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Homogenization methods (1)

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Metodologia Biochimica 2002 – Lez. 1
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OMOGENEIZZAZIONE
Consiste nella rottura delle membrane e
pareti cellulari, con rilascio dei componenti
intracellulari.
E’ un processo empirico, che necessita di
ottimizzazione a seconda del tipo di
analisi che si intende effettuare. Nel
discutere questo aspetto, considereremo
tre fattori principali.
-
Coltura
cellulare
o tessuto
Scelta del materiale di partenza
Metodo di rottura delle cellule
Proprietà chimico-fisiche delle
soluzioni impiegate.
SCELTA E CONSERVAZIONE DEL MATERIALE DI PARTENZA
È cruciale, in un processo di purificazione di organelli (o macromolecole) scegliere un
materiale di partenza che contenga elevate concentrazioni dell’organello (macromolecola)
che si desidera. Ad es., per la purificazione di mitocondri è preferibile un tessuto
muscolare (cuore), i ribosomi si possono ottenere con una certa facilità dai reticolociti, etc.
Altri fattori che si devono tenere presenti nella scelta del materiale sono la reperibilità e il
costo, nonché la facilità di purificazione (a parità di contenuti di mitocondri, un cuore
bovino è generalmente preferibile ad un cuore di topo – perché è reperibile
commercialmente e perché da un solo organo si ottengono grandi quantità di tessuto).
L’impiego delle cellule (organo, tessuto o microorganismi) dovrebbe avvenire il più
rapidamente possibile (ad es. dalla macellazione dell’animale) al fine di minimizzare i
processi degradativi. Se possibile, le cellule andrebbero mantenute a 4 °C fino alla
omogeneizzazione. Il congelamento è possibile ma, specie per organi e tessuti (e per
cellule eucariote in generale) può creare problemi.
•
•
•
•
•
L’acqua intracellulare, congelando lentamente fino alle temperature di un normale
freezer (tra –15° e –25°C), forma macrocristalli di ghiaccio che possono
danneggiare le membrane delle cellule e degli organelli.
In queste condizioni, inoltre, si forma nelle cellule una soluzione proteica ad alta
densità (protein soup) nella quale gli enzimi degradativi mantengono una certa
attività.
Il pH può variare drasticamente durante il congelamento (Cambiamento del pK dei
tamponi fisiologici; precipitazione di sali…)
Meglio quindi congelare rapidamente a T<25°C (in pratica, surgelare) in modo da
favorire la formazione di microcristalli, meno dannosi. In altri casi si possono
impiegare agenti crioprotettivi (tipicamente, glicerolo) che stabilizzano membrane e
proteine alle basse temperature.
Conservare il materiale alla T più bassa possibile (ad es., in un freezer da
laboratorio a -80°C). Lo scongelamento deve essere rapido, anche in questo caso
per evitare danni alle membrane.
Metodologia Biochimica 2002 – Lez. 1
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METODI DI ROTTURA DELLE CELLULE
I metodi di omogeneizzazione impiegati cambiano a seconda del tipo di materiale di
partenza (fragilità più o meno accentuata delle cellule) ed a seconda che si intenda
studiare organelli intracellulari (mitocondri, nuclei, lisosomi…) oppure il materiale
citoplasmatico.
Solitamente il processo è effettuato a bassa temperatura (camera fredda a 4°C, soluzioni
raffreddate in ghiaccio). Il tessuto o le cellule sono sospese prima della omogeneizzazione
in 2/3 volumi di tampone apposito (tampone di omogeneizzazione- vedi oltre).
Si possono distinguere (a scopo didattico) metodi blandi, moderati e vigorosi di
omogeneizzazione.
Metodi blandi
Esempi di
materiale
utilizzabile
Metodo
Lisi per osmosi Cellule fragili si lisano se immerse in acqua distillata (2
ml d’acqua per 1 ml di cellule) per la differenza di pressione osmotica tra
interno ed esterno, che produce un rigonfiamento delle cellule, un
aumento della pressione sulla membrana cellulare ed una lisi della
stessa (anche le membrane degli organelli possono rompersi).
