Nuovi metodi molecolari per l`identificazione dei batteri basati sul

GIMMOC Vol.V No 1, 2001
Nuovi metodi molecolari per l’identificazione
dei batteri basati sul DNA ribosomico: amplified rrn
RFLP e sequenziamento a confronto
New ribosomal DNA based molecular methods
for bacterial identification: amplified rrn RFLP
vs sequencing
I procarioti hanno iniziato la loro evoluzione 3,8 miliardi di anni fa ed hanno continuato ad evolversi sino ad occupare
ogni nicchia ecologica sul nostro pianeta,
dai ghiacci polari alle profondità oceaniche. Le circa 2500 specie batteriche comprese nelle Approved Lists of Bacterial
Names [Skerman et al., 1989] non riflettono la reale varietà di batteri nell’ambiente,
ed ogni tentativo di stimarne la reale consistenza sarebbe presuntuoso. È ragionevole, quindi, affermare che la maggior
parte delle specie è oggi ancora sconosciuta. I procarioti attualmente conosciuti
rappresentano in realtà quella piccola frazione delle comunità microbiche che hanno storicamente attirato l’attenzione dell’uomo in quanto coinvolte nella patologia umana o animale o perché in qualche
modo rientrano nella sfera di interesse
dell’uomo. Fino a tempi recenti, inoltre, le
nostre conoscenze sulla diversità microbica erano limitate ai germi coltivabili nei
comuni terreni batteriologici. In questi ultimi anni, i progressi nelle tecniche mediche e chirurgiche sono stati accompagnati da un corrispondente incremento delle
patologie sostenute da germi opportunisti
con habitat ambientale, da qui la necessità
anche per il microbiologo clinico di identificare microrganismi che in passato non
erano di suo interesse.
Classicamente, la distinzione di generi e
specie è stata effettuata in base a caratteri
fenotipici e schemi di identificazione basati su di essi sono ancora oggi utilizzati nel-
1
Organo ufficiale della
S.I.M.M.O.C.
Copyright © 2001
la maggior parte dei laboratori. Questi test G.M. Giammanco1
hanno però il grave limite di non essere
applicabili indifferentemente a qualunque *Autore di riferimento:
F. Genovese
specie batterica e vanno selezionati di volta in volta in base all’orientamento diagnostico. Inoltre, alcuni gruppi batterici esprimono assai pochi dei caratteri fenotipici
normalmente utilizzati a scopo identificativo e sono quindi difficili da differenziare.
Infine, non è possibile studiare il fenotipo
di batteri non coltivabili.
Più recentemente, tecniche chemotassonomiche, basate su diversi metodi analitici volti a raccogliere informazioni sui
costituenti chimici della cellula batterica,
acidi grassi, proteine, polisaccaridi, hanno
rappresentato una alternativa alla fenotipizzazione classica dei batteri al fine di ottenerne una corretta identificazione. Esse
però sono spesso laboriose, necessitano
della coltivazione del germe per ottenere
grosse quantità di materiale da sottoporre
all’analisi e sono utili solo per alcuni gruppi batterici.
I progressi fatti nel campo della biologia
molecolare hanno messo a disposizione
un certo numero di tecniche (clonaggio,
PCR, sonde di DNA, etc.) che prescindono dalla coltivabilità del germe e che si
sono rivelate capaci di dare una visione
unitaria della genealogia delle diverse
specie batteriche, mediante l’utilizzo di
molecole semantiche per gli studi filogenetici. È oggi universalmente accettato
che l’RNA ribosomico (rRNA) ed i suoi geni (rDNA), sono delle molecole in grado
di essere utilizzate come cronometro molecolare [Weisburg et al., 1991; Woese,
Dipartimento di Igiene e Microbiologia, Università degli Studi di Palermo.
MINIRASSEGNA/MINIREVIEW
INTRODUZIONE
Giornale Italiano di
Microbiologia Medica
Odontoiatrica e Clinica
Vol. V, No 1, 2001
p. 53 - 62
53
GIMMOC Vol.V No 1, 2001
Giammanco
Figura 1
Allineamenti di sequenze del gene rrs con evidenziata nel riquadro un frammento di sequenza altamente
conservato in Staphylococcus aureus.
