06 BIOTEC GenMol 10_11 metab

I geni del metabolismo
Lezione 6
By NA
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Premessa I
Quello che interessa e’ individuare i geni che controllano le
vie metaboliche. Per arrivare a questo risultato si possono
usare diverse strategie (non tecniche: quelle sono sempre le
stesse che vengono scelte dopo aver deciso le strategie) che
dipendono dalle informazioni che si hanno a disposizione.
Quindi di volta in volta possono cambiare. Esistono pero’ dei
punti fermi sempre validi non necessariamente in questo
ordine:
 devono esistere fenotipi alternativi che permettano di
suddividere la popolazione in almeno 2 gruppi per poter capire
le modalita’ di trasmissione, definire il numero dei locus
 bisogna raccogliere informazioni il piu’ dettagliate possibili
sulla funzione per avvicinarsi il piu’ possibile al prodotto primario
del gene
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Premessa II
E pertanto dato che per capire come si svolge una funzione e
quale sequenza di DNA la controlla bisogna vedere cosa
succede se la funzione viene meno e nell’uomo in cui non si
puo’ fare l’uomo knock out si ricorre alle patologie.
Infatti posso sapere come viene sintetizzato un certo
composto, in quale tessuto, in quale tipo cellulare, ma
dato che le vie metaboliche non sono lineari e i fattori
che intervengono per ottenere il prodotto finale sono
molteplici risalire al gene puo’ essere molto complicato
Quindi le patologie di cui parleremo sono i nostri mutanti
knockout che ci servono per trovare il gene normale.
L’albinismo oculocutaneo e’ solo un modello per
spiegare una strategia per lo studio a partire da processi
in parte noti controllati da geni la cui manifestazione si
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trasmette come carattere recessivo
3
Autosomica recessiva
Entrambi i sessi presentano
il fenotipo
Aumentata incidenza
della consanguineita’
aa
I genitori sono eterozigoti
Aw/m
 Gli individui che presentano il
fenotipo di solito sono figli di
soggetti che non presentano il
fenotipo
?
Aa
?
A?
A-
 individui con un fratello o sorella con il
carattere hanno 2/3 di probabilita’ di essere
portatori dell’allele mutato.
A-
Aa
Aa Aa
Aa
Aa
aa
aa
aa
?
?
A- A-
?
aa aa A-
aa
Ciascun figlio successivo a quello che
presenta il carattere ha il 25% di
probabilita’ di mostrarlo (I legge di Mendel)
questa e’ la conclusione a cui si arriva studiando tutte le famiglie in cui sia presente
un affetto, quando inizio a studiare non so quale sia la trasmissione. Dall’analisi degli
incroci ricavo che il fenotipo si tramette con alcune caratteristiche che lo fanno
classificare come autosomico recessivo, quindi l’affetto e’ omozigote m/m
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La storia
Nel 1908 Sir Archibald Garrod noto’ che alcune malattie ricorrevano
nelle famiglie. Le nozioni di biochimica erano ancora limitate e si ignoravano
del tutto le relazioni biochimiche con l’eredita’. Tuttavia egli ipotizzo’ che
la malattia fosse legata ad un blocco ereditario di un percorso biochimico
essenziale. Egli descrisse due difetti del metabolismo della tirosina :
albinismo e alcaptonuria.Descrisse inoltre la cistinuria e la pentosuria
Egli parti’ dall’osservazione che alcuni soggetti con artrite degenerativa
presentavano urine che scurivano se esposte all’aria, palato pigmentato…
Egli noto’ anche che se a questi pazienti veniva somministrato acido
omogentisinico, questo veniva escreto in grosse quantita’ nelle urine. La
stessa escrezione aumentata sia ritrovava se i pazienti avevano una
dieta ricca di proteine e soprattutto se nella dieta c’erano tirosina e
fenilalanina, cosa che non si verifica in persone normali
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La storia II
Garrod interpreto’ queste osservazioni ipotizzando che l’acido omogentisinico fosse
un normale prodotto del metabolismo della fenilalanina e della tirosina, che
normalmente non viene escreto perche’ trasformato in altri metaboliti. Negli
alcaptonurici questa trasformazione non puo’ aver luogo e percio’ viene accumulato in
alcuni tessuti ed escreto nelle urine.
