Genetica dei microrganismi 3

Genetica dei microrganismi 3
2
In questo caso il filtro poroso
non eliminava lo scambio,
indicando l’esistenza di un
fattore diffusibile DNasi
resistente
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
3
Trasduzione generalizzata
Figura 10.14
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
4
Trasduzione generalizzata
 Durante la fase di impacchettamento del genoma virale nel capside, frammenti del
cromosoma batterico vengono inseriti per errore. Una nucleasi può riconoscere
siti pac simili a quelli fagici sul cromosoma batterico, dando origine alle particelle
transducenti. La quantità di DNA trasportabile dipende dalla grandezza del
capside (1% del genoma batterico corrispondente a circa 39kb con P22 di S.
typhimurium, 2,5% del genoma batterico con P1 di E. coli, corrispondente a
90kb). Quando le particelle virali iniettano il DNA in un nuovo batterio, non sono
in grado di determinare un’infezione litica. Questo fago viene denominato
particella trasducente generalizzata. Il DNA a doppia elica viene iniettato nella
cellula e qui può integrarsi (trasferimento genico stabile), essere degradato
oppure rimanere per un periodo nel citoplasma ed esprimersi. In questo ultimo
caso si parla di trasduttanti abortivi e sono parzialmente diploidi.
 La trasduzione generalizzata può essere effettuata sia da fagi temperati che litici;
in genere si usano mutanti int-, incapaci di entrare nello stato di profago, e HT,
che riduce la specificità dell’endonucleasi che agisce sul sito pac
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
5
Trasduzione specializzata: fago lambda
L’ integrazione (attPXattB) e l’excisione
(attLXattR) di lambda dal cromosoma
avvengono attraverso un processo di
ricombinazione sito-specifica.
L’integrazione di lambda nel cromosoma
è catalizzata dal prodotto del gene int
(integrasi). L’integrasi si lega a specifici
siti del cromosoma del fago (attP) e del
batterio (attB) e catalizza la
ricombinazione tra questi siti. L’excisione
del profago lambda dal cromosoma
richiede i prodotti genici di int e xis
(excisionasi. Per l’ excisione, l’integrasi e
l’excisionasi si legano a siti specifici a
sinistra (attL) e a destra (attR) del profago
e catalzzano la ricombinazione tra questi
due siti. Sia l’integrazione che l’excisione
richiedono i prodotti dei geni batterici
himA e himD (IHF = integration host
factor). Normalmente l’integrazione e
l’excisione sono eventi efficienti e precisi.
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
6
Trasduzione specializzata: fago lambda
attP
attL
attR
attB
attL
attR
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
7
Formazione di un fago lambda trasducente λbio
 Poiché il genoma di lambda è
impacchettato
con
un
meccanismo detto “testa piena”, i
fagi trasducenti specializzati che
portano piccole regioni del
cromosoma batterico mancano
della corrispondente quantità di
DNA fagico. La porzione di DNA
fagico mancante corrisponde alla
parte opposta del genoma del
profago. Fagi che portano i geni
bio localizzati sulla parte destra
del profago, mancheranno dei
geni richiesti per le funzioni
lisogene (es.. il gene int) che sono
localizzati nella porzione sinistra
del profago.
http://www.life.uiuc.edu/micro/316/topics/phage/lambda-bio.html
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
8
Formazione di un fago lambda trasducente λdgal
 Fagi che portano i geni gal
localizzati sulla parte sinistra del
profago mancheranno dei geni
richiesti per la funzione litica (es.
i geni della coda) che sono
localizzati nella parte destra del
fago.
 I fagi dgal) sono efficienti per la
lisogenia, ma deficienti per la lisi.
Questi fagi, per portare a
termine la lisi della cellula ospite,
richiedono un fago helper (es. un
fago lambda wild-type che
fornisca le funzioni mancanti in
trans), La lettera "d" scitta
prima di gal indica che il fago è
difettivo per la crescita litica.
http://www.life.uiuc.edu/micro/316/topics/phage/lambda-bio.html
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
9
Trasduzione specializzata
Mentre il fago normale ha il sito att completo, le particelle trasducenti difettive hanno
un sito di integrazione ibrido non funzionale che ha origine in parte dal DNA
batterico e in parte da quello del fago. Per questo motivo l’integrazione del fago
difettivo non avviene facilmente. Tuttavia, dei trasduttanti stabili possono derivare
dalla ricombinazione tra il cromosoma del fago e quello del batterio in seguito a un
doppio crossing-over su entrambi i lati del sito gal.
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
10
Formazione di lisati LFT e HFT
Fagi trasducenti specializzati sono
formati mediante un excisione aberrante
di un profago lambda. Questo evento è
molto raro se comparato alla normale
excisione tra i siti attL e attR. L’excisione
aberrante avviene con una frequenza di
10-6 ed, in questo caso, si parla di "Low
frequency transducing lysate" o LFT.
