la rete trapiantologica nella regione campania

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LA RETE TRAPIANTOLOGICA NELLA REGIONE CAMPANIA:
FOCUS SUL CENTRO REGIONALE TRAPIANTI (CRT) E LABORATORIO
DI IMMUNOGENETICA E IMMUNOLOGIA DEI TRAPIANTI (LIT)
ANTONIETTA PICASCIA1, PAOLO GIANNATTASIO2, CLAUDIO NAPOLI1,2
Struttura Complessa U.O.C. di Immunoematologia, Medicina Trasfusionale e di Immunologia dei Trapianti (SIMT)
con annesso Laboratorio Unico Regionale di Riferimento di Immunologia dei Trapianti (LIT),
Azienda Ospedaliera Universitaria, Seconda Università degli Studi di Napoli;
2 Centro Regionale Trapianti della Regione Campania, Azienda Ospedaliera di Rilievo Nazionale “Antonio Cardarelli” di Napoli.
1
Abstract
This report explains the transplantation organization in Campania Region and focuses on Transplantation
Immunology Laboratory (LIT) and Regional Transplantation Centre (CRT). LIT plays a key role in
immunogenetics donors graft characterization. CRT has a coordination function that involves donation
management, staff training and donors procurement.
In Campania Region, CRT and LIT activities are strongly integrated to better manage the transplantiondonation network.
Introduzione
In Italia, l’attività trapiantologica è regolamentata dalla legge n. 91 del 1 aprile 1999 che “disciplina il prelievo di organi e di tessuti da soggetto di cui sia stata
accertata la morte encefalica e regolamenta le attività
di prelievo e di trapianto di tessuti e di organi”.
Tale legge affronta tutti i complessi e delicati aspetti
del processo di donazione-trapianto di organi e tessuti, da quelli etici (trasparenza dei percorsi, pari opportunità tra i cittadini, modalità di espressione dell’assenso), a quelli socio-culturali (promozione dell’informazione della popolazione, raccolta della dichiarazione di volontà), fino a quelli più strettamente tecnici ed organizzativi. In particolare la legge 91
definisce l’organizzazione della rete trapiantologica
nazionale articolandola in quattro livelli:
1. Nazionale, rappresentata dal Centro Nazionale
Trapianti (CNT) e dalla Consulta tecnica permanente per i trapianti;
2. Interregionale in base alla quale si individuano, in
Italia, tre aree (NIT Nord Italia Transplant program;
AIRT Associazione InterRegionale Trapianti; OCST
Organizzazione Centro Sud Trapianti) (Figura 1);
3. Regionale (Centri Regionali Trapianto);
4. Locale (Coordinatori locali e Centri Trapianto).
Recependo immediatamente lo spirito della riforma del
Sistema Sanitario Nazionale, improntata alla regionalizzazione delle responsabilità e delle competenze in materia di salute dei cittadini, la legge 91 attribuisce un
ruolo fondamentale di programmazione e di gestione
alle strutture regionali. Il Centro Regionale Trapianti
(CRT) è stato istituito in Regione Campania nel 1994
ed ha avuto sede presso l’A.O.U. Seconda Università di
34
Figura 1. Organizzazione della Rete Trapiantologica Italiana. A)
NITp (Piemonte-Valle D’Aosta, Toscana, Emilia Romagna,
Puglia, provincia di Bolzano; B) AIRT (Lombardia, Veneto,
Trentino, Friuli-Venezia Giulia, Liguria e Marche; C) OCST
(Abruzzo, Basilicata, Calabria, Campania, Lazio, Molise,
Sardegna, Sicilia e Umbria).