Figura 2
Albero filogenetico prodotto dall’allineamento di sequenze di rDNA 16S. Nel riquadro un raggruppamento
di ceppi di Staphylococcus aureus.
MINIRASSEGNA/MINIREVIEW
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1987]. L’rDNA contiene regioni altamente
conservate a causa dei suoi obblighi strutturali e funzionali ma anche sequenze variabili. Ciò ha permesso di utilizzarlo a fini tassonomici, per la definizione su base
genetica di generi e specie, a fini diagnostici, per il sicuro riconoscimento anche di
batteri di difficile diagnosi o di ceppi con
caratteristiche fenotipiche aberranti, e a fini epidemiologici, come strumento per
caratterizzare e differenziare ceppi appartenenti alla stessa specie.
Il metodo più diretto per determinare le
relazioni filogenetiche fra gli organismi è
rappresentato dal confronto delle sequenze primarie dell’rRNA o rDNA (Figura 1)
ottenute mediante sequenziamento [Lane,
1991]. Più di 4000 sequenze di rRNA della
piccola subunità (SSU) ribosomica e più
di 400 della grande subunità (LSU) sono
state finora depositate nella banca dati del
Ribosomal Database Project (RDP) [Maidak et al., 1999]. Questo gran numero di
sequenze consente la costruzione di alberi filogenetici in cui andare a posizionare
una sequenza ignota in modo tale da
giungere ad una sua identificazione per
approssimazione. Un esempio relativo al
genere Staphylococcus viene mostrato
nella Figura 2: il dendrogramma calcolato
in base alla distanza genetica fra le sequenze dei ceppi in esame permette di
correlare facilmente i 5 ceppi clinici di S.
aureus con il ceppo tipo.
Usando questo approccio è stato possibile dimostrare che nel mondo degli organismi viventi esistono tre domini: Archea,
Bacteria ed Eucarya [Woese et al., 1990] e
che all’interno del dominio Bacteria è possibile individuare diverse linee di discendenza maggiori (Tabella I). La sistematica
batterica in passato è stata basata fonda-
Nuovi metodi
molecolari per
l’identificazione
dei batteri basati sul
DNA ribosomico:
amplified rrn RFLP e
sequenziamento
a confronto
New ribosomal DNA
based molecular
methods for bacterial
identification:
amplified rrn RFLP
vs sequencing
Branch
Subbranch
Taxa rappresentativi
Proteobacteria
a-subclass
Agrobacterium/Rhizobium/Sphingomonas
b-subclass
Alcaligenes/Neisseria/Comamonas
g-subclass
Pseudomonas/Enterobacteriaceae
d-subclass
Bdellovibrio/Desulfovibrio
e-subclass
Helicobacter/Campylobacter
Flavobacterium/Cytophaga/
Bacteroides-branch
Gram-positivi
Bacteroides/Cytophaga/Sphingobacterium/
Flexibacter
Bacillus/Clostridium
Bacillus/Clostridium/Mycoplasma/Listeria
Actinomycetes
Corynebacterium/Mycobacterium/Nocardia
Gram-positivi con parete
cellulare anomala
Veillonella/Heliobacterium/Selenomonas
Cyanobacteria/
chloroplast-branch
Spirochaetales
Cyanobacteria/cloroplasti
Spirochaetaceae/
Leptospiraceae
Borrelia/Spirochaeta/Treponema/
Leptospira/Leptonema
Chlorobiaceae-branch
Chlorobium
Planctomyces-branch
Planctomyces/Pirellula/Gemmata
Thermus/Deinococcus-branch
Thermus/Deinococcus
Chloroflexus/
Thermomicrobium-branch
Chloroflexus/Thermomicrobium
Verrucomicrobium-branch
Verrucomicrobium
Propiogenium-branch
Propiogenium
Thermotoga-branch
Thermotoga/Fervidobacterium
Aquifer/
Hydrogenobacter-branch
Aquifer/Hydrogenobacter
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Tabella I
Linee maggiori di discendenza all’interno del dominio Bacteria (adattato da Busse et al., 1996).
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Giammanco
Tabella II
Confronto delle apparecchiature e reagenti necessari e dei costi stimati per l’acquisto delle apparecchiature e
per ogni singola reazione utilizzando il metodo RFLP e il DNA-sequencing (adattato da Olive & Bean, 1999).