Egli espresse il concetto di via metabolica come insieme di passaggi mediati da
enzimi (Garrod AE: The Croonian lectures on inborn errors of metabolism.Lancet
2 :1-7;73-79;142-148;214-220,1908 ):
“Il concetto di metabolismo come un blocco sta cedendo il passo alla
visione di metabolismo come comparti. L’idea che sta emergendo e’ che
ci sono passaggi (step) successivi nel costruire e nel distruggere……
particolari molecole proteiche e zuccheri ad opera di fermenti speciali
che vengono utilizzati per scopi definiti”
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La storia III
Garrod sottolineo’ inoltre la presenza della familiarita’ (Cfr. Lancet…):
“Queste anormalita’ si verificano in piu’ fratelli e sorelle i cui genitori
non manifestano nessun tipo di anomalia. Inoltre la trasmissione diretta
da genitore a figli e’ estremamente rara”
In 8 delle 17 famiglie da lui studiate i genitori erano cugini primi: Bateson
(biologo inglese che conio’ il termine genetica) a cui Garrod si rivolse per sapere
se questa informazione potesse avere rilevanza, interpreto’ il dato alla luce
delle neo riscoperte leggi di Mendel. Egli comprese che il matrimonio fra cugini
primi crea le condizioni per rendere piu’ probabile la comparsa di caratteri
recessivi rari.
La conseguenza di queste osservazioni era che l’allele normale fosse in qualche
modo necessario per la produzione di uno specifico enzima.
 Era il primo indizio che i geni codificano per gli enzimi
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La storia IV
Garrod intui’ il concetto di individualita’ biochimica e genetica (Cfr. Lancet…):
“L’esistenza dell’individualita’ chimica segue necessariamente dalla
specificita’ chimica. Anche quelle incompatibilita’ nei confronti di medicine
ed alimenti che sono riportate nel detto che dice che il cibo di un uomo
puo’ essere il veleno di un altro, hanno presumibilmente una base chimica (e
genetica)”.
Garrod fu quindi un profeta anche della farmacogenetica e intui’ il
concetto di suscettibilita’ genetica come background su cui agiscono gli
agenti esogeni. Come tutti i profeti non fu molto seguito all’epoca: le sue
intuizioni erano troppo innovative per i sui tempi. Bisogno’ aspettere quasi
40 anni (una generazione!) perche’ le sue idee trovassero conferma.
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La storia V
Negli anni ‘40 grazie agli sperimenti di Beadle e Tatum su Neurospora si
dimostro’ che i singoli step metabolici sono controllati da singoli enzimi e
singole mutazioni alterano singole funzioni.
 Venne formulata l’ipotesi “un gene, un enzima” che
prevede che per ogni proteina enzimatica esista un locus e
che i percorsi metabolici siano una catena reazioni dovute
all’azione di piu’ enzimi.
Beadle e Tatum non partirono dalle osservazioni di Garrod quando fecero i loro
esperimenti, dal momento che all’epoca ignoravano le sue osservazioni,ma nel
1958 quando ricevettero il Nobel, Beadle nel suo discorso di accettazione
riconobbe il contributo di Garrod:“ Noi abbiamo dimostrato cio’
che Garrod aveva visto chiaramente parecchi anni prima. Venimmo a
conoscenza del suo lavoro e fummo consapevoli che avevamo aggiunto
poco o niente alla teoria”.
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Difetti congeniti del metabolismo I
I difetti congeniti del metabolismo sono ereditati
con modalita’ recessiva.
Perche?
Una via metabolica e’ un percorso complesso articolato in piu’
reazioni catalizzate da enzimi. Gli enzimi sono molecole
proteiche in grado di espletare la loro funzione in piccole
quantita’ e non si consumano nel corso della reazione. Di solito
le quantita’ sintetizzate di enzima sono in eccesso rispetto alle
necessita’ della reazione.
