Strategie per il miglioramento
delle procedure di valutazione del
rischio da fitofarmaci
Annamaria Colacci
Centro Tematico Regionale
Cancerogenesi Ambientale e
Valutazione del Rischio
ARPA-ER
Sicurezza Alimentare: Problemi Emergenti 27 maggio
2009
Alcune riflessioni critiche…..
• I pesticidi sono testati
adeguatamente per garantire la
sicurezza del consumatore?
• L’uso proposto di un pesticida e’
accettabilmente sicuro
CTR CAVR
Sicurezza Alimentare: Problemi Emergenti 27
maggio 2009
• La tossicologia applicata ai
pesticidi e un processo per
determinare i potenziali effetti
avversi per operare una stima
del rischio come parte del
processo regolatorio di
autorizzazione
CTR CAVR
Il concetto di “no adverse effect level”
• La tossicologia si basa sulla relazione
dose-effetto
• Pur considerando le variabilita’ di
specie, definisce che per ogni specie
esiste una dose di non effetto
• Per identificare quale sia tale dose
nell’uomo ci si basa su studi su
specie differenti per effettuare
predizioni di rischio, mediante
estrapolazione del dato
CTR CAVR
Linee guida OCSE
• Test tossicita’ acuta Linee guida OCSE 402
• Test tossicita’ a breve
termine a dose ripetuta
(tossicita’ subcronica)
• Test tossicita’ a lungo
termine a dose ripetuta
Linee guida OCSE
(tossicita’ cronica)/test
451 – 452 -453
di cancerogenesi
• Test tossicita’
riproduttiva
• Genotossicita’
• Studi specialistici
CTR CAVR
Finalita’
• Accertare il livello
accettabile di
esposizione per
l’operatore
• Accertare il livello
accettabile di
esposizione per il
consumatore
CTR CAVR
• AOEL
– Acceptable Operator
Exposure Level
• ADI
– Acceptable Daily
Intake
No adverse effect level
La determinazione del NOEL/NOAEL
è il primo passo per arrivare
all’individuazione dei livelli di dose
accettabili per l’uomo
Livelli di dose accettabili
• NOEL
– no observed effect level
• NOAEL
– no observed adverse effect level
• LOEL
– lowest observed effect level
• LOAEL
– lowest observed adverse effect
level
La determinazione del NOAEL
285
280
275
270
Peso
265
260
255
250
0 ppm
CTR CAVR
10 ppm
100 ppm
1000 ppm
Livelli di dose accettabili
Dose in mg/kg p.c./giorno
ALTA
LOAEL = LOEL
LOEL
NOAEL = NOEL
NOEL
BASSA
Le dosi sperimentali
NOAEL, LOAEL
• NOAEL
– No observed
adverse effect
level
Sicurezza Alimentare: Problemi Emergenti 27
maggio 2009
Dose sperimentale e esposizione
umana
Dati
sperimentali
RESPONSE
Esposizione
umana
Sicurezza Alimentare: Problemi Emergenti 27
maggio 2009
Calcolo ADI
NOAEL
= ADI
SF
Livelli di dose accettabili
• ADI
– acceptable daily intake (dose
giornaliera accettabile)
• TDI
Reference
Dose
– tolerable daily intake (dose
giornaliera tollerabile)
10
10
0 - 10
SAFETY FACTOR (fattore di sicurezza)
• fattore arbitrario per l’estrapolazione
dei dati
• Consente di sopperire all’incertezza
legata a:
• interpolazione nella curva dose-effetto
• condizioni del gruppo di animali
nell’esperimento
• differente metabolismo e tossicocinetica
SAFETY FACTOR (fattore di sicurezza)
• SAFETY FACTOR
(fattore di sicurezza)
– Fattore 10
• dati sufficienti da esposizione umana subcronica o cronica
per il calcolo del NOEL
• dati concordanti di tossicità in altre specie
– Fattore 100
• dati sufficienti di tossicità cronica in una o più specie di
animali per il calcolo del NOEL
• buone informazioni per esposizioni croniche o subcroniche
nell’uomo sufficienti per identificare un LOEL
– Fattore 1000
• dati limitati o incompleti di tossicità subcronica e cronica
nell’animale
• possibilità di identificazione del solo LOAEL in più specie
animali
2 principi fondamentali
• L’esposizione non deve eccedere
una predeterminata dose
accettabile derivata dalla dose a
cui non si osservano effetti
avversi
• ALARA
– As low as reasonable achievable
E’ sufficiente tutto cio’?