Se questo fago trasducente specializzato
coinfetta un nuovo ospite con un fago
selvatico (fago helper), si otterrà un
dilisogeno. L’induzione di un dilisogeno
a lisare, porterà ad un lisato contenente
il 50% di fagi trasducenti specializzati e
50% di fagi wild-type.
Questo lisato viene denominato un lisato
ad alta frequenza di trasducenti ovvero
"High frequency transducing lysate" or
HFT.
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
11
Elementi trasponibili
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
12
Elementi trasponibili
 Elementi genetici mobili - si muovono da un luogo del genoma
ad un altro.
 Trovati in tutti gli organismi studiati fino ad ora.
 Effetti:
 L’inserimento vicino o entro un gene può determinarne
l’attivazione o l’inattivazione.
 Possono causare delezioni, inversioni e traslocazioni del
DNA.
 Possono portare a rotture del cromosoma.
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
Elementi trasponibili che si muovono
attraverso intermedi a DNA
 Sequenze di inserzione batteriche:
 IS
 Sono lunghe da 700 a 1500 bp
 Hanno sequenze ripetute ed invertite alle estremità.
 Codificano per una trasposasi.
 Causano ripetizioni nel cromosoma dove si inseriscono.
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
13
Elementi trasponibili che si muovono
attraverso intermedi a DNA
14
 Trasposoni composti batterici:
 Hanno sequenze ripetute ed invertite alle estremità.
 Codificano per una trasposasi.
 Codificano per un marcatore di resistenza (es. resistenza ad un
antibiotico).
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
Elementi trasponibili che si muovono
attraverso intermedi a DNA
 Trasposoni che mancano di ISs terminali: TnA family
(Tn3)
 TnA family (Tn3): trasposasi + resolvasi
Tn3 è come una grande IS
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
15
16
Elementi IS e
trasposoni
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
17
Ricombinazione tra due sequenze
vicine identiche (e.g trasposoni)
porterà a riarrangiamenti
 Delezioni se le ripetizioni sono nello stesso
orientamento
 Inversioni se le ripetizioni sono in orientamento
opposto
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
18
Conseguenze
della
ricombinazione
tra due
trasposoni
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
19
Caratteristiche degli elementi Ty
(trasposoni di lievito)
 1. Circa 35 copie per cellula
 2. Circa 340bp ad entrambe le estremità in orientamento diretto chiamate long
terminal repeats or LTRs o elementi δ.
 3. Somiglianza con i retrovirus eucariotici; poiché mancano di alcune funzioni
retrovirali sono da considerare “retrovirus primitivi” a causa di questa
somiglianza vengono chiamati retrotrasposoni
 4. La trasposizione coinvolge un intermedio a RNA generato dalla trascrizione
dell’elemento Ty; una trascrittasi inversa fa una copia DNA dell’elemento che
è inserito in un nuovo sito del genoma.
 La frequenza di trasposizione è di 1/104 generazioni.
 Un’importante differenza con i retrovirus è l’assenza di particelle infettive
(manca il gene env). Si formano comunque delle particelle simili a virus
denominate VLPs (virus like particles)
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
20
La trasposizione di
Ty coinvolge un
intermedio a RNA
http://www.cbs.dtu.dk/dave/roanoke/genetics43.html
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
21
Confronto tra genoma retrovirali e
retrotrasposoni
Contrariamente ai virus, i trasposoni non hanno un ciclo vitale al
di fuori dell’ospite
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
22
tRNAMet
http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biology/11_Retroposons.htm
PB: primer binding site
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
23
http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biology/11_Retroposons.htm
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
Gli effetti degli elementi trasponibili
dipendono dalla loro localizzazione
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
24
25
L’inserzione di Ty in un promotore può
aumentarne l’espressione
 SPIEGAZIONE
 Le sequenze fiancheggianti degli elementi mobili contengono
promotori forti.
 Questi aumentano l’espressione genica fornendo segnali d’inizio
della trascrizione molto più efficaci e, qualche volta, in modo
meno stringente.
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
26
Come viene regolata la velocità di
trasposizione?
 I Ty sono di solito inseriti in regioni di eterocromatina trascrizionalmente
inattive (Ty5) o nei promotori di tRNA (Ty3).
 L’analisi della sequenza nucleotidica delle LTR di Ty5 ha messo in evidenza
la presenza di sequenze simili a quelle presenti nei promotori dei geni di
risposta ai feromoni (PRE).
 Effettivamente è stato dimostrato che in cellule trattate con il feromone, si ha
un induzione della trascrizione di Ty5 e, analogamente, in cellule diploidi si
ha una repressione dell’espressione di Ty5.
 Questo tipo di risposta è stato messo in evidenza anche per altri Ty, ma non
in tutti.
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
27
Qual è il significato biologico dei
trasposoni?
 Fonte di mutazioni
 Ripetizioni vicine forniscono regioni per un crossing-over
ineguale
 Gli elementi genetici mobili potrebbero essere alla base
dell’origine degli introni
 La ricombinazione tra introni di geni non correlati può
determinare la formazione di nuove proteine (exon shuffling).
MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni