COLORAZIONE DI GRAM Indice -Che cosa sono le colorazioni -Come funzionano? -La colorazione di Gram -Obiettivo della colorazione di Gram -Parete batterica dei Gram positivi e negativi -Cosa avviene durante la colorazione di Gram -Tecnica della colorazione di Gram -Analisi al microscopio -Fonti Che cosa sono le colorazioni? In microscopia ottica si utilizzano numerose tecniche di colorazione; esse consentono di aumentare il contrasto tra cellula ed ambiente circostante, permettendo così l’osservazione sia della morfologia cellulare, sia della struttura delle sue singole componenti (organelli, corpi d’inclusione, spore, flagelli, etc..). Ricorrere alle colorazioni si rende necessario perchè la maggior parte dei microrganismi presenta una scarsa differenza di contrasto tra corpo cellulare, quasi trasparente, ed ambiente acquoso, in particolare laddove manchino dei pigmenti interni.Il fine primario di ogni colorazione é quello di permettere la corretta identificazione delle specie microbiche in esame. Come funzionano? Tutti i coloranti utilizzati in Microbiologia sono composti organici che hanno affinità chimica per specifici componenti cellulari.Si tratta di particolari molecole derivate dall’anilina, le quali hanno al loro interno un gruppo funzionale (cioè una specifica combinazione o gruppo di atomi) che presenta proprietà cromofore a causa dell’assetto assunto dai suoi elettroni. Essi vengono infatti eccitati da lunghezze d’onda normalmente presenti nella luce visibile e quando le riemettono, trasmettono il colore corrispondente.Queste sostanze si legano alla loro struttura bersaglio (la parete cellulare, gli acidi nucleici, i flagelli, etc..) attraverso un legame di tipo ionico. Sono infatti sali e quando devono essere preparate vengono sciolte in acqua, dove dissociano in ioni carichi positivamente oppure negativamente. Per questo motivo, esse si suddividono in due grandi categorie: -coloranti di tipo basico (o cationico): sostanze che in acqua ionizzano assumendo carica positiva. Ne sono un esempio: blu di metilene, fucsina basica, cristalvioletto, safranina e violetto di genziana. I coloranti basici hanno affinità per tutte quelle componenti cellulari che presentano carica opposta (quindi negativa): acidi nucleici, proteine (in larga parte), superficie cellulare batterica. -coloranti di tipo acido (o anionici): sono sostanze che in acqua ionizzano assumendo carica negativa. Ne sono un esempio: rosso Congo, fucsina acida ed eosinato di sodio. I coloranti acidi presentano affinità per tutte quelle componenti cellulari che presentano carica opposta (quindi positiva): citoplasma batterico, alcune proteine, miceli fungini. La colorazione di Gram Hans Christian Gram, un medico danese, è il padre della tecnica di colorazione basata sulla diversa affinità tintoriale che le varie specie batteriche hanno nei confronti di alcuni coloranti basici, messe in contatto con una soluzione iodica. La scoperta risale al 1884: a Berlino il dott. Gram stava esaminando del tessuto polmonare di pazienti deceduti per polmonite e notò che le cellule batteriche si coloravano più intensamente con cristal violetto e soluzione di Lugol. Esperimenti successivi evidenziarono che batteri come gli Pneumococchi conservavano il colore utilizzato anche se si effettuava un lavaggio con etanolo, mentre altri come i Corinebatteri non lo trattenevano. E’ una colorazione basica cosiddetta Differenziale o di contrasto. Obiettivo della colorazione di Gram La colorazione di Gram permette di distinguere e classificare i batteri presenti in un campione.In base alla diversa colorazione assunta, che dipende dalla loro permeabilità al colorante principale (il cristalvioletto, detto anche violetto di genziana), essi sono identificabili in due grandi classi: batteri gram positivi e batteri gram negativi.La diversa permeabilità è dovuta a ragioni morfologiche intrinseche alla struttura della parete