• Ulteriori valutazioni
– ARD
• Acute Reference Dose
– Dose assunta in un solo pasto
– TMDI / NTMDI
• Theoretical Maximum Daily Intake
• National Theoretical Maximum Daily Intake
| consumogiornaliero(mg / persona / giorno) × MRL(mg / giorno) |
∑
TMDI =
pesocorporeo(kg )
Es clorfenvinfos
Alimento
Consumo
(kg/persona/
giorno)
MRL
NTMDI
Latte vaccino
0.603
0.008
0.0048
Frattagle di
bovino
0.00011
0.1
0.000011
Carne bovina
0.0145
0.2
0.0029
Frattaglie di ovino
0.00001
0.1
0.000001
Carne di ovino
0.00279
0.2
0.00056
Patate
0.0656
0.05
0,0033
Totale
mg/persona
Totale mg/kg
0.0116
% ADI = 0.0005
mg/kg
35%
0,000173
Punti critici
• Calcolo ADI
– Differente a seconda dei parametri
considerati, del fattore di sicurezza
attribuito
Punti critici
• Calcolo MRL
– Non tiene conto di tutti i possibili
fattori che possono influenzare i
residui
• Trasporto
• Conservazione/stoccaggio
• Processi per la commercializzazione
• Processi per l’utilizzo
– Lavaggio
– cottura
Punti critici
• Identificazione residuo
– Limiti di rilevabilita’
• Calcolo esposizione
– Mancanza di dati statistici
– Differenze territoriali anche in
ambito nazionale
Punti critici
• Rischio aggregato
– Possibilita’ di effetto avverso da
esposizione allo stesso principio da
piu’ fonti
• Rischio cumulativo
– Possibilita’ di effetto avverso da
esposizione da tutte le fonti di
esposizione a un gruppo di
sostanze che condividono lo
stesso meccanismo d’azione
Occupazionale
e ambiente
indoor di lavoro
Ambiente
indoor casa
Medicinali per
uso umano e
veterinario
Alimentazione
Attivita’ ricreazionali
Sicurezza Alimentare: Problemi Emergenti 27
maggio 2009
Punti critici
• Esposizione a contaminati di
origine naturale
– Es. micotossine
Le nuove tecnologie al servizio della
valutazione del rischio
• Tossicogenomica
– Definita come l’applicazione delle
tecnologie genomiche
• Genomica sequenziale
• Trascrittomica
• Proteomica
• Metabonomica
• lipidomica
Perché l’approccio di tossicogenomica?