RFLP
DNA sequencing
Apparecchiature
• Thermocycler
• Gel box
• Alimentatore
• Sistema fotografico
• Thermocycler
• DNA sequencer
• Computer
• Software di analisi
Materiali
• Reagenti per PCR
• Primers
• Enzimi di restrizione
• Kit PCR sequenziamento
Costi stimati
RFLP
DNA-sequencing
$ 8.000 – 10.000
$ 45.000 – 130.000
Materiali di consumo/reazione
$5
$ 20
Lavoro/reazione
$9
$ 20
Totale/reazione
$ 14
$ 40
Apparecchiature
MINIRASSEGNA/MINIREVIEW
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mentalmente su caratteri fenotipici biochimici e morfologici. Attualmente, i nuovi
ordinamenti filogenetici, basati sullo studio dell’rRNA, hanno spesso contraddetto i
classici schemi tassonomici ed hanno permesso di classificare nuove specie batteriche, facendo sì che esse potessero essere
incluse nel genere e nella famiglia di appartenenza [Yabuuchi et al., 1990; Busse et
al., 1992; Denner et al., 1994].
Per quanto ora detto, il sequenziamento
dell’rDNA sembrerebbe la migliore strategia da seguire per l’identificazione molecolare di ceppi sconosciuti. Uno dei principali inconvenienti di questo approccio è,
però, rappresentato dalla complessità della determinazione delle sequenze e degli
allineamenti che, benché largamente automatizzato, permette di analizzare limitate
quantità di ceppi clinici, richiede personale tecnico qualificato e costose apparecchiature non alla portata di tutti i laboratori. Inoltre, l’assenza di criteri di selezione
per il deposito di sequenze nell’RDP determina inconvenienti legati alla scarsa affidabilità di alcune delle sequenze presenti nella banca.
Una via alternativa per sfruttare l’informazione filogenetica presente nelle molecole di rDNA è rappresentata dall’analisi
con enzimi di restrizione del gene amplificato mediante Polymerase Chain Reaction (PCR). Questo metodo, chiamato
RFLP (Restriction Fragments Length Poly-
morphism), permette di calcolare velocemente ed in maniera semplice la diversità
genetica fra i ceppi in base al numero di
frammenti di DNA condivisi. L’analisi genetica può essere effettuata su regioni codificanti molto più lunghe di quelle che
possono essere agevolmente sequenziate
ed in questa analisi verranno in gran parte
ignorate le variazioni minori del codice
genetico. Esso risulta particolarmente adatto per lo studio di gruppi cospicui di
stipiti, in quanto la complessità del metodo è ridotta dal punto di vista tecnico.
Inoltre, le apparecchiature necessarie sono alla portata della maggior parte dei laboratori e il costo di una identificazione
effettuata con questo metodo risulta nettamente inferiore rispetto al sequenziamento [Olive & Bean, 1999] (Tabella II).
Negli ultimi dieci anni lo studio dei profili elettroforetici ottenuti dopo digestione
con endonucleasi della sequenza dell’rDNA 16S (rrs) amplificata mediante PCR
(16S - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) è stato utilizzato
ampiamente e con successo per l’identificazione di molti microrganismi e per studi
filogenetici e di ecologia microbica. Uno
o più enzimi di restrizione in combinazione sono stati usati nei diversi studi e si è
fatto sempre più ampio ricorso alla analisi
computerizzata dei profili di restrizione.
