I recettori intracellulari
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DIPARTIMENTO SCIENZE FARMACOLOGICHE DIGITARE NOMEDI DIPARTIMENTO I recettori intracellulari Dott.ssa Elisabetta Vegeto [email protected] Classificazione dei recettori ionotropi metabotropici accoppiati a chinasi intracellulari Struttura generale delle 4 superfamiglie recettoriali I ligandi endogeni dei recettori intracellulari Ormoni steroidei Ormoni Vitamine AeD tiroidei Lipidi xenobiotici membrana plasmatica citoplasma R R RECETTORI INTRACELLULARI Struttura chimica dei ligandi endogeni dei recettori intracellulari Ormoni steroidei Ormone tiroideo T3 Acidi grassi PGJ2 15-deossi-∆-prostaglandin J2 Vitamina D Ossisteroli Vitamina A Acidi biliari Xenobiotici 22(R)-idrossicolesterolo Acido chenodeossicolico 5α-androst-16-3α-ol Alcune classi di farmaci che agiscono sui recettori intracellulari • • • • Antiinfiammatori steroidei Immunosoppressori Diuretici Antineoplastici • • • • • • Anticoncezionali Antidiabetici Ipolipidemizzanti Anti-acne Anti-ipotiroidismo Anti-rachitismo (agonisti GR) (agonisti GR) (antagonisti MR) (antagonisti ER, antagonisti AR, agonisti RAR) (agonisti ER e PR) (agonisti PPARγ: i glitazoni) (agonisti PPARα: i fibrati) (agonisti RAR) (agonisti TR) (agonisti VDR) Meccanismo d’azione dei recettori intracellulari: fasi dell’attivazione L L 1. Legame recettore-ligando 2. Modificazioni strutturali del recettore (conformazione, fosforilazione, acetilazione, etc.) 3. Dimerizzazione citoplasma R R inattivo 4. Spostamento dal citoplasma al nucleo R attivo nucleo R inattivo* R R attivo (*ad eccezione di TR, RAR) Meccanismo d’azione dei recettori intracellulari: attività biologica Meccanismi d’azione: 1. Genomico 2. Non-genomico R a m s a pl inattivo o t ci R Proteine G attivo Src MAPK nucleo o cl e u n cAMP Ca++ K+ 2. Attivazione mediatori citoplasmatici PI3K Akt R R HRE Risposta biologica DNA 1.Espressione genica RNA Sintesi di nuove proteine Classificazione dei recettori intracellulari basata sull’omologia strutturale Classe 1 2 3 Recettore e sottotipi TR α,β RAR α,β,γ PPAR α,β,γ VDR LXR FXR SXR CAR Ligando ormoni tiroidei acido retinoico acidi grassi, PGJ2 vitamina D3 ossisteroli acidi biliari steroidi, xenobiotici fenobarbital, xenobiotici HRE Dimeri RGGTCA; Pal, DR-4, PI AGTTCA; DR-2, DR-5 AGGTCA; DR-1 RGKTCA; DR-3, PI-9 RGKTCA; DR-4 AGATCA; DR-4, IR-1 RGKTCA; DR-3 RGKTCA; DR-3 E E E E E E E E acido 9-cis retinoico RXR α,β,γ COUP-TF α,β,γ (sconosciuto) HNF4 AGGTCA; Pal, DR-1 RGGTCA; Pal, DR-5 AGGTCA; DR-1, DR-2 O, E O, E O ER α,β ERR 1,2 GR MR PR AR RGGTCA; Pal TCAGGTCA; Pal, emiPal AGAACA; Pal AGAACA, Pal AGAACA; Pal AGAACA; Pal O M, O O O O O estrogeni (sconosciuto) glucocorticoidi aldosterone progesterone testosterone Recettori intracellulari OMOLOGIE FUNZIONALI • Le vie di segnale dei recettori intracellulari non comportano “secondi messaggeri”: i recettori comunicano direttamente con enzimi e proteine che determinano la risposta cellulare •Il ligando dei recettori intracellulari è di piccole dimensioni e ha caratteristiche idrofobiche • I recettori intracellulari possiedono mobilità intracellulare, che comporta la loro localizzazione nel nucleo una volta attivati dal ligando (alcuni recettori sono nucleari in assenza di ligando, come TR e RAR) • capacità di legare il DNA (interazione con sequenze specifiche di DNA : i recettori intracellulari sono “DNA binding proteins”) Dominii funzionali nella struttura dei recettori intracellulari A N D A/B C b in g n i d in a m do L D nd a ig g n i d b in E DBD in a m do F LBD AF-2 AF-1 NLS dimerizzazione