Napoli fino al 2009, quando, con la definizione del
nuovo assetto organizzativo e funzionale, è stato trasferito presso l’A.O.R.N. “Cardarelli” di Napoli. Contestualmente presso l’A.O.U. Seconda Università di Napoli è stato istituito anche il Laboratorio di Immunologia dei Trapianti (LIT) individuato come Laboratorio
Unico di Riferimento per i Trapianti di organi, tessuti e
cellule della Regione Campania. In Regione Campania
le attività del CRT del LIT sono fortemente integrate, il
che agevola notevolmente la gestione del processo di
donazione-trapianto. Nella Figura 2 è rappresentata
l’organizzazione del sistema trapianti in Campania.
Centro regionale trapianti
Le funzioni svolte dal Centro Regionale Trapianti
sono definite, in tal modo, dalla Legge 91:
Centro Nazionale Trapianti
Centro Regionale Trapianti
Rianimazioni
Centri Trapianti
Laboratorio Regionale di
Immunogenetica e Immunologia dei
Trapianti (LIT)
Figura 2. Modello organizzativo della rete Trapianti in
Campania.
- coordinamento della raccolta e trasmissione dei dati relativi alle persone in attesa trapianto nel rispetto dei criteri stabiliti dal CNT;
- coordinamento delle attività di prelievo e dei rapporti tra i reparti di rianimazione presenti sul territorio e le strutture per i trapianti;
- controllo sull’esecuzione dei test immunologici necessari per il trapianto avvalendosi di uno o più laboratori di immunologia per i trapianti allo scopo
di assicurare l’idoneità del donatore;
- assegnazione degli organi in applicazione dei criteri stabiliti dal CNT;
- controllo sull’esecuzione dei test di compatibilità
immunologica nei programmi di trapianto nel territorio di competenza;
- coordinamento del trasporto dei campioni biologici, delle équipes sanitarie e degli organi e tessuti nel
territorio di competenza;
- cura dei rapporti di collaborazione con le autorità
sanitarie e con le associazioni di volontariato.
Tali funzioni sono riconducibili, fondamentalmente,
a tre ambiti diversi: uno di carattere operativo, prevede, il coordinamento dell’evento donativo, dalla
segnalazione del potenziale donatore all’allocazione
e trapianto degli organi; un altro attiene alla gestione delle liste di attesa e la supervisione sulla valutazione della compatibilità immunologica tra donatore
e ricevente, da svolgere in stretto raccordo con il Laboratorio di Immunologia dei Trapianti; ed un terzo
riguarda la programmazione delle attività di promozione della cultura della donazione nella popolazione, il “procurement” dei potenziali donatori, la formazione del personale, i rapporti con la rete nazionale dei trapianti, con le associazioni di volontariato
del settore e con le istituzioni.
Coordinamento del processo donazione-trapianto.
Il coordinamento di ciascun evento donativo è garantito da una centrale operativa attiva h24, 365
giorni l’anno, in cui personale medico, specificamente formato, fornisce supporto immediato e diretto al
coordinatore locale (rianimatore) ed alle équipe chirurgiche in tutte le fasi del processo e cura i rapporti
con la rete nazionale ed altre istituzioni eventualmente coinvolte. Tutto questo avviene nel rispetto di
procedure, regolamenti e linee guida che regolano
l’attività della rete regionale e nazionale secondo
principi di qualità, sicurezza, tracciabilità ed equità.
Il primo obiettivo dell’attività di coordinamento è
l’acquisizione, nel momento in cui c’è la segnalazione
di un potenziale donatore d’organo (POD) da parte di
una Rianimazione regionale, di tutti gli elementi previsti dalle linee guida nazionali necessari al fine della
definizione del rischio di trasmissione con il trapianto
di patologie infettive o neoplastiche. A tale scopo è necessario, spesso, far ricorso ad indagini di laboratorio
e strumentali di secondo livello, ad esami istologici
estemporanei ed alla consultazione di esperti nazionali (second opinion). Contestualmente vengono raccolti e riferiti ai Centri trapianto tutti gli elementi utili a
definire l’idoneità e la qualità degli organi.