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Un gene- un enzima
La teoria di Beadle e Tatum prevede che l’assenza di un enzima porti oltre
che al blocco del percorso metabolico,anche l’accumulo delle sostanze a
monte del blocco e la mancanza dei prodotti a valle
Geni funzionanti
substrato
Un gene mutato*
substrato
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gene B
gene A
enzima
a
A
B
enzima
A
b
C
gene B
gene A
a
enzima
gene C
B
enzima
b
enzima
c
gene c*
C
accumulo di A,B,C
gene D
D
enzima
d
gene D
D
enzima
d
assenza di D ed E
prodotto
finale
E
prodotto
finale
E
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pero’ la situazione e’ piu’ complessa
l’assenza di un prodotto non e’ legata solo
alla mancanza dell’enzima: possono mancare
tutte quelle molecole che concorrono alla
buona riuscita di una reazione: cofattori,
ligandi per il trasporto attraverso le
membrane, fattori di trascrizione, .......
quindi oggi noi sappiamo che non basta verificare
l’assenza o l’accumulo di un prodotto per correrarla con
l’assenza dell’enzima quello che possiamo dire e’ che quella
via metabolica e’ alterata
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Messaggio
Un difetto genetico del metabolismo non e’ originato
solo da alterazioni del gene codificante l’enzima
coinvolto nella singola reazione, ma puo’ essere
originato dalla mutazione del gene del coenzima, dalla
mancata produzione dei carrier di specifiche molecole
(malattie lisosomiali)(cfr testo)
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LOCUS A
Genotipo
Enzima
Perche’ recessivi
Substrato +
enzima
prodotto +
enzima
AA
Aa
aa
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Da dove si incomincia? I
L’albinismo oculocutaneo e’ solo un modello per spiegare una strategia
per lo studio a partire da processi in parte noti controllati da geni la
cui manifestazione si trasmette come carattere recessivo
Il colore della pelle e’ un carattere legato all’espressione di svariati
geni, ma se utilizziamoil criterio (ricordate che la scelta del
criterio e’ arbitraria ed e’ decisa dall’operatore): assenza di
qualsiasi colore cioe’ pelle chiarissima, capelli chiari, iridi
depigmentate, sensibilita’ alla luce …in poche parole assenza di
melanina, vediamo che questa caratteristica fenotipica e’ presente
in tutti gli organismi che hanno una qualche pigmentazione. Ci sono
individui depigmentati in tutte le specie animali e in tutte le
popolazioni umane, quale che sia il loro colore piu’ diffuso.
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Da dove si incomincia? II
Possiamo percio’ suddividere la popolazione in due gruppi: pigmentati e
non. Se sto studiando i topi o altri organismi a riproduzione rapida e che
posso incrociare, programmo gli incroci appropriati, reincroci … (Genetica
I). Nell’uomo non posso farlo allora utilizzo gli incroci spontanei: analizzo
le famiglie
Perche’ faccio questo studio? che
informazioni ne ricavero’? a che mi
serviranno?
So gia’ in partenza che il mio fenotipo e’ a questo stadio troppo
generico:il colore della pelle non e’ verosimilmente dovuto alla variazione
di un singolo gene e non potendo studiarli tutti insieme devo cercare di
scorporare i sottoinsiemi che costituiscono l’insieme dei non pigmentati.
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Da dove si incomincia? III
L’analisi delle famiglie mi permette di definire le
modalita’ di trasmissione se autosomico o Xlinked, se
dominante o recessivo. Da questo primo screening vedo
che come atteso (perche’?) il fenotipo e’ recessivo e
che esistono locus X linked e autosomici e che percio’
e’ presente eterogeneita’ di locus
quindi come vado avanti? ho informazioni sul pigmento: la
melanina?
 La melanina non si introduce come tale, si costruisce attraverso
un processo metabolico complesso (me lo dice il biochimico)
Viene prodotta da cellule specializzate: i melanociti (me lo dice il
citologo e il fisiologo cellulare)
Adesso mi domando: la melanina non c’e’ perche’ non si forma o
perche’ non ci sono le cellule che la producono?