Co-attivatori Hsp90 Hsp56 C C Zn++ C C (Zinc finger C1) P D C C Zn++ C C (Zinc finger C2) Co-attivatori MECCANISMO D’AZIONE MOLECOLARE 1. Attività dei recettori intracellulari nel nucleo I recettori intracellulari sono dei regolatori della espressione genica, portando ad una variazione dei livelli di proteine bersaglio. DNA binding domain del recettore dell’acido retinoico legato al DNA Il DNA è costituito da 2 catene polinucleotidiche antiparallele e complementari avvolte ad elica con una periodicità di 10 basi Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Struttura della cromatina Il DNA è avvolto in una struttura chiamata cromatina, formata da proteine dette istoni e il DNA stesso. In questa conformazione il DNA non può essere trascritto Organizzazione del cromosoma eucariotico Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 I nucleosomi Compattazione del genoma batterico Il controllo della espressione genica negli eucarioti è molto più sofisticato che nei procarioti • Compartimentalizzazione di trascrizione e traduzione • Genomi poco compatti, con grande quantità di DNA non codificante • Sequenze geniche suddivise in esoni ed introni • Regioni di controllo dei geni molto grandi (anche > 50000 bp) • RNA polimerasi incapaci di iniziare la trascrizione senza altri fattori • RNA messaggeri codificanti per singole proteine, no operoni Il controllo dell’espressione genica Unicellulari Assenza di glucosio Pluricellulari Presenza di lattosio Induzione dei geni responsabili dell’utilizzazione del lattosio Nei PROCARIOTI serve per: - Adattare il batterio ai cambiamenti nutrizionali - Divisione cellulare Negli EUCARIOTI serve per: - sviluppo embrionale - differenziamento cellulare e tissutale Il controllo dell’espressione genica 5’ Regione regolatoria Regione trascritta 3’ Il controllo della trascrizione è basato sul riconoscimento di corte sequenze di DNA da parte di diverse classi di proteine Lezioni di Ferdinando Dicunto, Unito DNA binding proteins Il controllo della trascrizione è basato sul riconoscimento di corte sequenze di DNA da parte di proteine che legano il DNA Proteine “Zinc finger”, o a dita di zinco Proteine “Leucine zipper”, o cerniera di leucine Proteine “helix-loop-helix”, o “elica-giro-elica” Proteine “basic-helix-loop-helix”, o “basica-elica-giro-elica” Struttura di un tipico promotore eucariotico Meccanismi di attivazione TBP + TAFs=TFIID Regolazione a distanza Attivazione della trascrizione: reclutamento dell’oloenzima TBP + TAFs=TFIID Attivazione della trascrizione: rimodellamento locale della cromatina TBP + TAFs=TFIID Importanza delle modificazioni post-traduzionali degli istoni: acetilazione-deacetilazione TBP + TAFs=TFIID Coattivatori e corepressori e le interazioni con le acetilasi/deacetilazi • • • Richiesti per la funzione dei fattori di trascrizione specifici NON richiesti per la trascrizione basale (ma la stimolano ~10x) NON legano sequenze specifiche del DNA Attivazione della trascrizione mediata dai recettori intracellulari : i siti di legame nel DNA e il reclutamento dell’oloenzima I recettori intracellulari agiscono da regolatori della trascrizione legando una sequenza specifica di DNA presente nel promotore dei geni bersaglio Recettore intracellulare Promotore Sequenze di DNA “responsive” ai recettori intracellulari, o “HRE” Sequenza trascritta Le sequenze di DNA riconosciute dai recettori intracellulari DNA responsive elements dei Responsive elements recettori intracellulari Recettori intracellulari I recettori intracellulari regolano la trascrizione di un gene legandosi a specifiche sequenze di DNA nel