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Dipartimento Difesa della Natura
Servizio Indicatori e Tossicologia ambientale
Dipartimento per le Attività bibliotecarie, documentali e per l'Informazione
Servizio Promozione della Formazione Ambientale
CORSO DI FORMAZIONE AMBIENTALE
Rilascio deliberato di Organismi Geneticamente Modificati sul
territorio italiano:problematiche ambientali e attività ispettive
Introduzione agli Organismi Geneticamente Modificati
Dott.ssa Valeria Giovannelli
APAT, Dip. Difesa della Natura
Servizio Indicatori e tossicologia ambientale (Settore OGM)
Roma, 5 aprile 2005
Organismi Geneticamente Modificati
Organismo: qualsiasi entità biologica in grado di
riprodursi o di trasferire materiale genetico.
Organismo Geneticamente Modificato(OGM): un
organismo, diverso da un essere umano, il cui
materiale genetico è stato modificato in modo
diverso da quanto avviene in natura con
l’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica
naturale. (Direttiva 2001/18/EC)
Tecniche di modificazione genetica
All. I A, parte1 (direttiva 2001/18/CE)
•
1) tecniche di ricombinazione dell’acido nucleico che
comportano la formazione di nuove combinazioni di materiale
genetico mediante inserimento in un virus , un plasmide
batterico o qualsiasi altro vettore, di molecole di acido
nucleico prodotte con qualsiasi mezzo all’esterno di un
organismo, nonché la loro incorporazione in un organismo
ospite nel quale non compaiono per natura, ma nel quale
possono replicarsi in materia continua;
•2) tecniche che comportano l’introduzione diretta in un
organismo di materiale ereditabile preparato al suo esterno, tra
cui la microiniezione, la macroiniezione e il microincapsulamento;
•3) fusione cellulare ( inclusa la fusione di protoplasti) o
tecniche di ibridazione per la costruzione di cellule vive, che
presentano nuove combinazioni di materiale genetico
ereditabile, mediante la fusione di due o più cellule,
utilizzando metodi non naturali.
Tecniche che non si ritiene producano
modificazioni genetiche
All. I A, parte2 (direttiva 2001/18/CE)
1) Fecondazione in vitro;
2) processi naturali, quali la coniugazione, la trasduzione
e la trasformazione;
3) induzione della poliploidia
Universalità del Codice Genetico
• Tutti gli esseri viventi hanno il proprio GENOMA nel quale
sono contenute tutte le informazioni utili alla vita.
• Il DNA è paragonabile ad un alfabeto di quattro lettere
(GATC) che lette in sequenza compongono delle frasi
chiamate GENI, che codificano per l’espressione degli
elementi essenziali allo svolgimento delle funzioni di un
organismo, le PROTEINE
• Il codice genetico è universale ed i processi essenziali che
regolano la sintesi delle PROTEINE sono comuni a tutti gli
esseri viventi
DNA
(Acido Desossiribonucleico)
- contiene codificate tutte le informazioni necessarie alla vita
e alla riproduzione dell’organismo;
DNA
Trascrizione
”yuh
Fenotipo
Traduzione
Proteina
Proteina
E’ organizzato in sequenze: geni, promotori, terminatori,
etc., che specificano e regolano le funzioni necessarie alla
produzione e all’assemblaggio di una determinata proteina.
Promotore
gene
Terminatore
Il promotore è una sequenza di DNA che controlla
quando e dove il gene deve essere espresso;
Il gene è una sequenza che codifica per una
proteina;
Il terminatore segnala la fine del gene.
Trasferimento genetico:
classico
0
0
X
R
R
Effetti non desiderati nel breeding
tradizionale
• Fenomeno generale
• selezione secondo parametri fenotipici/
agronomici
• screening per composti precisi
(e.g. amido, glicoalcaloidi in patata)
Trasferimento genetico:
moderno
Promotore
0
X
R
Terminatore
transgene
R
A
B
Vettore
LB
Promotore
CaM V-35S
Marcatore di
selezione
batterico
Transgene
RB
Terminatore
Nos-Ter
Marcatore
per la
selezione nelle
piante
A: Isolamento di geni;
B: Trasferimento di geni
oppure
Metodi di trasformazione
- Per introdurre stabilmente in un genoma il gene di
interesse:
1. Metodo dell’Agrobacterium tumefaciens;
2. Utilizzo di virus come vettori;
3. Metodo elettroporetico;
4. Metodo biolistico;
5. Metodo con il Poli Etilen Glicol (PEG).
Inserimento di transgeni in DNA
di origine vegetale
OGM
Effetto
desiderato
Effetto non
desiderato
Connessioni
metaboliche
Non
predicibile
Predicibile
Definizioni
Effetto desiderato
• Tratto target della modifica genetica
Effetto non desiderato
• altro(i) tratto(i) acquisito come risultato della
modifica genetica
• differenza(e) statisticamente significativa tra la
pianta GM ed il genitore (cresciuto nelle stesse
condizioni)
Ragioni per gli effetti non desiderati
• Integrazione casuale dei transgeni
• mutagenesi inserzionale
• distruzione delle funzioni dei geni endogeni
- attivazione / inattivazione di geni
- produzione di nuove proteine
Ÿ cambiamenti in
• enzimi
• metaboliti
• fenotipo
Piante GM
• Raccomandazione:
fornire dati sulle regioni
fiancheggianti il transgene
• dimostrazione dell‘accuratezza della tecnologia
• anticipazione di potenziali effetti non desiderati
Mais 1507 modificato per la resistenza agli
insetti e la toleranza al glufosinato
Notifica: C/NL/00/10
Mais 1507 modificato per la resistenza agli insetti e
la toleranza al glufosinato
Region
Location
1
1-669
2
670-869
870-1681
Size (bp)
%
Identity
Description
N/A1
No known homology
200
90.5
Undescribed maize
genomic sequence
812
89.4
Fragment of maize
huck-1retrotransposon
5’LTR2
86.6
Fragment of maize
huck-1retrotransposon
3’ LTR
669
3
Region
Location
Size
(bp)
%
Identity
4
1682-2016
335
100.0
Fragment of cry1F
gene
5
2017-2337
321
100.0
2338-2354
17
100.0
Fragment of maize
chloroplast rpoC2
gene RNApolymerase
beta-2subunit
Fragment of maize
chloroplast trnI gene
(tRNA-Ile)
Fragment of maize
ubiZM1(2) promoter
6
17
82.4
Description
Region
7
Location
Size (bp)
%
Identity
Description
2358-2376
19
100.0
Fragment of pat gene
8
2381-2498
118
100.0
Fragment of polylinker
region (bases 36-80)
and ubiZM1(2)
promoter
(bases 81-153)
9
2499 -8684
6186
100.0
Full-length insert of
PHI8999A
10
8685-9234
550
100.0
Inverted ORF25PolyA
terminator and
upstream polylinker
sequence
Region
Location
Size
(bp)
% Identity
11
9235-9362
128
100.0
9365-9756
392
99
Fragment of maize
chloroplast genome
13
9757-9944
188
99
Fragment of pat gene
14
994710027
81
100
15
1002810298
271
N/A1
Fragment of maize
chloroplast “ORF241”
hypothetical protein
gene
Not known homology
12
Description
Fragment of maize
chloroplast rps12
rRNA(23S ribosomal
RNA)
Applicazioni delle moderne
biotecnologie
• Campo medico: produzione di vaccini sintetici,
produzione di farmaci, diagnosi di malattie
ereditarie, terapia genica.
• Campo agro-alimentare: produzione di piante
transgeniche resistenti a virus, ad insetti, ad erbicidi,
a condizioni climatiche, con modificate
caratteristiche nutrizionali, produzione di animali
transgenici con aumentate caratteristiche produttive
• Campo ambientale: bonifiche di aree contaminate
Storia delle biotecnologie applicate
alle piante
-1983 Prima pianta transgenica:tabacco resistente ad un
antibiotico;
- 1985 Primo rilascio deliberato a scopo sperimentale in
USA: cotone resistente agli insetti;
- 1994 Prima autorizzazione alla commercializzazione in
USA del primo prodotto di una pianta transgenica:
pomodoro Flavr savr, i frutti rimanevano compatti
anche a maturazione avanzata;
- 1992 Prima richiesta di autorizzazione al rilascio
deliberato a scopo sperimentale in ITALIA di una
pianta transgenica: Mais resistente agli insetti e
all’erbicida glufosinate.
Attualmente
Resistenza a Insetti patogeni: gli organismi bersaglio
sono soprattutto lepidettori. La resistenza é conferita inserendo i geni
cry isolati dal batterio del suolo Bacillus thuringiensis. In natura le
proteine codificate dai geni cry codificano per delle protossine che
nell’ambiente alcalino dell’intestino dell’insetto vengono solubilizzate e
attivate. La proteina attiva si lega a recettori specifici del mesenteron
dell’insetto bersaglio determinandone la morte.
Il gene cry inserito nelle piante transgeniche è stato modificato in
laboratorio per produrre la tossina direttamente nella sua forma attiva.
Resistenza a Funghi: la resistenza è conferita inserendo geni che
inibiscono l’attività di proteine necessarie alla sopravvivenza e
riproduzione del fungo stesso. Ad esempio: nel 2002 sono state
effettuate sperimentazioni con piante di riso transgeniche resistenti a
patogeni fungini grazie all’inserimento del gene b32 codificante per una
proteina che inattiva l’attività ribosomiale del patogeno.
Tolleranza al glufosinato: E’ conferita dall’inserimento del
gene bar isolato da Streptomyces hygroscopicus o pat
isolato S. viridochromogenes.
L’enzima PAT(fosfinotricina acetil transferasi) catalizza
l’acetilazione della fosfonotricina, principio attivo del
glufosinato, eliminandone l’attività erbicida.
Tolleranza al glifosato E’ conferita dall’inserimento del
gene epsps isolato da Agrobacterium sp ceppo CP4. Il gene
epsps è presente nelle piante all’interno del cloroplasto e
codifica per l’enzima 5-enol-piruvil-scichimato-3 fosfato
sintetasi coinvolto nella sintesi degli aminoacidi aromatici
ed è sensibile all’azione del principio attivo dell’erbicida
glifosato che uccide le piante inibendo l’attività dell’enzima.
Resistenza a Virus: Viene sfruttato il fenomeno di
“Resistenza Derivata dal Patogeno”. Piante transgeniche
che esprimono uno o più geni di un determinato virus
acquisiscono resistenza a quel virus.
Controllo dell’impollinazione: il sistema è formato da una
linea femminile, una maschile e l’ibrido risultante.
La linea femminile (Ms) porta il gene barnase (isolato
da B. amyloliquefaciens) codificante per una ribonucleasi, la
cui espressione è tessuto specifica (per il tegumento delle
antere) e limitata nel periodo di sviluppo delle antere.
Questa linea non è in grado di pordurre polline vitale.
La linea maschile (Rf) porta il gene barstar (isolato
da B. amyloliquefaciens) che codifica per un inibitore della
barnase con la medesima espressione del gene barnase che
porta alla ristorazione della fertilità nell’ibrido Ms x Rf