Ma l’analisi dell’rrs, a causa delle piccole
dimensioni del frammento amplificato
GIMMOC Vol.V No 1, 2001
Denominazione allele
Lunghezza spacer
rrnA
437
rrnB
441
rrnC
355
rrnD
437
rrnE
355
rrnG
431
rrnH
447
(~1500 paia di basi (pb)), ha un potere di
risoluzione troppo basso per essere applicata a specie batteriche molto vicine come
è stato rilevato dal confronto di sequenze
complete del 16S di specie appartenenti ai
generi Bacillus [Fox et al., 1992] ed Aeromonas [Martinez-Murcia et al., 1992]. Il gene che codifica per l’RNA ribosomico 23S
(rrl) è più grande (~3000 pb) e presenta
per questo un potere di risoluzione maggiore rispetto all’rrs [Olsen & Woese,
1993]. La regione spaziatrice intergenica
fra rrs ed rrl (16S-23S Intergenic Spacer
Region (IGS)) ha un tasso di mutazione
molto più elevato rispetto ad rrs ed rrl
[Gurtler & Stanisich, 1996]. La sua lunghezza varia notevolmente a seconda della
specie, da 60 pb (Thermoproteus tenax) fino a 1500 (Bartonella elizabethae), e varia
persino, sebbene in misura più ridotta, fra
le diverse copie dell’operone rrn che possono essere presenti nello stesso genoma
batterico (da una sola copia in Mycobacterium tuberculosis [Bercovier et al., 1986] e
Mycoplasma pneumoniae [Amikam et al.,
1984] a 10 copie in Bacillus subtilis [Loughney et al., 1982]). Anche le sette copie o
alleli rrn presenti in Escherichia coli hanno regioni 16S-23S IGS di diversa lunghezza e sequenza [Young et al., 1979; Brosius
et al., 1981; Harvey et al., 1988] (Tabella
III). Grazie all’elevata variabilità di questa
regione, l’analisi dei prodotti di amplificazione della 16S-23S IGS (PCR-ribotyping)
si è dimostrata in grado di differenziare
ceppi appartenenti alla stessa specie [Jensen et al., 1993; Kostman et al., 1995]. Applicando l’analisi di restrizione ad un uni-
co frammento amplificato comprendente
rrs, 16S-23S IGS, ed rrl si possono ottenere contemporaneamente informazioni
sia dalle regioni più conservate (identificazione al livello di specie) sia da quelle
con maggiore tasso di mutazione (tipizzazione intraspecie). Questo approccio si è
dimostrato efficace nell’identificazione di
Comamonadaceae [Vaneechoutte et al.,
1992], Francisella spp. [Ibrahim et al., 1996]
and Acinetobacter spp. [Ibrahim et al.,
1996; Garcìa-Arata et al., 1997; Dijkshoorn
et al., 1998].
Un metodo standardizzato di identificazione su base genetica e di genotipizzazione basato sull’analisi mediante enzimi di
restrizione dei prodotti di amplificazione
(PCR) dell’intero operone che codifica per
l’rRNA (rrn), comprendente il gene rrs, il
gene rrl e la regione intergenica 16S-23S
IGS, è stato recentemente messo a punto e
denominato amplified rrn RFLP [Giammanco et al., in preparazione].
Il metodo amplified rrn RFLP.
La genotipizzazione tramite amplified
rrn RFLP è un metodo universale utilizzabile per l’identificazione di qualsiasi batterio. Infatti, gli stessi primer possono essere
utilizzati per amplificare l’operone rrn sia
per i batteri Gram-positivi sia per quelli
Gram-negativi, aerobi obbligati, anaerobi
facoltativi, anaerobi obbligati. Trattandosi
di un metodo molecolare, esso fornisce risultati affidabili anche nel caso di ceppi
con caratteri fenotipici anomali che ne impediscono l’identificazione con le metodiche tradizionali.
Nuovi metodi
molecolari per
l’identificazione
dei batteri basati sul
DNA ribosomico:
amplified rrn RFLP e
sequenziamento
a confronto
New ribosomal DNA
based molecular
methods for bacterial
identification:
amplified rrn RFLP
vs sequencing
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Tabella III
Variabilità nella lunghezza della regione spacer IGS dei 7 alleli rrn di Escherichia coli [Young et al., 1979;
Brosius et al., 1981; Harvey et al., 1988].
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Giammanco
Figura 3
Struttura dell’operone rrn in Escherichia coli e posizione dei primer rrn RFLP (Ad ed O24/3).
Figura 4
Profili di restrizione calcolati in silico per ognuno dei sette operoni rrn e profilo in silico risultante dalla
somma dei sette operoni (virtuale) paragonato al risultato sperimentale (sperimentale).
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58
La procedura, dopo una tappa iniziale di
estrazione del DNA batterico, prevede
l’amplificazione mediante PCR dell’operone rrn usando due primer universali situati rispettivamente all’estremità iniziale 5’
del gene rrs e vicino all’estremità terminale 3’ del gene rrl (Figura 3), in regioni altamente conservate. Si ottiene così un unico
frammento amplificato sul quale si potrà
operare l’analisi di restrizione.