promotore di questo gene, denominate sequenze responsive all’ormone (hormone responsive elements, HRE) - elementi localizzati nel promotore di alcuni geni, definiti quindi “geni bersaglio” - sequenze di ca. 6 bp, palindromiche intorno a un asse di simmetria - 2 motivi consenso: AGAACA recettori steroidei AGG/TTCA recettori non-steroidei Monomeri Omodimeri (N)n Pal Omodimeri o Eterodimeri di RXR (N)n Pal (N)n DR (N)n IP Attivazione della trascrizione mediata dai recettori intracellulari: rimodellamento locale della cromatina Fattori di reclutamento del complesso di inizio Fattori di modificazione degli istoni CBP/p300 P/CAF p160 Fattori di rimodellamento della cromatina TRAP/DRIP ADP+Pi SWI/SNF ATP TRAP/DRIP CBP/p300 P/CAF R SWI/SNF p160 R TBP pol II B Complesso di inizio della trascrizione HRE Recettor e intracell ulare D Inizio della trascrizione HRE Il recettore, legando brevi sequenze di nucleotidi posizionate su regioni distali del promotore, richiama diversi fattori che permettono l’apertura della cromatina e il reclutamento del complesso di inizio della trascrizione … ma i recettori intracellulari sono anche dei silenziatori della trascrizione genica … I recettori intracellulari possono anche inibire la trascrizione 1. conformazione indotta dagli agonisti inversi HDACs mSin3A SMRT/NCoR Ligando R R Fattori di modificazione degli istoni HRE Gli agonisti inversi reclutano i repressori trascrizionali, con conseguente spegnimento della trascrizione di un gene responsivo al ligando endogeno I recettori intracellulari possono anche inibire la trascrizione 2. Sequestro (squelching) di fattori di trascrizione l’esempio dei corticosteroidi CBP/p300 cortisolo CBP/p300 p160 P/CAF Jun Fos R R AP-1 Jun Fos R R Gene che codifica per un mediatore dell’infiammazione (es. citochine) Il gene importante per l’infiammazione viene trascritto AP-1 Il gene importante per l’infiammazione non viene trascritto I recettori intracellulari possono anche inibire la trascrizione 3. Recettore senza ligando come inibitore l’esempio del recettore dell’acido retinoico RAR (vit. A) Acido retinoico Reclutamento di Corepressori (e quindi di fattori di modificazione degli istoni che “richiudono” la cromatina) nucleo HDACs mSin3A SMRT/NCoR R R RAR RAR RARE repressore DNA attivatore MECCANISMO D’AZIONE MOLECOLARE 2. Attività non-genomica o citoplasmatica dei recettori intracellulari R ER, TR, VDR, … citoplasma Src MAPK Proteine G PI3K K+ Akt nucleo R R HRE cAMP Ca++ cGMP Meccanismi di attivazione dei recettori intracellulari Segnale che attiva recettori accoppiati a chinasi B A Le chinasi fosforilano il recettore L L citoplasma R R citoplasma inattivo R R inattivo attivo attivo La fosforilazione attiva il recettore nucleo nucleo R R R R HRE HRE DNA DNA Attivazione ligando-dipendente Attivazione ligando-indipendente Interazione (cross-talk) fra recettori intracellulari e recettori di membrana (Tumori ER+ IGFR+) Modulazione farmacologica dei recettori intracellulari Disfunzioni organiche che coinvolgono i recettori intracellulari possono essere trattate con interventi farmacologici che modificano: • sintesi, immagazzinamento o secrezione dell’ormone (insorgenza del segnale endocrino) • sintesi del recettore (sensibilità del tessuto al segnale ormonale) • disponibilità agonisti o antagonisti recettoriali (funzionalità del recettore) Meccanismo molecolare dell’azione dei farmaci attivi sui recettori intracellulari AF -1 AF-2 Coattivatori AF -1 ligando ligando AF-2 Corepressori Attivatori In questo caso il ligando è un agonista In questo caso il ligando è un agonista inverso (spesso erroneamente chiamato antagonista) Agonisti e antagonisti agiscono in modo competitivo con il ligando endogeno per il dominio recettoriale deputato al legame al ligando Antagonisti: la formazione del complesso recettore-antagonista comporta la stessa cascata di reazioni indotte dal legame con il ligando fisiologico o con agonisti sintetici (= distacco proteine inibitorie e legame alle HRE) però NON viene attivata la trascrizione dei geni bersaglio. Infatti il recettore assume una conformazione che induce il dominio AF-2 ad interagire con i corepressori. Si tratta quindi di agonisti inversi. Modificazioni della struttura tridimensionale del recettore degli estrogeni indotta da agonisti e antagonisti L’importanza dell’elica H12 e del dominio AF-2 AGONISTA AGONISTA INVERSO AGONISTA PARZIALE ANTGONISTA PURO Ne esistono e portano alla degradazione del recettore senza che esso si leghi al DNA Heldring, N. et al. Physiol. Rev. 87 2007 AGONISTA + NRbox presente nei coattivatori Copyright ©2007 American Physiological Society SERM (Selective Estrogen Receptor Modulators) antagonisti/agonisti (parziali o inversi) del recettore degli estrogeni, ma in modo tessuto specifico Effetti collaterali dell’estrogeno e di alcuni SERM utilizzati in terapia Effetto Estrogeno Tamoxifene Raloxifene Disturbi vasomotori (hot flashes) ↓↓↓ ↑ ↑ Perdite ematiche vaginali ↑↑↑ ↑ ↔ ↑↑ ↑ ↔ ↑↑↑ ↑ ↑↑ ↑↑ ↓↓ ↓↓ ↑↑↑ ↑ ↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑ Rischio di tumore endometriale Prevenzione della riduzione ossea in Tamoxifene menopausa Rischio di tumore mammario Profilo favorevole dei lipidi ematici Trombosi venosa Osso, fegato Attività agonista Utero, mammella, cervello Attività antagonista Repressori Attivatori Raloxifene Repressori AF-2 AF -1 AF-2 AF -1 Raloxifene Raloxifene Alcune classi di farmaci che agiscono sui recettori intracellulari • • • • Antiinfiammatori steroidei Immunosoppressori Diuretici Antineoplastici • • • • • • Anticoncezionali Antidiabetici Ipolipidemizzanti Anti-acne Anti-ipotiroidismo Anti-rachitismo (agonisti GR) (agonisti GR) (antagonisti MR) (antagonisti ER, antagonisti AR, agonisti RAR) (agonisti ER e PR) (agonisti PPARγ: i glitazoni) (agonisti PPARα: i fibrati) (agonisti RAR) (agonisti TR) (agonisti VDR) Modulazione farmacologica dei recettori TR, VDR, RAR terapia anti-ipotiroidismo trattamento osteomalacìa o rachitismo trattamento acne e psoriasi (terapia antineoplastica) Geni regolati dall’interazione fra vitamina D e VDR Geni indotti dall’interazione fra acido retinoico e RAR cytokeratins Mucosal-epithelial cell differentiation Geni inibiti dall’interazione fra acido retinoico e RAR CycD1, CycD3, CycE, CDK2, CDK4, CDK6 Cell proliferation Impiego terapeutico dei farmaci che agiscono sui recettori per i glucocorticoidi e per i mineralcorticoidi GR MR AGONISTI GR: • inibitori dei processi infiammatori (trattamento sindromi allergiche) • terapia sostitutiva dell’insufficienza surrenale • immunosoppressione nella profilassi del rigetto del trapianto di organi • inibitori iperproliferazione cellule mieloidi nella leucemia e nei linfomi effetti collaterali: • trattamento cronico provoca rottura dell’omeostasi ipofisisurrene AGONISTI MR: • utilizzati in caso di insufficienza surrenalica e ipoaldosteronismo effetti collaterali: ritenzione salina, ipertensione,indebolimento difese immunitarie, osteoporosi,ulcere peptiche, problemi comportamentali ANTAGONISTI GR: bloccano anche i recettori per il progesterone ANTAGONISTI MR: diuretici risparmiatori di potassio (escrezione Na+, ritenzione K+) Farmaci dei recettori per gli ormoni sessuali