Rischio di trasmissione di patologie e qualità dell’organo sono due elementi essenziali nella scelta del ricevente dell’organo stesso (allocazione), a cui vanno ad
aggiungersi il grado di urgenza del trapianto e la compatibilità immunologica tra donatore e ricevente.
In alcune condizioni il trapianto di cuore, fegato o
polmone rappresenta l’unica opzione terapeutica praticabile per pazienti con aspettative di vita altrimenti
molto limitate; pertanto sono attivi programmi per
l’allocazione prioritaria del primo organo compatibile
a livello nazionale a tali pazienti. Questi programmi di
trapianto in regime di urgenza indicano in maniera
dettagliata le condizioni in cui deve trovarsi il paziente affinché possa essere attivata la richiesta, obbligano
tutte le regioni a cedere il primo organo disponibile e
prevedono anche le modalità di restituzione dell’organo alla Regione che lo ha ceduto.
In assenza di richieste urgenti o di obblighi di restituzione, gli organi vengono allocati su base regionale,
secondo algoritmi di selezione del ricevente dalle liste
d’attesa regionali predefiniti, pubblici ed elaborati in
base a criteri sia scientifici che etici. In generale, l’applicazione di tali algoritmi di selezione consente di coniugare in maniera bilanciata diversi criteri: le peggiori condizioni cliniche, la maggiore permanenza in lista
d’attesa e la migliore compatibilità immunologica,
percorso teso alla ricerca del candidato con il miglior
“trasplant benefit”. Altro obiettivo prioritario del
coordinamento dell’evento donativo è evitare che una
risorsa preziosa e limitata come l’organo da trapiantare vada sprecata. Pertanto, qualora non esista nella lista regionale un ricevente adeguato alle caratteristiche
di un organo disponibile, lo stesso viene messo a disposizione della rete trapiantologica nazionale affinché possa essere trapiantato in altre Regioni.
L’esecuzioni di indagini infettivologiche, immunologiche ed istologiche e lo scambio di organi con altre Regioni, spesso richiedono il trasporto di campioni, organi ed équipes. Anche l’organizzazione di tali trasporti
mediante mezzi dedicati, forze dell’ordine, mezzi pubblici o privati, ricade sotto la responsabilità del CRT.
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Laboratorio di Immunologia dei trapianti
Nell’ambito dei trapianti di organi solidi, il Laboratorio di Immunologia deve, da un lato, individuare il
grado di compatibilità donatore-ricevente, attraverso
la valutazione dell’identità degli antigeni HLA e la
prova di compatibilità pre-trapianto, e dall’altro effettuare una periodica valutazione immunologica dei pazienti in lista di attesa, mediante screening ed identificazione degli anticorpi anti-HLA, la cui presenza risulta determinante ai fini della prevenzione del rigetto.
Il LIT è una struttura operativa h24 per 365 giorni
l’anno che assicura l’esecuzione delle indagini immunogenetiche necessarie per l’inserimento ed il mantenimento dei pazienti in lista d’attesa e per trapianto
di cuore, rene e fegato e provvede ad aggiornare in
tempo reale i dati relativi all’inserimento di nuovi
pazienti, allo status clinico e ad eventuali esclusioni o
sospensioni temporanee.
Il LIT, inoltre, si fa carico della selezione dei pazienti
candidati al trapianto tra quelli presenti in lista attiva (Tabella 1), applicando un algoritmo di selezione
dei candidati più immunologicamente compatibili
con il donatore ed escludendo quelli che presentano
delle incompatibilità capaci di pregiudicare l’esito
del trapianto.
ti sono espressi sulla superficie di tutte le cellule nucleate. I geni sono raggruppati in HLA I, II e III classe, sulla base della struttura e della funzione delle
proteine da essi codificate. Mentre le molecole di
classe I, HLA–A,B,C, sono presenti su tutte le cellule
nucleate e sulle piastrine, le molecole di classe II,
HLA-DR,DQ, sono espresse solo sulle cellule immunocompetenti: linfociti B; cellule T attivate; monociti; macrofagi; cellule di Langherans e cellule dendritiche. I prodotti dei geni di classe III, invece, espletano funzioni immuno-correlate non direttamente
coinvolte nella presentazione dell’antigene.
