Flavescenza dorata (FD)
Malattia da quarantena
Patogeno:
Candidatus Phytoplasma vitis: un batterio intracellulare obbligato che può essere studiato solo
all’interno dell’ospite: pianta o insetto
Trasmissione:
vettore specifico Scaphoideus titanus Ball (Homoptera: Cicadellidae)
Sintomi :
arrossamenti e giallumi, accartocciamento delle foglie, mancata lignificazioni dei tralci,
disseccamento del grappolo
Recovery: remissione naturale dei sintomi dopo che è avvenuta l’infezione
Malattia: risultato di interazione ospite-ambiente-agente causale
Pianta ospite
Ambiente
Vettore
Patogeno
Scaphoideus titanus
Fitoplasma
Infezione
Approccio di studi integrato
Flavescenza dorata
Genomica: Insieme delle informazioni genetiche. Le sequenze di DNA vengono annotate per l’identificazione
di geni e altre porzioni di sequenza significative
Trascrittomica: Insieme di tutti i trascritti (RNA messaggeri). Espressione dei geni che varia in funzione delle
necessità di cambiamento di un organismo e di stimoli ambientali
Proteomica: Insieme delle proteine presente in un organismo, tessuto o cellula
Metabolomica: l'insieme di tutti i metaboliti di un organismo biologico. Profilo metabolico può fornire
un'istantanea della fisiologia di quella cellula.
Studio dell’interazione fitoplasma-pianta ospite
con approccio proteomico
da: Graves and Haystead, 2002
Effetto biologico
Proteoma: insieme delle proteine derivanti dall’espressione del genoma
altamento complesso
dinamico nel tempo
dinamico nello spazio
Studio del proteoma = proteomica
Elettroforesi bidimensionale
+
Spettrometria di massa
pI
da Graves and Haystead, 2002
kDa
Estratti separazione delle proteine in base a pI e peso molecolare ed ottenimento di
mappe di espressione proteica
Analisi comparativa delle immagini
La proteina di interesse viene isolata dal gel e digerita in peptidi da una specifica proteasi.
La massa dei peptidi viene misurata dallo spettrometro di massa
Lo spettro di massa ottenuto viene comparato con lo spettro teorico delle proteine in
banca dati
Tesi in studio
Sano
Recovered
vs
Malato
vs
Nebbiolo
Barbera
Sano vs malato
Circa il 6% delle proteine risulta differenzialmente espresso in viti infette
rispetto alle sane. Queste proteine rappresentano un ampia gamma di
funzioni, le cui percentuali di appartenenza sono rappresentate dal grafico
Categorie funzionali delle proteine
Destinazione 18%
Trasporto 6%
Risposta a stress
42%
Sintesi 3%
Metabolism
Energy
Protein synthesis
Protein fate (folding, modification,
destination)
Cellular transport, transport facilitation
and transport routes
Cell rescue, defence and virulence
Energia 9%
Metabolismo 21%
Barbera vs Nebbiolo
Barbera
Sintesi 6%
Risposta allo stress 29%
Metabolismo 39%
Destinazione 9%
Energia 14%
Nebbiolo
Trasporto 6%
Risposta allo stress 43%
Destinazione 18%
Sintesi 3%
Metabolismo 21%
Energia 9%
Sano e infetto vs recovery
Infetto/Rec
Sano/Rec
Risultati
Approccio proteomico per la prima volta utilizzato
nello studio dell’interazione vite/fitoplasma
• ha dato delle indicazioni sulle profonde modificazioni che
avvengono nella pianta infetta
• ha individuato vie metaboliche particolarmente alterate
dall’infezione e che meritano approfondimenti
• ha individuato alcune differenze che contraddistinguono la pianta
risanata da quella sana, fornendo spunti di approfondimento per lo
studio del fenomeno del recovery
Alterazione della rete biologica della vite nel’interazione col fitoplasma
Proteome interaction networks
Biosynthesis of alkaloids and
plant hormones (auxin, SA)
Biosynthesis of
alkaloids
Pentose phosphate cycle
