PAS – Percorsi Abilitanti Speciali
Classe di abilitazione A057
Scienza degli alimenti
Tracciabilità genetica degli alimenti
Ingegneria genetica
nelle piante
Edomi – PASA057 Genetica
1
Struttura del DNA
Edomi – PASA057 Genetica
Flusso dell’informazione genetica
Edomi – PASA057 Genetica
Promotore eucariotico
elemento
(scatola: box)
sequenza
posizione
TATA
TATAAA
-30
CAAT
GGCCAATCT
-80
GC
GGGCGG
da -100
Paolo Edomi - Genetica
Edomi – PASA057 Genetica
4
Il codice genetico
4 nucleotidi
43 = 64
1 tripletta
1 aminoacido
20 aminoacidi
Paolo Edomi - Genetica
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5
Definizione funzionale di gene
un gene è una sequenza di DNA che codifica
per un polipeptide (o un RNA)
1 gene
: Edomi
1 polipeptide
Paolo
- Genetica
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6
Struttura dei geni e mRNA eucariotici
GENE
5’
ESONE 1
INTRONE 1
ESONE 2
INTRONE 2
ESONE 3
3’
TRASCRITTO
mRNA
struttura del gene
funzione del gene
5’ UTR
ORF
3’ UTR
Paolo Edomi - Genetica
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7
Vettori plasmidici
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Enzimi di restrizione
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Ligazione
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Clonaggio
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Trasformazione batterica
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Ricombinazione
omologa o generalizzata: crossing-over
non omologa o integrativa: trasposizione
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Clonaggio per ricombinazione
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Clonaggio nelle piante
• finalità
– proprietà
– resistenza
– consumo
• piante transgeniche (transgene)
– capacità di rigenerazione (vs cell animali)
– trasformazione in planta (embrioni, semi, polline)
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Tipologie di clonaggio
• 3 tipi
– vettori basati su plasmidi di Agrobacterium
– trasferimento diretto
– vettori virali
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Agrobacterium tumefaciens
•
•
•
•
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plasmide tumorigenico Ti
batterio del suolo
crown gall
dicotiledoni
Ciclo di Agrobacerium
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Plasmide Ti e T-DNA
•
•
•
•
•
•
•
•
•
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plasmide Ti 200 kb
geni infettivi
geni tumorali (T-DNA)
T-DNA (23 kb): integrazione per
ricombinazione non-omologa
geni per tumore (citochina,
auxina)
opine: derivati degli aa,
vantaggio selettivo per
Agrobatteri
sequenze confine: integrazione
stabile
geni virulenza vir
ori
Plasmide Ti come vettore
•
•
•
•
plasmide Ti come vettore
rimozione geni tumorali dal T-DNA
inserto tra regioni confine
problema: grandezza (siti,
manipolazione)
• 2 strategie
– vettori co-integrazione
– vettori binari
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Vettori di co-integrazione
• ricombinazione
tra plasmide (di
clonaggio) e
plasmide Ti in
Agrobacterium
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Vettori binari
• T-DNA modificato per clonaggio +
• plasmide Ti senza T-DNA
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Selezione di plasmidi Ti
• resistenza ad antibiotici (kanamicina)
• resistenza ad erbicidi (csr-1 di Arabidopsis,
acetolattato sintetasi)
• incubazione di tessuto fogliare con
Agrobacterium ricombinante (lesioni nel
prelievo)
• selezione in terreno con citochine (crescita),
ampicillina (eliminazione dei batteri),
kanamicina (piante trasformate)
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Trasformazione con
Agrobacterium
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Problemi nell'uso di Agrobacterium
• monocotiledoni
– resistenti (lignificazione delle lesioni)
– utilizzo di sostanze chimiche o embrioni (divisione
cellulare agevola integrazione)
• espressione
–
–
–
–
promotori forti (35S CaMV)
promotori tessuto specifici (semi)
effetto di posizione
numero di copie (silenziamento del transgene)
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Trasformazione diretta
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Trasformazione biolistica
• particelle di metallo (oro, tungsteno) rivestite
di DNA e sparate (gene-gun) nelle cellule (gas
ad alta P, scariche elettriche)
• destino complesso del DNA: inserzione
casuale in copie multiple