Le molecole di I classe sono costituite da due glicoproteine: la catena alfa e la beta-2-microglobulina.
La catena alfa è divisa in tre porzioni, una transmembrana, una citoplasmatica e un’altra extracellulare che è legata alla beta-2-microglobulina in modo
non covalente. La catena alfa, a differenza di quest’ultima, che è una proteina uguale in tutti gli individui, è altamente polimorfica.
Le molecole di classe II, invece, sono glicoproteine
costituite da due catene, alfa e beta, entrambe composte da due regioni extracellulari, una regione
trans-membrana e una coda citoplasmatica (Klein e
Sato, 2000) (Figura 3).
Tabella 1. Pazienti in lista attiva in Regione Campania
Organo
n° pazienti
Rene
625
Cuore
52
Fegato
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Il Sistema HLA
Gli studi fatti per comprendere le basi ereditarie della compatibilità tissutale sono stati focalizzati principalmente sul sistema antigenico HLA (human
leukocyte antigen).
Il sistema HLA è stato scoperto negli anni ‘50 da
Dausset che descrisse la presenza di anticorpi nel siero di donne pluripare o soggetti politrasfusi capaci di
interagire con antigeni espressi sulla superficie dei
leucociti. Successivamente fu dimostrata la relazione
tra questo tipo di anticorpi e il rigetto di cute e solo
negli anni ‘70 e ‘80 è stata chiaramente dimostrata la
correlazione tra compatibilità HLA e migliore sopravvivenza dell’organo e del paziente.
Il successo di un trapianto dipende dalle risposte immunologiche che un ricevente attiva nei confronti degli antigeni HLA del donatore e quindi molto è legato
alla possibilità di modulare la risposta immunologica
dell’ospite in maniera tale da prevenire quel complesso di eventi che potenzialmente possono indurre un fenomeno di rigetto iperacuto, acuto o cronico.
Il Sistema HLA comprende una serie di geni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) localizzati sul braccio corto del cromosoma 6 i cui prodot-
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Figura 3.Struttura delle molecole HLA di I e II classe (da Klein J,
Sato A. The HLA system. First of two parts. N Engl J Med. 2000,
343, 702-9).
Tutti i geni HLA sono altamente polimorfici, come è
documentato dal grande numero di antigeni e di alleli
differenti per ciascun locus sia di I che di II classe.
Tabella 2. Antigeni ed alleli HLA A-B-DR
n° antigeni
n° alleli
Locus A
24
733
Locus B
49
1115
Locus DR
20
697
Inoltre, essendo i geni HLA espressi in maniera codominante, ogni individuo ha due alleli per ciascun
locus.
Il sistema HLA svolge una funzione essenziale nei processi di riconoscimento e discriminazione del self dal
non-self, nella risposta immunitaria verso stimoli antigenici e nella modulazione sia della risposta immune
cellulare che di quella umorale. In particolare le molecole HLA di classe I presentano peptidi endogeni non
self (es. virus) ai linfociti T citotossici, CD8+, che cosi
riconoscono ed eliminano cellule infette.
Le molecole di classe II presentano peptidi esogeni
(es. tossine) ai linfociti T helper, CD4+, inducendo
così la produzione di citochine che aiutano la risposta immunitaria attraverso la produzione di anticorpi da parte dei linfociti B.
Valutazione dell’istocompatibilità
La valutazione della compatibilità donatore/ricevente presuppone lo studio del livello di somiglianza degli antigeni HLA ereditati e del livello di reattività
immunologica di questi antigeni nelle prove di compatibilità sierologiche. Maggiore è l’identità degli antigeni HLA tra donatore e ricevente e maggiore è la
compatibilità, minori risultano essere, quindi, le possibilità di rigetto dell’organo.