Globuli rossi
Na+, Ca2+
K+
Mg2+
Shock osmotico
Le cellule animali riescono a mantenere costante la concentrazione
intracellulare di soluti scambiando
attivamente (consumo di ATP) ioni
con l’esterno.
Un abbassamento drastico della pressione osmotica esterna (immersione in acqua
distillata) provoca un rigonfiamento delle
cellule ed una ‘esplosione’ delle membrane.
Digestione enzimatica La parete cellulare dei batteri e dei lieviti può
essere digerita con enzimi (lisozima, zimoliasi…). A questo segue la lisi
osmotica della membrana cellulare. Il metodo è abbastanza costoso.
Parete
Lisi della parete+
shock osmotico
I batteri si difendono dagli eccessi
di pressione osmotica grazie alla
presenza della parete cellulare.
Lisando la parete con enzimi appositi, le
cellule batteriche divengono particolarmente
fragili.
Batteri, lieviti
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Metodi blandi (continuazione)
Esempi di
materiale
utilizzabile
Metodo
Solubilizzazione chimica La degradazione delle membrane/pareti è
operata da solventi organici (ad es., 0.5% toluene, etile acetato) o
detergenti (ad esempio, SDS – sodio dodecil solfato). Il rilascio di enzimi
idrolitici endocellulari completa la degradazione delle membrane.
Lieviti
-
SO3 Na+
O
Sodio dodecil solfato
Omogeneizzatori tipo potter Le membrane
sono lacerate dalle forze frizionali che un
pestello in teflon o vetro (generalmente
mantenuto in rotazione grazie ad un
motore elettrico) esercita contro le pareti
di uno spesso cilindro di vetro. Lo spazio
tra pestello e pareti del cilindro è di 50500 m (tight-fitting).
Tessuti
animali
(fegato, reni,
cuore etc.)
La tecnica
non è adatta
per cellule
batteriche o
per lieviti.
Metodi moderati
Omogeneizzatori a lama Si tratta di normali
frullatori. Il tessuto viene sminuzzato per
azione delle lame.
Tessuti
animali e
vegetali
Macinazione con mortaio Le cellule vegetali, dotate di parete cellulare,
possono essere mescolate con sabbia e triturate con un pestello a mano
(la rottura delle pareti è data dall’effetto abrasivo della sabbia).
Alternativamente, i tessuti vegetali possono essere congelati in azoto
liquido (-196°C); ciò rende le pareti particolarmente fragili ed è
abbastanza facile rompere le cellule con un pestello.
Tessuti
vegetali.
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Metodi vigorosi
Esempi di
materiale
utilizzabile
Metodo
French Press La sospensione di cellule
è inserita in una camera di compressione
di acciaio inox, dotata di pistone e chiusa da una valvola a spillo. Si rimuove
tutta l’aria dalla camera (così che rimanga solo la sospensione di cellule)
e mediante il pistone vengono applicate
sulle cellule pressioni idrauliche elevatissime (fino a 105 kPa, cioè 1000 atmoatmosfere). Le cellule subiscono una
compressione notevole.
Batteri, lieviti
Pistone
Camera di
compressione
Valvola a
spillo
Poi si apre lentamente la valvola a
spillo, così che le cellule possono fuoriuscire
dalla valvola stessa. A causa del brusco sbalzo
di pressione cui sono sottoposte uscendo
dalla valvola, le cellule ‘esplodono’
e si frantumano. Il metodo funziona bene
per volumi medi di materiale, da 10 a 30 ml,
ma richiede troppo lavoro per preparazioni
su larga scala.
Sonicazione Nella sospensione viene immersa la
sonda metallica di un sonicatore, che vibrando è
in grado di emettere onde sonore ad altissima
frequenza. Le cellule vengono rotte dalle elevate
pressioni locali indotte da queste onde.
Svantaggi: sviluppo di calore (si rimedia
lavorando con le soluzioni in bagno di ghiaccio
e programmando il funzionamento ‘pulsato’,
cioè intermittente, della sonda), pericolo di
danni per l’udito dell’operatore (è necessario usare cuffie).
