferiore a -55°C.
Utilizzando una siringa da 50 µl, aggiungere 1 µl di soluzione linfocitaria (approssimativamente 3.000 linfociti) nella
parte superiore di ciascun pozzetto del test, facendo attenzione a non toccare gli antisieri. Esaminare ciascun pozzetto
onde accertare l’avvenuta miscelazione della sospensione linfocitaria e dell’antisiero.
Incubare le piastre a temperatura ambiente (22°C ± 3°C).
Classe I (esclusione del colorante)
30 min
Classe I (fluorescenza)
30 min
Classe II (fluorescenza)
45 min
Utilizzando una siringa da 250 µl, aggiungere 5 µl del complemento di coniglio incluso nella confezione della piastra nei
pozzetti del test, facendo attenzione a non toccare la miscela di antisieri/linfociti con le punte delle siringhe.
Nota: le piastre di tipizzazione sono state ottimizzate con la partita di complementofornito con l’attrezzatura.
L’impiego di un complemento diverso potrebbe generare reazioni deboli o risultati falsi positivi.
7.6
7.7
7.8
7.8.1
7.9
7.9.1
7.9.2
7.10
8
8.1
8.2
Incubare le piastre a temperatura ambiente (22°C ± 3°C).
Classe I (esclusione del colorante)
60 min
Classe I (fluorescenza)
50 min
Classe II (fluorescenza)
60 min
Utilizzando una siringa da 100 µl o equivalente, aggiungere 2 µl di eosina Y acquosa filtrata al 5% in ciascun pozzetto
del test ed incubare a temperatura ambiente (22°C ± 3°C) per 3-5 minuti. Fare attenzione che le punte delle siringhe non
entrino in contatto con la miscela di antisieri/linfociti. Omettere questa fase se si conduce il test con fluoresceina.
Utilizzando una siringa da 250 µl, aggiungere 5 µl di formalina neutralizzata filtrata in ciascun pozzetto del test, facendo
attenzione a non toccare la miscela di antisieri/linfociti. Omettere questa fase nei test condotti con fluoresceina.
Prove con fluorosceina: aggiungere 5 µl di ioduro di propidio in una soluzione di quenching in ciascun pozzetto del
test, facendo attenzione a non toccare la miscela di antisieri/linfociti.
Ricoprire la piastra con un vetrino di copertura e lasciare riposare le piastre a temperature ambiente per 15 minuti per
consentire ai linfociti di sedimentarsi.
Le piastre marcate con l’eosina Y possono essere lette dopo un’ora o il giorno successivo.
Le piastre marcate con la fluorosceina possono essere lette dopo 30 minuti o il giorno successivo.
Nota: la lettura di una piastra marcata con fluoresceina dopo 36 ore potrebbe comportare un incremento dei
risultati falsi positivi.
Esaminare il test mediante osservazione microscopica con ingrandimento 150 x impiegando la tecnica di illuminazione a
contrasto di fase.
Risultati:
Le cellule morte (ovvero le cellule contenenti l’antigene) assorbono il colorante, appaiono ingrandite e scurite ed
esibiscono un dettaglio nucleare distintivo. Le cellule vitali (ovvero cellule prive dell’antigene), escludono il colorante,
appaiono lievemente più luminose ed esibiscono una dimensione ridotta rispetto alle cellule morte.
Alternativamente, le cellule vitali marcate mediante fluorescenza presentano una colorazione verde mentre le cellule non
vitali appaiono rosse.
8.3
9
9.1
9.1.1
9.1.2
9.1.3
10
In seguito alla correzione percentuale delle cellule morte nei pozzetti per il controllo negativo, valutare gli esiti del test
nel seguente modo:
% di cellule
morte
Punteggio
0-10
1
Interpretazione
Negativo
11-20
2
Negativo incerto
21-50
4
Positivo debole
51-80
6
Positivo
81-100
8
Fortemente
positivo
--
0
Illeggibile
Standard procedurali:
Specificità e Sensibilità
Le piastre di tipizzazione HLA di Invitrogen™ sono state ampiamente collaudate per mezzo di screening interno ed
esterno mediante raffronto con un pannello di linfociti ben caratterizzati contenente vari gruppi etnici. Le diluizioni e la
specificità di ciascun siero di tipizzazione HLA di Invitrogen™ sono stati determinati mediante titolazione (usando
diluizioni seriali) e raffronto con sospensioni linfocitarie con tipi di HLA noti. Ciascun siero è da usarsi alla relativa
diluizione ottimale a garanzia del conseguimento del massimo valore reattivo preservando la specificità. La maggior
parte dei sieri possiede un valore R pari o superiore allo 0,8. Le informazioni riportate nel Certificato di analisi accluso
a ciascun lotto di piastre forniscono delucidazioni in merito ad eventuali reazioni inattese.
Il Siero di controllo positivo HLA di Invitrogen™ HLA (siero linfocitario anti-umano di coniglio) è compreso in ogni
piastra.
Il siero umano proveniente da donatori multipli (Pooled Human Serum, PHS) di Invitrogen™® è usato quale Siero di
controllo negativo in ciascuna piastra. Il siero è stato analizzato ed è risultato negativo per la presenza di anticorpi
linfocitotossici contro i linfociti T e B mediante le prove standard di microlinfocitotossicità.