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Come vado avanti? I
Viene prodotta da cellule specializzate: i melanociti (me lo dice il citologo
e il fisiologo cellulare)

So distinguere senza possibilita’ di errore i melanociti? se si,
posso utilizzare questo test per dividere all’interno dei non
pigmentati quelli che sono tali perche’ mancano i melanociti.
Allora divido il mio insieme di non pigmentati in due sottoinsiemi:
quelli con un numero normale e quelli che ne sono privi.
Per quello che riguarda l’albinismo si concentrarono
sull’insieme con melanociti normali, perche’?
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Come vado avanti? II
Perche’ avevano la possibilita’ di suddividere ulteriormente il
sottoinsieme e non dovevano impelagarsi nella ricerca di geni dello
sviluppo e/o del differenziamento infatti:
La biochimica conosceva le tappe del ciclo di sintesi della melanina e
aveva la possibilita’ di dosare gli enzimi, e di suddividere in diversi
gruppi gli affetti: il fenotipo da seguire non e’ piu’ depigmentazione, ma
assenza dell’enzima A (fenotipoA), assenza dell’enzima B (fenotipo B)….,
e’ molto piu’ accurato e mi permette di evidenziare altri sottoinsiemi.
Pero’ non e’ detto che la mancanza di un enzima sia dovuta alla
mutazione del gene che codifica per l’enzima…….
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Come vado avanti? III
Si concentrarono sulla tirosinasi che
catalizza il primo step e che era possibile
estrarre dai melanociti cosa che li metteva
in condizione di poter programmare
strategie di clonaggio.
Un gruppo di albini con melanociti normali mostrava assenza di
tirosinasi quindi si puo’ supporre che condividendo lo stesso fenotipo
biochimico condividano le mutazioni nella stessa regione, non la stessa
mutazione….(cosa vuol dire?)
Quando parliamo di mutazione del DNA con effetto
patogeno i punti in cui una variazione puo’ compromettere la
funzione possono essere piu’ di uno. Il fenotipo finale: assenza
della funzione e’ sempre lo stesso. L’allelia multipla riguarda
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sia le mutazioni patogene che i polimorfismi
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Albinismo oculocutaneo OCA
L’albinismo oculocutaneo OCA e’ caratterizzato da:
assenza di pigmentazione dovuta all’incapacita’ di
sintetizzare la melanina, mentre il numero dei melanociti
e’ normale. La melanina e’ presente nei capelli, nella cute
e nella retina. la patologia ha frequenza 1/39.000 nella
popolazione caucasica e 1/28.000 nella popolazione africana.
La via che porta alla sintesi della melanina parte
dall’amminoacido tirosina, che e’ coinvolto in una serie di
altre reazioni il cui mancato svolgimento porta alla
manifestazione di altri difetti congeniti del
metabolismo: Alcaptonuria e Fenilchetonuria (ricordate che le
vie metaboliche non sono rette, ma cespugli)
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La tirosinasi
Le prime due tappe che portano alla sintesi della melanina sono
catalizzate dalla tirosinasi che in una prima reazione idrossila la
tirosina e successivamente catalizza l’ossidazione della
diidrossifenilalanina ottenuta, in DOPA-chinone.
Il gene della tirosinasi e’ stato clonato e sono state
identificate le mutazioni che sono la causa della comparsa
dell’albinismo oculo cutaneo
Le strategie di clonaggio sono varie: lo scopo e’ quello di identificare la
sequenza di DNA voluta in mezzo a tutte quelle che si possono isolare
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La tirosinasi clonaggio
Dal momento che si conoscevano le basi biochimiche della
patologia e’ stato possibile utilizzare il clonaggio funzionale
Non si conosceva la sequenza della tirosinasi, ma si sapeva che era
coinvolta, pertanto si sintetizzo’ il cDNA a partire da RNA totale
estratto da cellule che sintetizzano l’enzima e si inserirono i cDNA
in fagi.
 Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione
 Produzione di anticorpi specifici per la tirosina
 Screening della library di espressione e isolamento della colonia
 Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato
 Sequenza dei cDNA cercando una ORF
 Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa
 Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni
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Analisi delle mutazioni di OCA I
Il gene della tirosinasi e’ lungo circa 50Kb ed e’
composto da 5 esoni
La ricerca delle mutazioni e’ essenziale per definire se il gene clonato e’
quello che una volta mutato provoca la patologia in esame
Infatti so solo che quella e’ la sequenza di DNA che codifica per la
tirosinasi, che so mancare in un gruppo di albini: ma l’assenza di un enzima
non e’ detto che sia dovuta sempre a mutazioni nella sequenza che
definisco gene dell’enzima X. Potrebbe essere dovuta all’assenza del suo
fattore di trascrizione,il suo cofattore se ce l’ha o di altre molecole che
garantiscono la sua maturazione post traduzionale, o il suo trasporto al di
fuori della cellula …
devo confrontare la sequenza clonata con la corrispondente sequenza nei
miei affetti, attenzione non solo la sequenza codificante…..
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Analisi delle mutazioni di OCA I
Bisogna tenere presente che le variazioni di sequenza non sempre sono
patogene, possono anche rappresentare polimorfismi che nel caso delle
recessive costituiscono un problema.
Perche?
 Sono
ancora nella fase di ricerca non nella diagnostica. Nella
popolazione generale e’ impossibile definire se un soggetto e’ portatore o
meno dell’allele patogeno.Bisogna sempre esaminare gli affetti e i loro
genitori, anche i fratelli possono essere fonte di errore: potrebbero
essere non portatori
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Analisi delle mutazioni di OCA II
 Nell’albinismo oculocutaneo grazie al
sequenziamento del gene e’ stata evidenziata la presenza
di mutazioni diverse in siti diversi del gene (allelia multipla),
che possono provocare fenotipi leggermente diversi.
 Non confondere questo con l’eterogeneita’ genetica che
e’ pure presente nell’albinismo. Esistono altre forme di
albinismo non legate a mutazione del gene della tirosinasi,
che dipendono da mutazioni di altri loci
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Analisi delle mutazioni di OCA III
Come si studiano le famiglie per riuscire ad
assegnare una specifica sequenza ad una
malattia?
Bisogna sempre analizzare i risultati nel loro insieme,
utilizzando le informazioni che vengono dalla popolazione
generale.
Prima ricordiamo alcune definizioni
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Le mutazioni
Il tasso di mutazione del DNA codificante risulta
piu’ basso rispetto al non codificante in quanto la
pressione selettiva agisce eliminando dalla
popolazione gli alleli negativi e rendendo di fatto
assenti nella popolazione quelle mutazioni che
alterino pesantemente la funzione del prodotto
genico
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Le mutazioni
Va ricordato che le mutazioni avvengono a caso percio’ sia il DNA codificante
che il non codificante sono egualmente suscettibili. Le conseguenze sono
ovviamente diverse. Le conseguenze nella parte codificante (che costituisce
circa il 3% del genoma umano) sono legate al tipo di mutazione:
mutazioni silenti (sinonime)
mutazioni non sinonime
Le mutazioni sinonime vengono considerate neutre, mentre le non
sinonime vengono suddivise in tre classi a seconda dell’effetto che
producono:
senza effetto
con effetto deleterio
forniscono un vantaggio selettivo
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Le mutazioni
 Sostituzione silente: non determina alcun cambiamento
nel prodotto: l’amminoacido resta lo stesso. Dal momento che
modifica la sequenza puo’ originare un RFLP. In qualche caso
puo’ dare origine ad un sito di splicing criptico e quindi essere
tutt’altro che neutre come la semplice sequenza

potrebbe far pensare.
Sostituzione non senso: si origina un codone di stop. Dal
momento che la pressione selettiva e’ forte su un prodotto
troncato prematuramente, nella popolazione sono rare nella
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sequenza codificante.
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Le mutazioni
Sostituzione di senso errato:si origina un codone
per un altro amminoacido
 conservativa : il nuovo amminoacido ha caratteristiche
chimiche simili al vecchio.Pertanto l’effetto sul prodotto puo’
essere minimo e puo’ essere definito polimorfismo
sia a livello di DNA che di prodotto

non conservativa: il nuovo amminoacido e’ completamente
diverso dal vecchio. Puo’ avere effetti deleteri.
 conservativa rispetto a che?