Le differenze in termini di HLA tra donatore e ricevente vengono definiti mismatch (MM). Più alto è il
numero di MM e minore è la compatibilità.
La tipizzazione tessutale, che permette l’identificazione degli antigeni e degli alleli HLA sia del donatore che del ricevente, risulta essere il primo step da
eseguire nella valutazione dell’istocompatibilità.
Numerosi studi multicentrici hanno dimostrato, in
particolar modo per il trapianto renale, che il livello di
compatibilità HLA è strettamente correlato con la sopravvivenza dell’organo trapiantato a lungo termine
(Opelz et al, 1999). Per quanto riguarda il trapianto
cardiaco, il discorso risulta essere diverso in quanto
quest’organo ha dei tempi di ischemia molto brevi
(massimo 4 ore) per cui deve essere subito trapiantato
dopo l’espianto.
Per questa ragione la compatibilità HLA nei trapianti di cuore ha un peso minore, nonostante ciò, alcuni
studi hanno dimostrato la stretta correlazione tra
compatibilità HLA sul locus DR e sopravvivenza
dell’organo a lungo termine (Opelz e Wujciak,
1994).
La valutazione immunologica di un potenziale ricevente organo è influenzata anche dalla presenza in
quest’ultimo di anticorpi preformati contro gli antigeni HLA del donatore. A tale scopo, la ricerca di una
presensibilizzazione specifica nei riceventi, presuppone da un lato un’accurata analisi dei sieri dei pazienti
attraverso la ricerca e l’identificazione periodica degli
anticorpi anti-HLA e dall’altro l’allestimento delle
prove di compatibilità finali, cross-match, che vengono messe a punto nell’immediato pre-trapianto e che
permettono di discriminare o meno la presenza nel sie-
ro del ricevente di eventuali anticorpi donatore-specifici, predittivi di un eventuale rigetto.
Tipizzazione tessutale
L’identificazione degli antigeni HLA viene determinata analizzando gli antigeni espressi sulla superficie
dei linfociti (tipizzazione sierologica), oppure analizzando direttamente i geni codificanti le molecole
HLA (tipizzazione molecolare).
La tipizzazione HLA sierologica si basa sul principio della citotossicità complemento dipendente
(CDC) e viene effettuata sui campioni biologici secondo il protocollo internazionale del National Institute of Health (NIH) degli U.S.A. modificato da
Terasaki. Tale tecnica prevede l’utilizzo di vassoi
preseminati con antisieri di origine umana o “monoclonali” diretti contro le specificità HLA-A,B,C
(classe I) o HLA-DR,DQ (classe II) (Terasaki et al,
1978). Gli antisieri a specificità HLA nota vengono
incubati con una sospensione di linfociti T e B del
paziente in presenza del complemento.
In caso di legame dell’anticorpo anti-HLA all’antigene corrispondente sulla superficie linfocitaria, in seguito all’attivazione del complemento, si verifica la
lisi dei linfociti; quest’ultima viene resa visibile al microscopio a fluorescenza per mezzo di una sostanza
colorante/stoppante la reazione (etidio bromuroarancio di acridina). La lisi cellulare è indice dell’evidente legame specifico tra antigene e anticorpo, esso
fornisce un risultato positivo e permette di individuare il fenotipo sui vari loci HLA del soggetto tipizzato (Figura 4).
Figura 4. Esempio di tipizzazione HLA mediante tecnica di
citotossicità complemento-dipendente (CDC). A destra è
illustrata la reazione della cellula con l’antigene HLA-B27 sulla
superficie a contatto con antisieri specifici per B27. Il complesso
antigene-anticorpo attiva il complemento e determina la morte
della cellula che appare rossa. Viceversa a sinistra, gli antisieri
anti B8 non legano gli antigeni sulla superficie cellulare, non
attivano il complemento e non danneggiano le cellule che
appaiono così di colore verde.