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menti) mediante i moduli RestrictoScan e
RestrictoTyper del programma Taxotron
(Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France).
L’accuratezza del metodo è stata dimostrata mediante il confronto dei profili
sperimentali con i rispettivi profili in silico la cui corrispondenza è stata perfetta
(Figura 4).
Mediante lo stesso approccio comparativo è stato addirittura possibile valutare
l’importanza di alcuni parametri inerenti
le caratteristiche delle endonucleasi e le
condizioni di migrazione elettroforetica
nel determinare la comparsa di artefatti.
In particolare, è stata dimostrata la necessità di inattivare termicamente l’endonucleasi Mbo II prima di procedere alla migrazione elettroforetica dei prodotti di restrizione [Giammanco et al., 1999]. Se
non inattivato, questo enzima, come tutte
le endonucleasi della classe II-S, rimane
legato al frammento di DNA clivato e ne
altera così il peso molecolare determi-
Nuovi metodi
molecolari per
l’identificazione
dei batteri basati sul
DNA ribosomico:
amplified rrn RFLP e
sequenziamento
a confronto
New ribosomal DNA
based molecular
methods for bacterial
identification:
amplified rrn RFLP
vs sequencing
Figura 5
Profili di restrizione sperimentali del ceppo Escherichia coli K-12 MG1655 ottenuti con Hha I (H) ed
Mbo II (M). A, P, N: standard di pesi molecolari.
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La scelta delle endonucleasi di restrizione per la digestione enzimatica dei prodotti di amplificazione dell’operone rrn è
fondamentale nel determinare la sensibilità dell’analisi stessa, giacché endonucleasi che tagliano poche volte la sequenza amplificata daranno luogo a pochi
frammenti di restrizione e ciò implicherà
una minore variabilità nei profili. Questa
scelta può essere profiquamente indirizzata dall’analisi della sequenza dell’operone rrn in un ceppo di riferimento appartenente al genere o alla specie che si
intende studiare. Recentemente il ceppo
di Escherichia coli K-12 MG1655 è stato
interamente sequenziato [Blattner et al.,
1997] e la sua sequenza completa è disponibile nella banca dati EMBL (accession no. U00096). I frammenti della sequenza corrispondenti ai tratti amplificabili nelle sette copie dell’operone rrn (da
A ad E, G ed H) sono stati da noi utilizzati per selezionare le endonucleasi più interessanti. Su ognuna delle sette sequenze sono state effettuate delle restrizioni
virtuali (in silico) con il software Geneman (DNAStar, Inc., Madison, WI). Nell’ambito di una serie di enzimi di restrizione, sono state selezionate le endonucleasi Hha I e Mbo II poiché le loro sequenze di attacco si presentavano con
una appropriata frequenza nella sequenza amplificabile. Combinando tutti i frammenti di restrizione virtuali ottenuti dai
sette operoni, è stato quindi ottenuto un
profilo di restrizione in silico per ognuno
dei due enzimi (Figura 4).
I profili calcolati in silico con i due enzimi suddetti sono stati utilizzati per convalidare i risultati sperimentali. Il ceppo
di E. coli K-12 la cui sequenza era stata
utilizzata per produrre i profili in silico,
è stato sottoposto ad analisi sperimentale mediante amplified rrn RFLP utilizzando le due endonucleasi, Hha I e Mbo
II, selezionate in silico. I prodotti di restrizione sono stati sottoposti a separazione elettroforetica in gel di agarosio. I
frammenti di restrizione così separati sono stati colorati con bromuro di etidio e
visualizzati su transilluminatore UV.
L’immagine (Figura 5) catturata tramite
videocamera è stata analizzata (numero
di bande e peso molecolare dei fram-
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Giammanco
Figura 6
L’inattivazione dell’enzima Mbo II impedisce la formazione di artefatti. L: standard di pesi molecolari;
A: enzima inattivato; B: bassa concentrazione di
enzima attivo; C: alta concentrazione di enzima
attivo. Frecce: artefatti.
nando la comparsa di alcune bande come
conseguenza di artefatti e la scomparsa di
altre (Figura 6).