Risoluzione dei problemi:
10.1 La presenza di un sottofondo elevato o il conseguimento di risultati falsi positivi potrebbero essere imputabili a:
10.1.1 Il campione contiene una bassa vitalità cellulare o cellule danneggiate. Asportare le cellule morte prima dell’aggiunta
nelle piastre di tipizzazione oppure preparare un’altra sospensione cellulare.
10.1.2 Il campione è contaminato da granulociti o da altre cellule non linfocitarie. Asportare le cellule non linfocitarie prima
dell’aggiunta nelle piastre di tipizzazione oppure preparare un’altra sospensione cellulare.
10.1.3 I reagenti contenenti sostanze tossiche o il cui PH non rientra nella gamma fisiologica normale potrebbero causare il
danneggiamento delle cellule. Accertarsi che i reagenti impiegati siano stati debitamente analizzati.
10.1.4 Il complemento è troppo potente o presenta un livello elevato di tossicità. Usare il lotto di complemento fornito con
l’attrezzatura.
10.1.5 Si è applicato un tempo di incubazione eccessivo. Accertarsi di attenersi rigorosamente alle presenti Istruzioni per l’uso
relativamente al tempo d’incubazione da osservarsi a seconda della tecnica di isolamento delle cellule impiegata.
10.1.6 Il conseguimento di una reazione incompleta o di falsi positivi può essere causato dal trascinamento delle cellule o del
siero.
10.2 Il conseguimento di una reazione debole o di risultati falsi negativi potrebbe essere imputabile a:
10.2.1 Concentrazione eccessiva del campione. Accertarsi che la concentrazione cellulare sia regolata a 2-3 x 106 cellule/ml.
10.2.2 Il campione è contaminato da piastrine.
10.2.3 La modifica del PH dei reagenti è dovuta all’esposizione al CO2 o a contaminazione batterica. Usare dei reagenti
freschi e controllare il PH prima dell’uso.
10.2.4 Il complemento è troppo debole o si è disattivato prima dell’aggiunta nelle piastre. Usare il lotto di complemento
fornito con l’attrezzatura.
10.2.5 L’incubazione è avvenuta ad un temperatura inadeguata. Una temperatura troppo bassa comporta il rallentamento della
reazione mentre una temperatura eccessivamente elevata provoca la degradazione dei componenti termolabili.
Accertarsi che la temperatura sia impostata su 22°C ± 3°C.
10.2.6 Si è osservato un tempo di incubazione insufficiente. Accertarsi di attenersi rigorosamente alle presenti Istruzioni per
l’uso relativamente al tempo d’incubazione da osservarsi a seconda della tecnica di isolamento delle cellule impiegata.
11
11.1
11.2
11.3
11.4
11.5
11.6
11.7
11.8
Restrizioni e precauzioni:
Il complemento di coniglio è un reagente essenziale ai fini della conduzione del test di linfocitotossicità e può variare di
lotto in lotto. Un complemento inadeguato causa reazioni deboli o false negative o un sottofondo elevato nel controllo
negativo. L’attività del complemento di coniglio può essere stabilita mediante analisi con opportuni controlli positivi e
negativi, nonché linfociti e antisieri noti.
Invitrogen Corporation raccomanda l’utilizzo del complemento del lotto specificatofornito con l’attrezzatura..
I complementi HLA-ABC e DR di Invitrogen™ sono stati individualmente testati per l’accertamento della qualità in
termini di soddisfacimento dei requisiti minimi di titolazione e tossicità del sottofondo (pregasi consultare il catalogo e/o
il foglietto illustrativo allegato a ciascun complemento). Si raccomanda, tuttavia, di analizzare dei campioni di ciascuna
nuova partita di complemento eseguendo il raffronto con una partita nota o preesistente. Un complemento di coniglio
adeguato dovrebbe esibire un valore pari a 8 nel controllo positivo e nella maggior parte delle reazioni positive.
Dovrebbe esibire unvalore pari a 1 nel controllo negativo e nella maggior parte dei pozzetti negativi.
Si deve evitare l’esposizione alla CO2 in considerazione di una possibile modifica del PH che potrebbe risultare anticomplementare.
L’esistenza della reattività crociata nel sistema HLA costituisce un fenomeno noto e potrebbe dare adito a reazioni false
positive. Alcuni degli antisieri contenuto nella confezione della piastra di tipizzazione HLA esibiscono una specificità
ampia (supertipica). Tali antisieri sono descritti nel foglio di lavoro.
Il test HLA tramite le piastre di tipizzazione HLA di Invitrogen™ deve essere eseguito in presenza di un Direttore,
Supervisore Tecnico e/o Supervisore Generale debitamente qualificati attenendosi agli standard per laboratori
consuetudinariamente accettati. È opportuno sottolineare che l’uso dei presenti prodotti è riservato ai professionisti
debitamente qualificati.
I campioni vanno conservati a temperatura ambiente fino all’utilizzo e non si deve usare l’acido etilene diamino
tetracetico (ethylenediaminetetraacetic, EDTA) come anticoagulante per il prelievo dei campioni.
Tutti i risultati di tipizzazione devono essere confermati mediante un altro metodo di tipizzazione.
PR0006
Revisione 05
Stampato 8/08
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CH62 3QL, U.K.
Tel: 44 151 346 1234
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Fax: (800) 331-2286
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149986
Prodotti Auto-Dichiarato (CE marcato)
HLA C Locus Piastredi Tipizzazione