• Tossicologia predittiva
– Cosa è
• studio di come gli effetti tossici osservati in sistemi
modello o nell’uomo possono essere usati per
predire la patogenesi, fare stime di rischio e
prevenire l’insorgenza di malattie nell’uomo
malattia nell’uomo
– Cosa si prefigge
• Migliorare la stima di rischio
– Il compito della tossicogenomica
•
•
•
•
•
•
Migliora
la comprensione delle correlazioni dose-risposta
L’estrapolazione interspecie
La quantificazione dell’esposizione
La identificazione dei meccanismi di azione
La valutazione delle suscettibilità individuali a un
particolare composto
La basi della tossicogenomica
Variazioni in
molecole chiave
Interazione
dell’agente esogeno
con le molecole
cellulari
PATOLOGIA
Risposta di difesa e
controllo del danno
Alterazione in
gene/proteina/metabolita
chiave
FINGERPRINT
PREDIZIONE TOSSICITA’
Le metodologie di studio dell’era postgenomica
• Le tecnologie biomiche
– Genomica
• Analizza le modificazioni lungo il genoma
– polimorfismi
– Genomica funzionale o Trascrittomica
• Utilizza l’RNA per comprendere le
modificazioni trascrizionali dei geni
– Livello di espressione genica
– Proteomica
• Analizza le modificazioni globali delle proteine
cellulari
– proteoma
– Metabonomica o metabolomica
• Analizza le modificazioni dei metaboliti
DNA
catalogo di
tutti i geni
in un
organismo
RNA
genoma
trascrittoma
catalogo di tutti gli mRNA
in un organismo
proteoma
PROTEINE
catalogo di tutte le proteine espresse
in un organismo
metaboloma
METABOLITI
catalogo di tutti i metaboliti in un organismo
interattoma
Tutte le interazioni Proteine-DNA,
Proteine-RNA, Proteine-Proteine
DNA
40000 geni
RNA
30000 trascritti
PROTEINE
8000 proteine funzionali
METABOLITI
2000 identificati
INTERAZIONI
?
Data Mining
GENOMICA
TRASCRITTOMICA
METABONOMICA
PROTEOMICA
BIOINFORMATICA
BIOLOGIA DEI SISTEMI
DNA
Traslocazioni geniche
Modificazioni istoniche
Metilazione DNA
Riparo DNA
Numero di copie gene
Attivazione trasposoni
Farmaci
Pesticidi
PCB, diossine
IPA
Contaminanti aria
Metalli pesanti
Ormoni
Fenoli
Nutrizione
Comportamenti
parentali
Trascrizione
RNA
PROTEINE
Stabilità RNA
Splicing alternativo
Retrotrasposoni
Fattori Trascrizione
Degradazione proteine
Ereditarietà
Sviluppo
Crescita
invecchiamento
Cancro
Obesità
Diabete
Sterilità
Malattie respiratorie
Allergie, risposta immunitaria
Disordini neurodegenerativi
Stress
Ambiente Antropico
•Trattamenti chimici
•Inquinamento
Componente Genetica
Alimento
Stili di Vita
•Fumo
•Alcool
Ambiente Naturale
•Suolo
•Microclima
Esposizioni
•Professionali
•Ambientali
Componente Genetica
Soggetto
I nuovi approcci
• Committee on Environmental
Exposure Technology
Development
– Toolbox di metodi che possono
essere utilizzati da soli o in
combinazione per incrementare la
stima dell’esposizione e l’impatto
sulla salute
VALUTAZIONE
DELL’ESPOSIZIONE
PERSONALIZZATA
Fonte: Weis at al.
Env. Health Perpsect. 113, 2005
L’utilizzo della trascrittomica nel
laboratorio MATER
Agilent Human 1A Oligo Microarray (V2)
comprendenti 40.000 oligonucleotidi 60mer, rappresentativi di 38.716 geni umani
controllo
trattato (esposto)
m-RNA
m-RNA
ibridazione
lavaggio
scanner
Piattaforma Agilent
• Un laser SHG-YAG
(532nm) e un laser a
Elio-neon (633nm),
per eccitare i
fluorocromi Cy3 e
Cy5.
• Carosello a
• 48 posizioni
• Sistema distintivo di
continua messa a
fuoco automatica dei
laser sul piano esatto
del campione durante
la scansione
• Software di Feature
Extraction
LABORATORIO MATER – ARPA Bologna
Il progetto MITICA: un esempio di
approccio integrato per lo studio di
problemi complessi
Sviluppo di strumenti diagnostici innovativi per la rapida
identificazione di classi di contaminanti in matrici alimentari
…..il problema complesso….