Il programma Taxotron è stato utilizzato per analizzare i profili di restrizione
sperimentali e per calcolare la taglia dei
frammenti di restrizione di una serie di
ceppi di collezione appartenenti a diverse
famiglie e generi batterici ed è stata verificata la possibilità di identificarli a livello
di specie [Giammanco et al., 1998]. Particolare interesse è stato rivolto alla famiglia delle Enterobacteriaceae [Giammanco et al., 1998b], al genere Acinetobacter
ed agli Streptococchi [Schlegel et al.,
1999]. Nel caso del genere Acinetobacter,
è stato possibile differenziare chiaramente le quattro genospecie, A. calcoaceticus, A. baumannii, A. specie 3, e DNAgruppo 13, che compongono il cosiddetto calcoaceticus-baumannii complex
(Figura 7) così denominato proprio per la
difficoltà nel distinguere le specie che lo
compongono in base ai soli caratteri fenotipici. Negli enterobatteri è stato possibile individuare profili tipici per ogni
specie, anche nell’ambito di quei generi
Figura 7
Profili di restrizione ottenuti con l’enzima di restrizione Mbo II da ceppi di riferimento appartenenti alle 4
genospecie all’interno di Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex.
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GIMMOC Vol.V No 1, 2001
Figura 8
Dendrogramma di ceppi di riferimento appartenenti alle 11 specie genomiche del genere Citrobacter prodotto dal confronto dei profili ottenuti con 3 enzimi di restrizione (HhaI, Sau3A I, ed Mbo II).
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molecolari per
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dei batteri basati sul
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amplified rrn RFLP e
sequenziamento
a confronto
in cui le differenze fenotipiche sono ridotte, come nel caso del genere Citrobacter
(Figura 8).
Tutti i profili ottenuti sono stati integrati
in una banca dati per permettere l’identificazione di ceppi selvaggi. In questo modo, l’identificazione di un ceppo isolato da
materiale clinico può essere ottenuta per
confronto con un archivio di immagini relative alle varie specie batteriche, in gran
parte già costituito.
CONCLUSIONI
L’amplified rrn RFLP è una metodica
semplice e veloce che si è dimostrata in
grado di distinguere specie geneticamente molto vicine come le genospecie
appartenenti ai generi Acinetobacter e
Citrobacter. Le apparecchiature necessarie per l’amplified rrn RFLP sono presenti nella maggior parte dei laboratori che si
occupano di biologia molecolare, mentre
il costo degli apparecchi di sequenziamento è ancora elevato. Inoltre, nell’amplified rrn RFLP il costo di ogni singola
reazione, in termini di materiali di con-
sumo e di costo della manodopera, è inferiore di due terzi rispetto al sequenziamento. Diversi software per l’analisi di
immagini di profili di restrizione sono oggi disponibili sul mercato. Fra i più diffusi vi sono: BioGene (Vilber-Lourmat,
Marne-la-Vallèe, France), GelCompar
(Applied Maths, Kourtrai, Belgium) e
Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France). Il programma Taxotron, originariamente sviluppato per la ribotipizzazione, permette di acquisire i profili di
restrizione in maniera semi-automatica e
di confrontarli con i profili precedentemente memorizzati, consentendo di ottenere una identificazione del profilo in
esame in tempi ridottissimi. L’amplified
rrn RFLP dimostra di poter essere standardizzato e può permettere quindi lo
scambio di dati fra diversi laboratori e la
creazione di banche dati inter-laboratorio per il confronto dei profili di restrizione. In attesa, quindi, di una diminuizione
dei costi relativi al sequenziamento, l’utilizzo della metodica amplified rrn RFLP
può essere suggerito in tutti quei casi in
cui si ritenga necessario ricorrere alla
analisi dell’RNA ribosomico per identifi-
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methods for bacterial
identification:
amplified rrn RFLP
vs sequencing
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Giammanco
care un ceppo batterico sconosciuto. La
capacità dell’amplified rrn RFLP di tipizzare i ceppi batterici permettendo di caratterizzare stipiti appartenenti alla stessa
specie è ancora in corso di valutazione e
dipende certamente dalla scelta degli enzimi di restrizione. È però possibile che
l’informazione genetica derivante dallo
studio dei siti di restrizione all’interno
dell’operone rrn sia insufficiente per
questo tipo di analisi per la quale il sequenziamento potrebbe essere un approccio più efficace.
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