Dipartimento di Neuroscienze
Sezione di Fisiologia
Ipossia e danno neuronale: studio sperimentale “in vitro”
INTRODUZIONE
Il danno cerebrale ipossico-ischemico prenatale e perinatale è il fattore maggiormente responsabile
della morbidità e mortalità di neonati e bambini (Vannucci, 1990) che spesso porta a ritardo mentale,
epilessia, difficoltà di apprendimento e disabilità motorie (paralisi cerebrale infantile).
La patogenesi di questo danno è complessa dal momento che è correlata ad una cascata di eventi
tossici tempo-dipendenti che includono (i) rapida “deplezione” dei magazzini intracellulari di
adenosintrifosfato (ATP), (ii) glicolisi anaerobica, acidosi da acido lattico, e depolarizzazione della
membrana cellulare, (iii) eccitotossicità da glutammato, (iv) aumento dell’entrata di calcio, sodio e
acqua nelle cellule con conseguente rigonfiamento, (v) attivazione di enzimi calcio-stimolati, (vi)
attivazione del sistema immunitario, (vii) iperespressione di particolari geni e (viii) morte neuronale.
(Lerouet et al., 2002, Kato and Kogure, 1999; Lee et al., 2000). Questi eventi sono simili a quelli
descritti nell’ictus cerebrale del paziente adulto, ma la gravità con cui questi danneggiano il cervello
immaturo, è profondamente influenzata dall’età fetale in cui il avviene l’evento ipossico (Yager and
Thornhill, 1997). Infatti, la suscettibilità del SNC immaturo all’ipossia/anossia, è dipendente dallo stato
dei processi di sviluppo critici quali la proliferazione, migrazione, differenziazione, mielinizzazione,
così come dalla regolazione del flusso sanguigno cerebrale e dal metabolismo.
In molte aree del Sistema Nervoso Centrale (SNC) di mammifero, utilizzando preparati biologici che
consistono in fettine di cervello mantenute in vita “in vitro” quali quelle di corteccia somatosensoriale,
talamo-corticali o di ippocampo-corteccia entorinale dove vengono conservate le connessioni dei
circuiti nervosi, è possibile, tramite registrazioni elettrofisiologiche studiare gli effetti dell’ipossia.
Durante l’evento ipossico i neuroni e le cellule gliali vanno incontro ad una severa ed improvvisa
depolarizzazione (Hansen 1985; Somjen et al. 1993) inducendo una risposta che viene definita
depolarizzazione ipossica (HD), che si verifica entro pochi minuti dal blocco sinaptico. Questa risposta
può rappresentare uno dei passi iniziali che porta alla morte cellulare ed è caratterizzata dalla
cessazione dell’attività neuronale, da un improvviso shift negativo nel potenziale extracellulare, da una
severa depolarizzazione dei neuroni e della glia e da una drastica ridistribuzione di ioni ai lati della
membrana. Dopo la riossigenazione la trasmissione sinaptica non si ripristina se la depolarizzazione
ipossica dura più di qualche minuto contribuendo quindi ad un danno cellulare acuto in regioni
particolarmente sensibili all’ipossia come ad esempio la regione CA1 dell’ippocampo (Obeidat and
Andrew, 1998). Quindi il blocco irreversibile della trasmissione sinaptica dopo ipossia acuta è un
importante indice fisiologico del danno.
E’ stato dimostrato che l’ischemia cerebrale è accompagnata da una marcata reazione infiammatoria,
dovuta ad un aumento di espressione delle citokine, di molecole di adesione e di altri mediatori
infiammatori, inclusi i prostanoidi e l’ossido nitrico. Studi preclinici suggeriscono che l’intervento
precoce per attenuare tale infiammazione riduce la progressione del danno cerebrale. In particolare è
stato visto che bloccando l’attività di enzimi legati all’infiammazione, quali ad esempio l’ossido nitrico
sintetasi e la 2-ciclo-ossigenasi, si riduce il danno ischemico con ottime prospettive terapeutiche
(Iadecola and Alexander, 2001).
Nel tessuto nervoso sono stati identificati recettori per le citokine accoppiati ad una stimolazione dei
processi di fosforilazione intracellulare della tiroxina e della serina/treonina, e alcune di queste citokine
hanno un effetto modulatorio sui fenomeni di plasticità sinaptica (Rothwell and Hopkins, 1995). Infatti,
alcune citokine inibiscono l’espressione del potenziamento a lungo termine (LTP) considerato un
correlato elettrofisiologico di apprendimento e memoria, mentre altre lo aumentano.
A questo proposito occorre ricordare che mentre la maggior parte delle citokine determinano
un’azione infiammatoria, è stato dimostrato che l’interleuchina 6 (IL-6) ha al contrario un effetto
protettivo sul tessuto cerebrale (Munos-Fernandez and Fresno, 1998). Infatti, durante lo sviluppo IL-6
promuove l’accrescimento assonale e la differenziazione neuronale in colture, un azione sinergica con
il fattore di accrescimento neuronale (NGF), ma distinta in termini di segnali di trasduzione
intracellulari coinvolti.
Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che IL-6 ha un effetto inibitore sul rilascio di glutammato e
conseguentemente sulla propagazione dell’eccitazione attraverso la corteccia cerebrale, un evento
che suggerisce il ruolo protettivo di IL-6 sulla sopravvivenza neuronale dopo insulto traumatico o
ipossico (D’Arcangelo et al., 2000; Tancredi et al., 2000).
E’ quindi importante continuare ad esplorare l’efficacia delle terapie antiinfiammatorie nel trattamento
del danno postischemico.
In questo studio utilizzeremo un modello animale di anossia durante il parto per studiare il ruolo
giocato dalle citokine nell’induzione, mantenimento e prevenzione del danno post-ischemico
utilizzando il correlato elettrofisiologico di apprendimento e memoria LTP, utile anche per verificare
l’efficienza sinaptica.
PROGETTO DI RICERCA
Gli obiettivi principali del nostro studio sono:
Obiettivo #1: In questa parte del progetto si utilizzeranno ratti tra P0 e P21 sottoposti a danno
anossico/ischemico e si effettueranno registrazioni intra/extracellulari da fettine di ippocampo per
valutare gli effetti delle citokine sulla trasmissione sinaptica e sul potenziamento tetanico a lungo
termine.
In pratica, dopo registrazione di un segnale stabile le fettine verranno perfuse con citokine a diverse
concentrazioni e sottoposte a stimolazione tetanica per valutare l’effetto del trattamento.
Obiettivo #2: In una seconda serie di esperimenti si effettueranno registrazioni elettrofisiologiche da
fettine di ratti sottoposti a danno anossico/ischemico secondo le modalità sotto riportate dove la madre
sia stata pre-trattata in vivo con citokine per valutarne l’eventuale effetto protettivo sul danno postischemico.
Le fettine utilizzate per le registrazioni elettrofisiologiche potranno essere utilizzate in un’ulteriore fase
di questo progetto di ricerca per effettuare studi molecolari e istochimici.
Questo studio ci permetterà di valutare l’importanza dell’intervento tempestivo nei casi di anossia
perinatale e soprattutto studiare i meccanismi cellulari coinvolti nella progressione neuropatologica del
danno post-ischemico per poter intervenire con le terapie adeguate.
METODI
Modello animale di anossia durante il parto: per questo modello si utilizzano ratte gravide al 21°
giorno di gestazione. Dopo decapitazione sotto anestesia con alotano, i feti vengono mantenuti
nell’utero per circa 20 minuti per generare una condizione ipossica. I cuccioli vengono quindi rimossi
attraverso isterectomia, rianimati con una stimolazione toracica se necessario e messi in una gabbia
con una balia per proseguire lo sviluppo postnatale. Gli esperimenti verranno condotti sui cuccioli tra
P0 e P30 per valutare gli effetti dell’ipossia durante lo sviluppo postnatale. Come controllo si
utilizzeranno ratti nati a termine con parto spontaneo.
Registrazioni elettrofisiologiche:
Dopo decapitazione sotto anestesia con alotano, il cervello viene rimosso e posto in un liquido di
composizione simile al liquido cefalorachidiano (ACSF). Successivamente viene tagliato in fettine
orizzontali contenenti l’ippocampo e la corteccia entorinale. Le fettine così ottenute vengono poste in
una camera termostatata, perfuse con ACSF e ossigenate. La composizione dell’ACSF è la seguente
(mM): 124 NaCl, 2 KCl, 1.25 KH2PO4, 2 MgSO4, 2 CaCl2, 26 NaHCO3, 10 glucosio (pH 7.4).
Le registrazioni elettrofisiologiche extracellulari verranno effettuate dallo strato radiato dell’area CA1
utilizzando elettrodi di vetro riempiti con NaCl 2M (resistenza: 5-10M). Le registrazioni intracellulari
verranno effettuate utilizzando microelettrodi di vetro riempiti di K-acetato (2M, resistenza 70-120
M). La stimolazione verrà indotta mediante impulsi elettrici dati attraverso un elettrodo di tungsteno
(10-500 A, 20-90 s, 0.1Hz), posizionato nello strato radiato, a circa 1-2.5mm dall’elettrodo
registrante, per attivare le fibre collaterali di Schaffer. Dopo registrazione di un segnale stabile (20-30
minuti) verrà applicato uno stimolo tetanico (100Hz, 1s) per indurre LTP utilizzando la stessa intensità
di stimolazione del controllo. Le risposte verranno acquisite da un amplificatore, digitalizzate ed inviate
ad un sistema computerizzato di acquisizione ed analisi dati (pClamp9; Axon Instruments). L’analisi
dei dati verrà effettuata utilizzando il software Clampfit (Axon Instruments) e i valori considerati
significativi se p<0.05.
COMPOSIZIONE UNITÀ DI RICERCA
Virginia Tancredi, Professore Associato, Fisiologia
Giovanna D’Arcangelo, Ricercatore Universitario, Fisiologia
Margherita D’Antuono, Assegnista di ricerca, Fisiologia
Roberto Forcina, Laureando Biologia
Francesco Antonelli, Biologo Molecolare e Presidente dell’AIAS di Sgurgola (Frosinone).
Roma 22/11/2005
BIBLIOGRAFIA
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