Batteri,
sospensioni di
cellule
Macinazione con microsfere. Le cellule vengono mescolate con sfere
di vetro di diametro molto ridotto (ad es., 500 m), e poi sottoposte a
vigorosa agitazione con strumenti appositi (vortex e simili) per diversi
minuti. Le cellule sono frantumate dagli urti meccanici tra le microsfere.
Lieviti,
sospensioni di
cellule
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SOLUZIONI IMPIEGATE PER FRAZIONAMENTO E OMOGENEIZZAZIONE
Le soluzioni impiegate per sospendere le cellule e per stabilizzare l’omogenato devono
mantenere il più possibile l’integrità degli organelli (se questi si vogliono ottenere intatti) e
delle macromolecole presenti nella cellula, l’attività degli enzimi etc. La formulazione di
queste soluzioni è basata sulle caratteristiche chimico-fisiche dei fluidi biologici. In
particolare, sarà importante che queste soluzioni mantengano un pH simile a quello
fisiologico e che siano isotoniche rispetto alle cellule ed agli organelli.
MANTENIMENTO DEL pH: IL TAMPONE O BUFFER
Il mantenimento del pH della soluzione a valori fisiologici o quasi è essenziale per
preservare la funzionalità biologica dell’estratto. Variazioni anche minime del pH possono
portare a cambiamenti nella permeabilità delle membrane, nella stabilità delle strutture
macromolecolari o nelle proprietà funzionali di proteine ed enzimi (un esempio banale:
l’emoglobina a basso pH tende a rilasciare l’O2 legato).
Per il mantenimento del pH, la soluzione dovrà contenere un tampone (buffer) a concentrazione elevata (50-100 mM). Il tampone ideale dovrà possedere le seguenti qualità:
-
Tamponare a pH vicino alla neutralità (approssimativamente il pKa del tampone dovrebbe essere compreso
tra 6 ed 8; il normale pH intracellulare è ~7.4 e la
maggior parte dei sistemi biologici sono stabili e
funzionano al meglio tra pH 5.5 ed 8.5).
-
Essere altamente solubile.
-
Non penetrare attraverso le membrane (se si studiano
organelli).
-
Essere stabile chimicamente ed enzimaticamente (ad
esempio, il fosfato è spesso substrato, o prodotto, o
effettore di enzimi – questo può provocare problemi nel
seguire la purificazione di tali enzimi mediante saggi
enzimatici).
-
Non assorbire luce nelle regioni dello spettro UV-visibile (per non interferire con la
determinazione spettrofotometrica delle proteine).
-
Non essere tossico.
-
Costare poco. Per quanto banale, la considerazione è importante, perché per i
processi di omogeneizzazione e di frazionamento cellulare è spesso necessario
preparare molti litri di soluzione tamponata.
I tamponi più comunemente usati in biochimica sono costituiti da acidi deboli, soprattutto
inorganici (H2CO3, H2PO4-, H3BO3, CH3COOH...) e da alcuni tipi di ammine ed
amminoacidi.
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ALCUNI DEI TAMPONI PIÙ COMUNEMENTE USATI IN BIOCHIMICA
Acido o base
pKa (a 25°C)
Acido acetico
4.75
Acido citrico
4.76 (pKa2)
6.4 (pKa3)
È efficace come tampone a pH <7. Tende a
chelare gli ioni polivalenti.
6.1
È uno dei cosiddetti ‘Good buffers’ (dal
nome di chi ne ha esplorato l’uso in
biochimica e biologia cellulare), come
anche Bicina, PIPES, HEPES ed altri. Poco
tossico per le cellule.
6.35 (pKa1)
10.3 (pKa2)
La forma diprotonata tende a formare CO 2.
Più utile come tampone per la biochimica, a
pH alcalini, lo ione monoacido.
6.8
Relativamente costoso, ma valido.
Interagisce pochissimo con i metalli
divalenti (Ca2+, Mg2+, Mn2+). Può interferire
con il metodo di Lowry per la
determinazione della concentrazione
proteica.
MES
acido 2-(N-morfolino)-etansulfonico
Acido carbonico
PIPES
acido 1,4piperazinodietansulfonico
Imidazolo
Acido fosforico
HEPES acido N-2-idrossietil-
Note
È efficace come tampone solo a pH acidi
(4-5.5).