37
Con l’avvento delle tecnologie molecolari è stato
possibile classificare le molecole HLA sulla base
delle varianti alleliche delle sequenze del DNA evidenziando l’elevato polimorfismo genico dell’MHC. Le tecniche di tipizzazione molecolari sono divenute di uso comune nei laboratori di tipizzazione tessutale e comprendono diversi livelli di
risoluzione (basso, medio, alto) (Bunce et al,
1997).
Quasi tutte le tecniche molecolari utilizzano la reazione a catena della polimerasi (PCR) per l’amplificazione dei loci HLA da analizzare. La determinazione degli alleli HLA può avvenire mediante l’uso
di oligonucleotidi sequenza-specifica (PCR-SSO) o
di primers alleli-specifici (PCR-SSP).
Mentre la PCR-SSO necessita di una seconda fase
post-amplificazione con denaturazione, ibridazione
e rilevazione colorimetrica o mediante l’utilizzo di
microsfere fluorescenti, la PCR-SSP discrimina i diversi alleli nel corso stesso della PCR, riducendo
notevolmente i tempi della fase di post-amplificazone. In quest’ultimo caso, l’assegnazione degli alleli
consiste nella rilevazione diretta dei prodotti di amplificazione mediante corsa elettroforetica e successiva visualizzazione su gel di agarosio.
L’interpretazione dei risultati si basa, infatti, sulla
valutazione della presenza o assenza di uno specifico
frammento di DNA amplificato delle corrette dimensioni e viene effettuata manualmente, utilizzando le
tavole fornite con i kit, e con l’assistenza di software
specifici (Figura 5).
Ricerca e identificazione degli anticorpi HLA
E’ ormai ampiamente documentato che, nell’ambito
di trapianti di organi solidi e in particolar modo per
il rene e per il cuore, accanto al livello di compatibilità HLA donatore/ricevente, uno dei maggiori ostacoli all’attecchimento di un organo è la presenza nel
siero di un ricevente di anticorpi diretti contro gli antigeni HLA del donatore (Nankivell e Alexander,
2010). A tale scopo lo studio immunogenetico pretrapianto dei pazienti, con la ricerca e l’identificazione delle specificità anticorpali, rappresenta un momento indispensabile per valutare i candidati al trapianto ai fini dell’assegnazione di un organo compatibile (Terasaki e Cai, 2008).
L’esposizione di un individuo ad eventi immunizzanti, quali gravidanze, trasfusioni e pregressi trapianti
può determinare l’insorgenza di allo-anticorpi HLA.
Pertanto, i candidati al trapianto di organo, necessitano di un monitoraggio periodico mediante lo studio degli anticorpi HLA al fine di prevenire e controllare meglio la risposta immune che si potrebbe
avere a breve o a lungo termine dal trapianto (Eng et
al, 2011). Per lo studio degli anticorpi HLA la tecnica più conosciuta e finora utilizzata è stata la microlinfocitotossicità complemento dipendente (CDC) in
cui i linfociti ad HLA noto sono il bersaglio per rilevare gli anticorpi sia di classe IgG che di classe IgM,
fissanti il complemento, eventualmente presenti nel
siero dei riceventi.
Questa tecnica però presenta alcune limitazioni legate in primo luogo alla costituzione di un pannello
linfocitario che deve rappresentare tutte le specificità
antigeniche più frequenti nella popolazione, alla evidenziazione di anticorpi non HLA specifici fissanti il
complemento e alla necessità di disporre di cellule vitali (Altermann et al, 2006).
Nel corso degli anni, sono state introdotte tecniche
in fase solida quali l’immunoenzimatica (ELISA) e,
Figura 5. Esempio di interpretazione di una tipizzazione HLA con tecnica SSP. L’amplificazione delle bande nel pozzetto 1, 4, 24, consente
di assegnare il genotipo HLA A*01 al soggetto tipizzato.