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Analisi delle mutazioni di OCA IV
Presenza di piu’ una mutazione nel DNA dell’affetto:
La stessa sostituzione e’ presente nella popolazione
generale anche in omozigosi senza conseguenze? se si e’
un polimorfismo e ci dice che quella regione della
proteina o quell’amminoacido non e’ critico per la
funzione. E’ una mutazione conservativa ai fini della
funzione.(L’accumularsi di dati su piu’ famiglie e sulla
popolazione generale facilita l’interpretazione)
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Analisi delle mutazioni di OCA VI
Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi
in altri soggetti albini non imparentati? Se si e’ probabile
che siano patogenetiche e ritrovarne una nei fratelli
dell’affetto lo fa identificare come portatore (la mutazione
deve essere presente in eterozigosi in un genitore)
Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in
altri soggetti albini non imparentati? Se no riguarda una
regione nota per essere necessaria al funzionamento della
proteina? Se si e’ probabile che sia patogenetica (cfr. sopra)
By NA
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Analisi delle mutazioni di OCA VI

Nell’albinismo oculocutaneo sono stati trovati
eterozigoti composti: soggetti affetti in cui la mutazione
patogeneticanon e’ presente in omozigosi, ma la presenza di
due alleli patologici fa manifestare la malattia. I genitori ed
eventuali fratelli in cui e’ presente anche l’allele wild-type
sono eterozigoti per una sola mutazione.
By NA
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Mappa delle mutazioni di OCA
I
II
III
IV
V
Cu(B)
Cu(A)
Mutazioni puntiformi: patogene
Mutazioni puntiformi:polimorfismi
Mutazioni frameshift
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Diagnostica
quanto diremo vale per la diagnostica delle malattie ereditarie: le
tecniche sono le stesse per tutte, si scelgono quelle piu’ appropriate a
seconda dei casi. Cominciamo dalla termiologia
analisi genetica
 L’analisi individua il genotipo di individui a rischio per
ben definite patologie. Oggi possono essere identificate
anche prima della nascita piu’ di 300 malattie genetiche.
 La maggior parte sono rare e l’analisi viene fatta solo
quando c’e’ una indicazione precisa
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36
Diagnostica: screening
 Lo screening genetico si effettua su una popolazione o
su un gruppo di individui non imparentati.
 Non si possono fare screening per tutte le possibili
malattie: si effettua su una popolazione in cui una
particolare patologia ha un’incidenza significativa:
es.Tay-Sachs nei canadesi francofoni o negli ebrei
orientali. L’anemia falciforme nel bacino mediterraneo, la
talassemia.......
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screening
un test di screening deve rispondere ad alcune caratteristiche:
 La popolazione da testare e’ ben identificata
 L’analisi e’ economica e rapida
 L’analisi prenatale consente alle coppie di portatori
di operare scelte riproduttive.
 E’ possibile anche nel caso degli affetti intervenire
per impedire la comparsa della patologia: fenilchetonuria
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Diagnostica
Finora abbiamo visto come si affronta lo studio di un gene del
metabolismo a partire da una funzione di cui in parte e’ noto il
meccanismo. Si e’ clonato il gene, adesso si possono trasferire nella
pratica di laboratorio le informazioni raccolte
 E’ presente eterogeneita’ genetica?
Se si siamo certi della diagnosi?
 Quale e’ il modello di trasmissione?
 Esistono poche o molte mutazioni patogene?
 E’ presente un effetto del fondatore?
 Il malato e’ ancora vivente? e perche’ viene richiesta la diagnosi?
 Queste domande sono valide per qualunque malattia
genetica indipendentemente dal modello di trasmissione!
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esempio con OCA
 E’ presente eterogeneita’ genetica? Se si siamo certi della diagnosi?
Il fenotipo e’ il risultato di una catena di interazioni:il
risultato finale puo’ risultare simile anche quando i locus
sono diversi.
Nel caso dell’albinismo esistono piu’ loci la cui mutazione
provoca la mancata pigmentazione. Inoltre altre patologie
complesse presentano fra le altre manifestazioni cliniche
la depigmentazione. Il termine albino e’ troppo generico
Per esempio esiste l’albinismo oculare OA che ha eredita’
X-linked in cui la cute e le articolazioni non sono coinvolti,
e in una sua forma si accompagna a sordita’
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40
esempio con OCA
 E’ presente eterogeneita’ genetica?
Se si siamo certi della diagnosi?
Nel caso di OCA, ne esistono almeno tre tipi:
Tipo I,OCA1: originato dalla mutazione del gene della
tirosinasi, mappa in 11q.All’interno di questo tipo sono
stati descritti almeno 3 sottotipi:
Tipo I, OCA1A: Albinismo oculocutaneo classico con
assenza totale di attivita’ tirosinasica
Tipo I, OCA1B: Albinismo oculocutaneo con attivita’ parziale della
tirosinasi. Viene anche definito mutante giallo in quanto il colore dei
capelli e’ piu’ vicino al biondo che al bianco. Una variante di questo
e’ l’albinismo sensibile alla temperatura indicato come OCA1-TS legato
ad una missenso che provoca una ridotta stabilita’ alle temperature
corporee
By NA
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esempio con OCA
 E’ presente eterogeneita’ genetica?
Se si siamo certi della diagnosi?
TipoII OCA2: Questo tipo presenta attivita’
tirosinasica e mappa in 15q. E’ dovuto alla
mutazione del locus p, spesso si ritrova
associato alla sindrome di Prader-Willi dovuta a
delezione di una grossa regione cromosomica
TipoIII, OCA3: E’ dovuto alla mutazione del
gene TYRP1:(tyrosinase-related-protein-1) che
si ritiene abbia un ruoloregolatorio nell’attivita’
della tirosinasi.Mappa in 9q
By NA
42
esempio con OCA
 Quale e’ il modello di trasmissione? Autosomico recessivo
 Esistono poche o molte mutazioni patogene?
Mutazioni puntiformi: patogene
Mutazioni puntiformi:polimorfismi
Mutazioni frameshift
I
II
Cu(A)
III
IV
V
Cu(B)
Le mutazioni presenti sono diverse all’interno della
popolazione generale, ma sono concentrate in punti
particolari della molecola: esone I e III, indicando
che queste regioni sono critiche per l’attivita’ dell’enzima
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esempio con OCA
 E’ presente un effetto del fondatore?
SI
Alcuni tipi di mutazioni sono piu’ rare di altre e si
ritrovano solo in alcuni gruppi etnici,in cui possono
essere presenti in omozigosi, indicando che hanno
avuto un ancestore comune in cui si e’ originata la
mutazione
OCA1B e OCA1-TS: sono un esempio di effetto del
fondatore: infatti il primo e’ stato descritto in un
gruppo Amish (comunita’ religiosa isolata geneticamente per
motivi religiosi) in cui era presente in omozigosi una
mutazione missenso(cfr.testo).
By NA
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esempio con OCA
 Il malato e’ ancora vivente? e perche’ viene richiesta la diagnosi?
La presenza del malato rende piu’ facile definire quali delle
n possibili mutazioni sono presenti nella famiglia e quindi
identificare lo stato di portatore di altri membri della
famiglia o eseguire una diagnosi prenatale
Utilizzando la PCR per amplificare i due esoni in cui si
concentrano le mutazioni e sequenziando il prodotto di
amplificazione, si individuano gli alleli mutanti presenti
nell’affetto. Una volta individuate quale sia la sequenza
mutata la diagnosi all’interno della famiglia si puo’ fare con
gli ASO (cfr.testo)
Nel testo troverete alcuni esempi di diagnostica che si riferiscono
anche ad altri difetti del metabolismo.
By NA
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Il materiale didattico e’ presente in rete:
http://www.biologia.uniba.it/DIGEMI/Didattica.html
NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul
libro
By NA
46