cellulare del batterio e può dare solo due esiti: colorazione piena (“gram-positività”) o non colorazione (“gram-negatività”).E’ senza alcun dubbio la colorazione fondamentale per l’analisi batteriologica della microscopia ottica; nella pratica clinica ha inoltre un’alta valenza prediagnostica.Tuttavia essa non è applicabile ad alcuni batteri, quali i bacilli acido resistenti (i Micobatteri necessitano infatti di una colorazione specifica) e risulta inoltre inefficace su funghi e lieviti. Parete batterica dei Gram positivi e negativi La parete svolge funzioni fondamentali per la cellula batterica, quali regolazione della pressione osmotica, protezione della membrana plasmatica da ambiente esterno e regolazione dell’entrata dei nutrienti nella cellula. Non in tutti i batteri però ha la stessa composizione chimica ed è questo che ha permesso la distinzione in Gram positivi e negativi. Nei gram+ la parete è formata per il 90% da mureina (peptidoglicano) e da componenti quantitativamente minori come acidi teloici, acidi teucuronici e proteine. La mureina è composta da due tipi di catene che intrecciandosi tra loro e formando numerosi strati conferiscono rigidità nonché spessore alla parete. Nei gram- la parete è formata soltato dal 15-20% di mureina, che inoltre risulta essere monostratificata, per il fatto che non tutti i NAM si legano con un pentapeptide, diminuendo la possibilità di formare legami crociati. Ciò che li distingue dai gram+ è la presenza di una membrana esterna formata da un doppio strato fosfolipidico, che rappresenta una prima barriera al passaggio di sostanze. Cosa avviene durante la colorazione di Gram Il primo colorante (cristalvioletto) colora tutte le cellule batteriche indifferentemente in quanto viene inglobato nello strato di peptidoglicano. La decolorazione fa in modo che solo i gram negativi si decolorino in quanto l’acetone attacca le strutture lipopolisaccaridiche della membrana esterna che, disciogliendosi, permettono al colorante di fuoriuscire dal sottile strato di peptidoglicano. A questo punto i gram negativi sono incolore e saranno visibili soltanto con il secondo colorante, che li farà apparire di colore rosa. In conclusione, ad oggi la colorazione di Gram rimane un ottimo strumento di classificazione batteriologica che spesso permette di individuare nuovi batteri patogeni e di conseguenza di scegliere le terapie antibiotiche migliori. Tecnica della colorazione di Gram ● ● ● ● ● ● ● ● Depositare il campione da analizzare su un vetrino per microscopia ed effettuarne la fissazione al calore, quindi lasciar raffreddare; -Con l’ausilio di un contagocce, disporre il colorante primario cristalvioletto sul vetrino e lasciar agire per circa tre minuti; Effettuare un lavaggio con acqua per rimuovere l’eccesso di colorante ed asciugare; Con l’ausilio del contagocce, aggiungere il reattivo di Lugol e lasciar agire per circa due minuti; Effettuare un lavaggio con acqua per rimuovere l’eventuale eccesso di mordenzante ed asciugare; Effettuare il lavaggio con etanolo per decolorare; il vetrino va tenuto a circa 45 gradi per un’estremità, valutando ad occhio la scomparsa della tonalità viola purpurea del complesso colorante, quindi va asciugato; Effettuare la posa del colorante di contrasto (Safranina) per circa tre minuti; Effettuare un lavaggio con acqua per rimuovere l’eccesso del colorante di contrasto ed asciugare. Analisi al microscopio L’osservazione viene condotta al normale microscopio ottico; si consiglia di utilizzare un livello d’ingrandimento superiore al 10X ed ovviamente di aumentarlo ulteriormente al bisogno. Come già accennato, la colorazione di gram viene tutt’ora utilizzata nella normale pratica clinica, come prima fase dello screening di un campione biologico per individuare ed identificare eventuali microrganismi patogeni presenti. Fonti Biopills/13-05-2022 Microscopia Italia/13-05-2022 Microbiologia Italia/13-05-2022