6-Phosphoglucolactonase
Metabolism of phenyl-propanoids
Isoflavone reductase
Chalcone isomerase
Anthocyanidine synthase
Glycolysis
Enolase
Pyruvate
Alcohol
decarboxylase dehydrogenase
Biosynthesis of aromatic
amino-acids
Biosynthesis alkaloids
Acetaldehyde
Jasmonic acid
biosynthesis
Ethanol
Fatty acids biosynthesis
Acetate
Cysteine synthase
Cysteyne peptidase
Cysteyne synthase
Terpenoids biosynthesis
Glioxylate cycle
Oxalyl-coA carboxilase
Aconitase
Isocitrate dehydrogenase
Biosynthesis of
plant hormones
(ethylene)
Sulphur metabolism
Cysteyne metabolism
Aceto-acetyl coA
Malate
dehydrogenase
Aconitase
Tricarboxylic acid
cycle
Aconitase
Isocitrate-dehydrogenase
Biosynthesis of alkaloids
Aminoacyl-peptidase
Nitrogen assimilation
Glutamine synthetase
Metabolismo dei flavonoidi
Antiossidanti
Hanno un ruolo critico nella qualità del vino
Hanno un ruolo di protezione nelle piante in condizioni di stress: tolleranza ai
cambiamenti climatici, resistenza alla siccità, difesa dagli erbivori, attività
antimicrobica
Antociani
Flavonoli
Analisi biochimiche
Spettofotometro
HPLC
Tannini
Analisi dei trascritti
qRT-PCR
Flavonoid pathway
Myb1F
Myb1A
15 giugno
S
R
I
20 Luglio
S
R
I
3 repliche biologiche (almeno 4 piante)
per ogni tesi sanitaria, nei 4 punti della stagione
12 Agosto
S
R
I
10 settembre
S
R
I
40 campioni/cultivar
S: Sano
R: Recovered
I: Infetto
Risultati
•Ottima correlazione tra dati biochimici e di espressione genica
•In seguito all’infezione da FD, si ha un’alterazione della via metabolica dei flavonoidi totali
in entrambe le cultivar
• la risposta in Barbera, sia da un punto di vista biochimico che trascrittomico, è molto
intensa e marcata, raggiungendo il suo picco ad agosto. Il Nebbiolo invece ha una risposta
più limitata e graduale, raggiungendo il picco a luglio
•In Barbera si assiste ad un drastico aumento delle antocianine, la cui presenza prevale in
assoluto su tutti gli altri componenti del pathway. Questo non avviene invece in Nebbiolo,
dove l’arrossamento generalmente limitato e settoriale osservato nelle foglie infette, è
rispecchiato dal limitato accumulo di queste molecole.
•Le foglie di Nebbiolo sane, presentano una concentrazione tannica maggiore di quelle del
Barbera soprattutto ad inizio stagione. Abbiamo inoltre osservato che le foglie di Nebbiolo
recovered presentano una concentrazione elevata di questi composti durante tutte le fasi di
raccolta.
Dato che i tannini possono esercitare sugli insetti un effetto tossico e/o deterrente per la loro
nutrizione, si apre un’interessante ipotesi di studio e di applicazione pratica: l’utilizzo di nuovi
formulati a base di acido tannico e suoi derivati da impiegare nella lotta integrata e biologica
per il controllo di insetti nocivi alla coltura vitivinicola.
Conclusioni e sviluppi futuri
Approcci di ricerca integrati per ottenere un panel di informazioni il
piu possibile completo per ottimizzazione dei protocolli di
intervento per il contenimento dell’infezione
•
Studiare le reazioni della pianta all’infezione per comprenderne i meccanismi di
difesa
•
Studiare il fenomeno del risanamento spontaneo
- capire la biologia di base delle piante risanate
- individuare marcatori di risanamento
•
Identificare differenze legate alla sensibilità varietale
- diversa suscettibilità alle infezioni di FD
- attitudine al risanamento delle diverse cv
•
Capire la biologia dei fitoplasmi, il loro meccanismo di infezione ed il loro effetto
sul metabolismo dell’ospite
Ringraziamenti
Servizio fitosanitario, Regione Piemonte
Dr. Paolo Margaria
Grazie dell’attenzione