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ancora più recentemente, metodiche chemioluminescenti con l’ausilio del sistema Luminex o del Citofluorimetro che utilizzano antigeni HLA purificati
legati al fondo di pozzetti nel caso del sistema ELISA
e/o a biglie fluorescenti nel caso del sistema luminescente (Tait et al, 2010) (Figura 6).
L’introduzione di questi saggi in fase solida ha consentito una maggiore sensibilità nonché una aumentata accuratezza nell’identificazione delle singole
specificità anticorpali di classe I e di classe II (Tait
BD et al, 2009; Pajaro et al, 2010).
Inoltre questi sistemi consentono l’individuazione
anche di anticorpi a basso titolo e/o non fissanti il
complemento che potrebbero avere un importante
impatto clinico e rappresentare un significativo fattore di rischio di rigetto.
Prova di compatibilità (Cross-match)
Pazienti sensibilizzati, che presentano anticorpi HLA
rivolti verso antigeni espressi sui linfociti del donatore, possono risultare positivi alla prova finale di
compatibilità pre-trapianto (cross-match). Il cross-
match consiste in una reazione tra il siero del ricevente ed i linfociti del donatore.
La positività del cross-match rappresenta una controindicazione assoluta al trapianto in quanto in
questi casi è molto comune il rigetto iperacuto (Patel
e Terasaki, 1969).
Il test sierologico correntemente utilizzato è la micro-linfocitotossicità complemento-dipendente
(CDC) in cui i sieri dei riceventi vengono incubati
con i linfociti B e T del donatore opportunamente
separati, a cui segue l’aggiunta prima del complemento e poi della soluzione colorante/stoppante la
reazione (etidio bromuro-arancio di acridina). Se
nel siero del ricevente sono presenti anticorpi antidonatore si avrà la morte delle cellule che appariranno colorate di rosso a indicare un cross-match
positivo mentre, in caso di assenza di anticorpi, le
cellule rimarranno vitali e appariranno verdi (Figura 7).
Questo test è utile per la rilevazione di elevate concentrazioni di anticorpi, ma non è in grado, in certi
casi, di evidenziare la presenza di anticorpi HLA a
LUMINEX
Alloanticorpi nel siero
te Trapiantologica Italiana. A) NITp (Piemonte-Valle D’Aosta, Toscana,
ia di Bolzano; PE
B)anti-IgG
AIRT (Lombardia, Veneto, Trentino, Friuli-Venezia
ST (Abruzzo, Basilicata, Calabria, Campania, Lazio, Molise, Sardegna,
Antigene HLA purificat
Figura 6. Sistemi di indagine degli
anticorpi anti-HLA.
Biglia fluorescente
Figura 6. Sistemi di indagine degli anticorpi anti-HLA.
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basso titolo o anticorpi che non attivano il complemento in pazienti immunizzati in lista di attesa per
un trapianto.
Frequentemente, per questa tipologia di pazienti, si
affianca alla tecnica in CDC quella citofluorimetrica
(FCXM) con la quale si ha la simultanea e indipendente separazione dei linfociti T e dei linfociti B attraverso l’impiego di anticorpi monoclonali cellulospecifici marcati con fluorocromi. L’identificazione
del legame tra gli antigeni linfocitari e gli anticorpi
presenti nel siero dei riceventi viene rilevata attraverso l’aggiunta di un anticorpo secondario antiumano
Ig-marcato con fluocromo.
Questo sistema permette di rilevare anche anticorpi
che non attivano il complemento ed è risultata più
sensibile e specifica rispetto alla tecnica sierologica
sopra descritta. Infatti, pazienti con cross-match
CDC negativo ma positivo in citofluorimetria si sono dimostrati a rischio per un aumentato numero
di episodi di rigetto e per una precoce perdita di
funzionalità dell’organo trapiantato (Graff et al,
2010).
L’attività del LIT nel corso di un allarme trapianto
Il LIT viene allertato dal CRT nel momento in cui
viene segnalato un potenziale donatore d’organo in
una delle Rianimazioni della Regione Campania. Sui
campioni biologici del donatore fatti pervenire tempestivamente al LIT viene effettuata la tipizzazione
HLA sierologica per la I e la II classe e la tipizzazione molecolare per i loci A*, B* e DRB1*.
Tipizzato il donatore, si procede con la selezione
dei potenziali riceventi di rene applicando un algoritmo informatizzato che tiene conto di una serie di
parametri tra cui la compatibilità ABO, l’anzianità
di iscrizione in lista, la classe di età donatore-ricevente, e la compatibilità HLA.
Su questa selezione si effettua poi una successiva
valutazione immunologica allo scopo di verificare
l’eventuale presenza di anticorpi contro antigeni
A.
HLA del donatore. Se un ricevente selezionato presenta anticorpi specifici anti-donatore viene escluso
in quanto, se trapiantato, sarebbe ad altissimo rischio di rigetto iperacuto.
Nel caso del trapianto di cuore e fegato, poiché, fatta salva la compatibilità ABO, tra i criteri di selezione dei riceventi prevalgono quelli legati a parametri
clinici ed antropometrici, il LIT si limita ad escludere la presenza di incompatibilità immunologiche nel
caso siano candidati pazienti immunizzati con anticorpi anti-HLA.
Per questa tipologia di pazienti, infatti, occorre
escludere la presenza di antigeni HLA proibiti ed è
anche indispensabile l’esecuzione del cross-match.
Il LIT, sui pazienti selezionati esegue le prove di
compatibilità finali utilizzando di routine la tecnica
CDC e in caso di pazienti immunizzati anche il
cross-match in citofluorimetria.
I cross-match per il rene sono vincolanti ai fini del
trapianto, un risultato positivo rappresenta infatti
una controindicazione assoluta all’intervento, per
tale motivo le prove di compatibilità vengono eseguite in urgenza prima del trapianto, utilizzando almeno due sieri per ciascun paziente selezionato.
Per il trapianto di cuore, le prove di compatibilità
vengono eseguite in genere prima del trapianto in
tutti i casi di donatori locali.
Nel caso di organi prelevati da donatori fuori Regione, a causa del breve tempo di ischemia dell’organo, il crossmatch non viene eseguito e si tende ad
assegnare l’organo a pazienti che siano risultati
storicamente negativi alla ricerca degli anticorpi
HLA.
Per il fegato non vi è consenso riguardo all’utilità
della prova di compatibilità pre-trapianto che, tuttavia, può essere svolta in un secondo momento al fine
di stabilire una appropriata terapia immunosoppressiva; recentemente è stata invece evidenziata l’utilità
del cross-match nei casi di ritrapianto di fegato
(Goh, 2010) (Figura 8).
B.
Figura 7. Immagine al microscopio a fluorescenza di cross-match negativo, con i linfociti che appaiono colorati in verde (A) e cross-match
positivo con i linfociti che appaiono colorati in rosso (B).
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Allarme trapianto
Se manca volontà espressa
si chiede il consenso ai
parenti
Segnalazione da parte di una
rianimazione, in seguito a decesso per
morte encefalica, di
POTENZIALE DONATORE
D’ORGANO (P.O.D.)
•Valutazione dell’idoneità clinica
degli organi da parte del Centro
Regionale di Riferimento Trapianti
e del Centro Trapianti
•Allocazione dell’organo.
Attivazione dell’équipe
dell’équipe
chirurgica per il prelievo
Invio dei campioni di sangue del POD dalla rianimazione al L.I.T.
Tipizzazione HLA del donatore
per i loci A*-B*-DRB1*
Selezione dei potenziali
riceventi
Cross-match
TRAPIANTO
Figura 8. Schema di un processo donativo.
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