ER, PR ER PR Farmaci dei recettori per gli ormoni sessuali AR AR Impiego terapeutico dei farmaci che agiscono sui recettori per gli ormoni sessuali AGONISTI AR: • terapia insufficienza testicolare • ipogonadismo ipogonadotropico, • osteoporosi ER E PR: • contraccezione (distruzione funzionale asse ipotalamo-ipofisi-ovaie e quindi blocco ovulazione) • terapia dell’endometriosi • terapia sostitutiva in insufficienza ovarica • menopausa effetti collaterali: disturbi del ciclo mestruale e all’intestino, ipertensione,alterazione sistema coagulazione, iperplasia uterina ANTAGONISTI AR: • trattamento tumore alla prostata PR: • induzione aborto ER: • utilizzati terapia del tumore alla mammella SERMs (= Specific Estrogen Receptor Modulators): molecole che agiscono sul recettore degli estrogeni in modo selettivo nei diversi organi • prevenzione dell’osteoporosi evitando l’insorgenza di ipertrofia uterina Recettori PPARg: utilizzo degli agonisti (tiazolidinedioni) nella terapia del diabete. Pioglitazone Meccanismo d’azione di PPARgamma: modulazione della trascrizione di geni coinvolti nell’uptake e metabolismo di glucosio e lipidi. PPARg è espresso negli adipociti, nel tessuto muscolare e nel fegato. GLi agonisti di PPARg riducono la resistenza all’insulina nel fegato e nei tessuti periferici e portano alla riduzione dei livelli ematici di glucosio, insulina e emoglobina glicata. Rosiglitazone Effetti terapeutici: terapeutici Ipoglicemizzante orale nel diabete di tipo 2 in monoterapia o in associazione con metformina, sulfoniurea o insulina. Recettori PPARa: utilizzo degli agonisti (fibrati) come ipolipidemizzanti. Genfibrozil Meccanismo d’azione di PPARa: modulazione dell’espressione di geni coinvolti nel metabolismo dei carboidrati e grassi, e nel differenziamento del tessuto adiposo. Aumenta l’espressione della lipasi lipoproteica con conseguente aumento della clearance dei trigliceridi. Effetti terapeutici: terapeutici Riduzione dei livelli di trigliceridi Riduzione dei livelli di Very low density lipoprotein (VLDL) Riduzione modesta dei lievlli dii Low density lipoprotein (LDL) Riduzioen modesta dei livelli di High density lipoprotein (HDL) La ricerca • Espressione e attività di ER nel sistema dell’immunità innata (Elisabetta Vegeto): – la diversità di genere nella predisposizione e reattività verso patologie su base infiammatoria sono dettate dagli estrogeni? (durante lo sviluppo?) – Come si modifica il sistema immunitario durante l’invecchiamento e in menopausa? • Studio del meccanismo molecolare dell’azione degli estrogeni e attivazione ligando-indipendente (Adriana Maggi): – ER come sensore dello stato nutrizionale • Espressione e attività di ER nella progressione tumorale (Paolo Ciana): – Generazione di modelli animali per l’imaging molecolare in vivo Funzioni fisiologiche degli estrogeni sugli organi non riproduttivi Osso stimolano l’attività degli osteoblasti e inibiscono il differenziamento e l’attività degli osteoclasti Fegato inducono la sintesi di lipoproteine HDL e diminuiscono quella delle LDL. Inducono la sintesi di fattori della coagulazione Cervello Sono fattori neurotrofici, neuroprotettivi, antigliotici Endotelio e SMC vascolari causano vasodilatazione e inibiscono proliferazione delle cellule muscolari lisce Tratto G-I Pelle Estrogen and inflammation Menopause is a risk factor for pathologies associated with inflammation Inflammatory pathologies associated with a favourable outcome after estrogen administration CNS EAE (Multiple sclerosis) Globoid cells leukodystrophy Ischemia Bone & joints CV tract Rheumatoid Arthritis Osteoporosis