• Micotossine con effetti di
interferenza endocrina
La multi-esposizione
• 91 fitofarmaci sospettati o
confermati essere interferenti
endocrini
• Effetti su specie animali evidenti
• Esposizione umana a basse dosi
– Body burden allo stesso livello di altre
specie animali
SAGGIO DI VITALITA’- LINEE CELLULARI
Linea cellulare
MCF-7
HepG2
T47D
Tempo di
raddoppiamento
(hr)
Assetto recettoriale
Adenocarcinoma
mammario,
Differenziate,
Non metastatiche
61
Risposta funzionale
agli estrogeni positiva;
mRNA per ER α
mRNA per ER β
Carcinoma
epatocellulare
35
Recettori per l’insulina
e per l’IGF II
32
Recettori per gli
androgeni, gli
estrogeni,progesterone
e recettore Ah
Caratteristiche
Adenocarcinoma
mammario,
metastatiche
EFFETTI CITOTOSSICI E TRASFORMANTI IN CELLULE BALB/c 3T3
ENDPOINT
Citotossicità
Dose saggiata
Dose minima
efficace (a)
0.1 – 20 µM
0.5 µM
0.1 – 20 µM
0.1µM
0.1 – 60 µM
30 µM
10 nM – 40 µM
NS
0.1 – 500 µM
100 µM
Composto
A1260
PCB-Mix
Fumonisina
Zearalenone
Penconazolo
Trasformazione
Dose saggiata
Dose minima
efficace (a)
0.5 - 20
20 µM
0.5 - 20
20 µM
ND
ND
NS
NS
NS
NS
(a) Dose minima che indotto effetti significativi. NS = nessun effetto significativo; ND = non determinato
FUMONISINA B1
Non trasformante fino a 1.36 mM
Trasformante in BALB/c 3T3
Potenza cancerogena inferiore di un ordine di grandezza rispetto a AFB1
PROCIMIDONE
AFLATOSSINA M1
SAGGIO DI VITALITA’- CALCOLO DELLA GI50
Modello Cellulare
MCF7
Composto
A1260
(0.001 - 100 µM)
T47D
HepG2
24h
48h
72h
6g
24h
48h
72h
6g
2
10
5
4
12
18
19
17
18
25
28
24
233
214
111
3
PCB-Mix
(0.001 - 100 µM)
Fumonisina
138
(0.1-60 µM)
Zearalenone
Aflatossina M1
Penconazolo
(0.01 - 500 µM)
NS = nessun effetto significativo
72h
6g
499
3
0.16
(0.01-5 µM)
(0.01 - 500 µM)
48h
17
(0.002-20 µM)
Procimidone
24h
0.36
0.31
0.15
NS
NS
NS
NS
36
40
22
NS
NS
13
14
ATTIVITÀ ESTROGENICA
IN CELLULE T47D
Composto
A1260
PCB-Mix
Fumonisina
Zearalenone
Penconazolo
Procimidone
Risultato in EScreen
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
ZEARALENONE
Dose minima
efficace
NS
NS
NS
1.8 nM
NS
NS
RPE = 0.025
Zearalenone: una micotossina a
interferenza endocrina
– Zearalenone (ZEA), noto
anche come RAL e
micotossina F-2
• è un potente metabolita ad
azione estrogenica
prodotto da alcune specie
di Fusarium. ed in
particolare F.
graminearum, F. culmorum
e F. equiseti,
• Lo zearalenone,
chimicamente è il lattone
dell’acido resorciclico , e i
suoi principali metaboliti
sono l’alfa ed il beta
Zearalenolo
Lo studio dell’attivita’ endocrina:
Saggi preliminari su T47D
• T47D
– Adenocarcinoma mammario
– Esprime diversi recettori
• Estrogeni, androgeni, calcitonina, prolattina
• Test di vitalità (MTT)
– GI50, concentrazione in grado di indurre il 50 % di inibizione
della crescita:
• (T-To) / (C-To) x 100
• E-screen
– effetto proliferativo (PE), rapporto tra i valori di assorbanza
del crystal violetto nel trattato e nel controllo dopo 5 gg di
crescita in terreno de-estrogenato e siero trattato con CD.
∆∆ ) di
• Espressione genica mediante real time PCR (2∆∆Ct
marcatori di pathway:
– PDZK, estrogeni
– CYP1A1, recettore arilico (AhR)
VALUTAZIONE DELLA MODULAZIONE TRASCRIZIONALE
• MARCATORI DI PATHWAY
– gene PDZK (pathway degli estrogeni)
• DOSE
– Zearalenone2nM
• CONTROLLO POSITIVO
– 17 beta estradiolo
10 nM
• DURATA DEL TRATTAMENTO
– 4h
– 16 h
T47D: gene PDZK
6
**
4 ore
2^-∆∆Ct
16 ore
4
*
2
0
DMSO
E2
MetOH
Zea
Studio in microarray
1.Trattamento della linea MCF-7 con 20
μM ZEA per 72 h
2.Estrazione e purificazione dell’RNA
totale
3.Linear amplificatione sintesi di cRNA
fluorescente
4.Lavaggi e scansione delle slide
5.Analisi mediante il
softwareFeatureExtraction
6.Elaborazione dati
7.Interpretazione biologica
DISEGNO SPERIMENTALE
Marcatura
dell’RNA
Fluorofori utilizzati: Cy3 (570 nm) e Cy5 (670 nm)
verde
rosso
Slide diretta: controllo marcato con Cy3 trattato marcato con Cy5
Replica in dye-swap: scambio dei fluorofori
(controllo-Cy5, trattato-Cy3)
ANALISI dell’RNA ESTRATTO
Campioni: trattato con ZEA e non trattato (controllo)
QUANTIFICAZIONE
Lettura allo spettrofotometro
(260 e 280 nm)
Calcolo della concentrazione
(µg/ml)
Controllo
CONTROLLO QUALITA’
Analisi al Bionanalyzer Agilent
2100
Profili qualitativi
Trattato
Dalla LINEAR AMLIFICATION alla scansione
Materiale di partenza
1) Retrotrascrizione
2) Trascrizione e
marcatura con Cy3
e Cy5
3) Purificazione
4) Quantificazione
dell’incorporazione
di fluorescenza
Prodotti
Mix dei prodotti
Ibridazione su slide
Scansione slide
Analisi trascrizionale: microarray
Whole-genome slide
Estrazione
dell’RNA
T47D trattate 4h
con il composto
in esame
Modulazione di pathway coinvolti nella
risposta estrogenica
• Significativamente modulata la
categoria del legame ai recettori per gli
estrogeni
– NRIP1 (nuclearreceptorinteractingprotein1)
• cofattore attivato dal recettore per gli estrogeni
con un ruolo importante nella modulazione
negativa dell’ espressione del recettore
– RERG (raslikeestrogenregulatedgrowthinhibitor).
• inibitore della proliferazione cellulare in linee di
carcinoma mammario ER-positive
• altri marcatori del pathway di risposta
agli estrogeni
• PDZK1, HSP27, GREB1 e catepsinaD che sono
risultati tutti up-regolati.
ZEARALENONE
2 nM
(IE)
50 nM
10 nM
(≈LMR)
100 nM
NT
N° dosi = 4
Ringraziamenti
• Caratterizzazione
micotossine
– Cecilia Bergamini
• Tossicologia
sperimentale
– Monica Vaccari
– Stefania Perdichizzi
– Francesca Rotondo
• Tossicogenomica
– Paola Silingardi
– Elena Morandi
– Maria Grazia
Mascolo
……un ringraziamento particolare a…..
• Luciana Prete
– …..per le idee, le animate
discussioni, il coraggio di rompere
gli schemi e….
– …per aver fortemente contribuito a
mandare il procimidone in soffitta
XENOBIOTICO
reazione con DNA?
SI’
GENOTOSSICO
NO
NON GENOTOSSICO
reazione con recettore?
• Dose soglia improbabile
• L’effetto dose-risposta può essere
influenzato dalla proliferazione
cellulare
SI’
PROLIFERAZIONE
• Dose soglia discutibile
• Effetti a basse dosi
Sicurezza Alimentare: Problemi Emergenti 27
maggio 2009
NO
PROLIFERAZIONE
• Dose soglia probabile
• Effetti correlati alla tossicità e
proliferazione