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Trasformazione di protoplasti
• senza parete (trattamento con pectinasi e
enzimi che degradano la cellulosa)
• ricrescita 10gg
• trasformati per trattamento chimico,
elettroporazione o con liposomi
• integrazione e selezione con marcatori
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Vettori virali
• Virus del mosaico del
cavolfiore:
– DNA circolare, ds, 8kb, 8 geni
– limite all'impaccamento (8,3 kb):
inserto da 1 kb
– intermedio a RNA (errori di
replicazione)
– poche specie
• Geminivirus:
– DNA ss, replica ds
– ma: riarrangiamenti, delezioni
• Virus del mosaico del tabacco
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– genoma a RNA
Ingegnerizzazione di cloroplasti
• genoma plastidico: circolare, ds, geni in
operoni, policistroni
• poliploidi, migliaia di cloroplasti: alti livelli di
espressione
• non nel polline
• inserzione per ricombinazione omologa:
regioni di omologia di almeno 400 bp
• promotori e terminatori cloroplasto-specifici
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Selezione di cloroplasti trasformati
• aadA: resistenza alla spectinomicina (inibitore
della sintesi proteica in batteri e cloroplasti)
• kanamicina: questione del trasferimento
orizzontale
• BADH (betaina aldeide
deidrogenasi): trasforma
la aldeide betaina (tossica)
in glicin-betaina (innocua)
• rimozione di marcatori con
Cre-lox
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Trasformazione di cloroplasti
• metodi biolistici (per
la doppia membrana)
• induzione
dell'omoplasmia
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Manipolazione di cloroplasti
• ampio utilizzo
– resistenza a erbicidi, insetti, siccità
– produzione di farmaci
– produzione in piante commestibili
• forma attiva della proteina
• espressione di più geni (operoni)
– incrocio di piante transgeniche diverse
– 3 geni di Bt
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Piante transgeniche
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Ingegneria genetica nelle piante
• aggiunta di un gene
• sottrazione di un gene
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Resistenza a insetti: Bt
• OGM per gene cry
di Bacillus thuringiensis
cristalli citoplasmatici
solubili solo nell'intestino
(pH 9,5) di larve di
lepidotteri
•
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La proteina Cry di Bt
• pro-tossina → deltaendotossina, 60 kDa:
squilibrio ionico, lisi
cellulare, pH minore
e sporulazione
• uso in campo
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Il caso del mais
• CryIA(b)
• trasformazione di
embrioni mediante
biolistica
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Il caso del tabacco
•
•
•
•
CryIIA(a2)
effetto anche su ditteri
trasformazione di cloroplasti
45% delle proteine totali
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Resistenza a erbicidi
• glifosolato:
– inibitore della sintesi di
aa aromatici
– blocca la EPSPSasi
• 1) sovraespressione della
EPSPSasi
• 2) EPSPSasi mutata
• piante Roundup ready
• ma: eccesso di erbicidi
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Alternativa alle piante roundup ready
B. licheniformis
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La tecnologia antisenso
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Maturazione ritardata
• pomodori: molti geni implicati
• poligalacturonasi (della parte cellulare del
pericarpo): rende soffice la parete
• ritardare azione dell'enzima: maturazione più
lenta
• utilizzo di sequenze antisenso al 5' sotto
controllo del promotore 35S del CamV in
Agrobacterium: riduzione del 6%
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Pomodori OGM FlavrSavr
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Resistenza a virus
• principio della resistenza alla sovrainfezione
• espressione di proteine del virus impedisce
l'infezione
• ma: altri virus possono ancora infettare
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Resistenza a funghi
• espressione di proteine anti-fungine
• es: piante di tabacco esprimenti la chitinasi del
fagiolo sotto promoteore 35S del CaMV
crescono in presenza del fungo Rhizoctonia
solani, in quanto la chitinasi idrolizza la chitina
della parete cellulare del fungo
•
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La tecnologia terminator
inibizione della
sintesi proteica
per inattivazione
dei ribosomi
piante normali, semi sterili
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