Ischemia/reperfusion Atherosclerosis GI tract Skin Eye Lung Colitis Wound Healing Uveitis Pleurisy Estrogeni e patologie del CNS Gli estrogeni sono agenti neurotrofici e neuroprotettivi. Il loro effetto benefico è stato riscontrato in diverse patologie del SNC, fra cui: - Malattie degenerative Sclerosi multipla Ischemia Alzheimer’s Desease Parkinson’s Desease - Disordini psichiatrici Depressione Schizofrenia Le funzioni fisiologiche degli estrogeni nel cervello • Funzioni cerebrali Apprendimento Controllo della fertilità Comportamento sessuale Memoria Umore-ansietà Assunzione di cibo • Attività neuronale Neuritogenesi Densità sinaptica Densità dendritica Neurotrasmissione • Processi biochimici neuronali Sintesi di fattori neurotrofici Sintesi di fattori antiapoptotici Sintesi di proteine per facilitare la neurotrasmissione (neurotrasmettitori e loro recettori, enzimi biosintetici, trasportatori. etc) Distribuzione dei recettori degli estrogeni nel cervello Recettore alfa Recettore beta Estrogeni e metabolismo PNAS 2007 wt ERα-/- Estrogeni e sinapsi Spine dendritiche dei neuroni CA1 proestrous diestrous Dendritic spine density E2 levels +++++ ++ Proestrus (spines/10µ µm) Estrus (spines/10µ µm) 12.0 ± 0.7 8.4 ± 0.5 Estrogeni e ischemia Estrogen actions in the CNS neuron Macroglia microglia Origine e funzione della microglia Infiammazione Fagocitosi Chemotassi Rimodellamento tessuti Presentazione antigene …. …. Maggi A, Ann Rev Pysiol 2004 Microglia activation: morphological changes (from Banati, Glia 2002) Microglia activation: biosynthesis of deleterious molecules ROS NO MMPs Cyt CXC Neuron Astrocyte Stem cell progenitor Neural cell death Oligodendrocyte Excitotoxicity Demyelination Axonal damage Dystrophic neurites LPS Estrogen action in acute brain inflammation Immunological activation of microglia Brain cytokine expression * * * ° 5 ° Ctrl ctrl LPS 3h E2+LPS E2+LPS Hippocampus LPS 3v ° 1 MCP-1 MIP-2 TNF-α α ED-1+ cells/mm2 O.D. units (fold induction) 10 70 50 30 ctrl LPS 24h E2+LPS * * ** * * * * ** ** 10 3 CA ** ** ** * ** x x N T x DG PtC cgC A RhC PL Vegeto et al, PNAS 2001; Vegeto et al., Endocrinology 2006 Estrogen action in chronic neuroinflammation APP23 transgenic mice Swedish mutation Thy-1.2 APP b-amyloid Ab1-42 Ab1-40 • Neuron-specific expression of mutated APP • Age-dependent accumulation of amyloid deposits •Neuroinflammatory signs Sturchler-Pierrat et al, 1997 Microglia phenotype in the APP23 mice Microglia phenotype at amyloid deposits Experimental design < 5m 10m a c b 14m Ovx E2 or placebo Non-inflammatory plaques 100 Inflammatory “I” plaques Hypertrophic “HI” Plaques * 80 60 I-plaques HI-plaques * 40 20 ° Sham Ovx Ovx+E2 10 months Amyloid deposits Sham Ovx 14 months Ovx+E2 N°/mm2 (%vs total) Inflammatory plaques Microglia reactivity 70 60 50 40 30 20 10 Sham Ovx Ovx+E2 Estrogen and neuroinflammation Riassunto dei risultati - I macrofagi sono cellule bersaglio dell’azione degli estrogeni - La rimozione di E2 circolanti facilita l’attivazione dei macrofagi cerebrali (in modelli di neuroinfiammazione acuta e cronia), mentre la somministrazione di E2 ritarda questo evento - Solamente il recettore ERα è coinvolto La ricerca attuale Espressione e attività di ER nel sistema dell’immunità innata – Qual è il meccanismo molecolare dell’azione di ERα nei macrofagi? – la diversità di genere nella predisposizione e reattività verso patologie su base infiammatoria sono dettate dagli estrogeni? (durante lo sviluppo?) – Come si modifica l’interazione fra ER e sistema immunitario durante l’invecchiamento? e in menopausa? [email protected]