7.0
7.2 (pKa2)
12.3 (pKa3)
Poco costoso. È spesso metabolita o
inibitore di sistemi enzimatici. Tende a
precipitare i cationi polivalenti.
7.5
Vedi PIPES.
8.1
Poco costoso e molto usato. Tuttavia può
dare effetti inibitori con molti sistemi
enzimatici ed interagire fortemente con I
metalli di transizione. Il suo pKa varia
sensibilmente con la temperatura
Bicina
8.35
Un ‘Good buffer’.
Acido borico
9.2
Forma complessi con gli acidi nucleici.
piperazina-N’-2-etansulfonico
Tris
Tris(idrossimetil)aminometano
N,N’-bis-(2-idrossietil)glicina
Glicina
9.8 (pKa2)
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MANTENIMENTO DELLA PRESSIONE OSMOTICA
Quando si voglia prevenire lo shock osmotico degli organuli e la loro lisi, occorre che il
medium abbia una pressione osmotica analoga a quella intracellulare. Si può impiegare a
questo scopo uno zucchero come il saccarosio (0.25 M). Nel caso il saccarosio interferisca
con i saggi enzimatici, si può impiegare mannitolo.
Questi zuccheri (ed eventualmente sali, aggiunti in concentrazioni moderate per
mantenere una forza ionica prossima a quella intracellulare) sono generalmente anche
stabilizzanti delle strutture proteiche.
ALTRI COMPONENTI DEL MEDIUM
-
Ioni Mg2+ contribuiscono a mantenere integri nuclei e ribosomi (stabilizzano le strutture
tridimensionali del DNA e dell’RNA).
-
Composti tiolici (2-mercaptoetanolo, ditiotreitolo, glutatione, cisteina…) vengono
utilizzati per mantenere ridotti i gruppi sulfidrilici delle proteine ed impedire la
formazione di legami disolfuro ‘spurii’ (ovviamente, questi composti non vanno usati
durante le procedure di purificazione di proteine che contengono ponti disolfuro
essenziali).
-
Inibitori di proteasi. Servono ad impedire o ritardare i
fenomeni degradativi dovuti alla liberazione di proteasi
intracellulari. Si usano molecole specifiche per diverse
classi di proteasi: il PMSF (fenilmetilsulfonil fluoruro; è
un inibitore delle proteasi a serina), la leupeptina (un
tripeptide modificato; è inibitore reversibile di alcune
proteasi seriniche e cisteiniche), la pepstatina A
(blocca le proteasi acide quali pepsina, renina,
chimosina), l’EDTA (un chelante dei metalli, che quindi
inibisce indirettamente le metalloproteasi) etc.
-
…ovviamente, se quello che si intende purificare non
sono proteine ma acidi nucleici, RNA in particolare,
occorrerà usare degli inibitori di nucleasi (RNAsina,
cocktails di anticorpi specifici per le ribonucleasi,
vanadil nucleotidi…).
La temperatura alla quale vengono effettuati l’omogeneizzazione delle cellule e la
purificazione di organelli o macromolecole è importante. Di solito tutte queste operazioni
vengono effettuate al freddo (soluzioni mantenute in ghiaccio; manipolazioni in camera
fredda; centrifugazioni a 4°C etc.) tranne che per la purificazione di proteine termostabili.
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SITI WEB INTERESSANTI
Per quelli di voi che volessero approfondire gli argomenti descritti in questa parte del
programma e che hanno accesso al World Wide Web:
Sito Web
Commento
http://www.esb.ucp.pt/~bungah/working/disrupt.htm
Un sito con descrizione succinta
ma completa dei metodi per la lisi
cellulare (soprattutto batteri)
http://www.ambion.com/techlib/tn/54/542.html
Un sito commerciale dedicato alle
metodiche per la lisi cellulare
finalizzate all’estrazione di RNA
(ad es., di ribosomi o di mRNA).
http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Bi
ochem_353/Buffer_Theory.html
Un buon sito in cui viene descritta
la teoria e la pratica della
preparazione dei buffers.
Vengono inoltre fornite liste dei
più comuni tamponi (e
combinazioni di tamponi) usati in
biochimica.
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