Genetica dei microrganismi 2
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Genetica dei microrganismi 2 2 Utilità dei mutanti Una mutazione modifica o elimina la funzionalità di un particolare prodotto genico. Si può dedurre la funzione cellulare del prodotto del gene osservando l’effetto del cambiamento genotipico sul fenotipo della cellula. L’uso dei mutanti ha consentito di determinare le vie di biosintesi degli intermedi metabolici, la regolazione e le risposte all’ambiente, la successione di espressione di geni che controllano il ciclo cellulare etc. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 3 Fig. 10.1 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 4 Isolamento di mutanti Screening: mutazione non selezionabile (es. cambiamento colore della colonia) Selezione: mutazione che conferisce al mutante un vantaggio (es. resistenza ad un farmaco) MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 5 Isolamento di mutanti: selezione positiva MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 6 Isolamento di mutanti: selezione negativa Es.: mutanti nutrizionali Fig. 10.2 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 7 Isolamento di mutanti: selezione negativa MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 8 Test di Ames Misura il grado di mutagenicità potenziale di una data sostanza. Attualmente in questo test sono stati introdotti due elementi: 1. ceppo batterico che utilizzi esclusivamente una via per il riparo del DNA soggetta ad errori 2. l’uso di estratti di enzimi epatici Fig. 10.8 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni Isolamento di ceppi mutanti Espressione fenotipica 9 Prima generazione Mutante eterocarionte Seconda generazione Cellule batteriche con due o quattro nucleoidi. Se una mutazione avviene in una cellula tetranucleata, affinché appaia in una cellula omocarionte sono necessarie due generazioni. Se la mutazione è recessiva non può essere espressa finché il nucleoide mutante non si è separato dal nucleoide parentale Mutante omocarionte Dopo la mutagenesi affinché la cellula mutata esprima il corrispondente fenotipo è necessario un periodo di crescita. Questo fenomeno è definito ritardo fenotipico. Questo periodo sarà più breve nel caso di mutazioni dominanti, più lungo nel caso di mutazioni recessive. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 10 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 11 L’arricchimento di cellule mutanti Esempi di schemi utilizzabili per arricchire in un particolare tipo di mutante una coltura mutagenizzata Classi di mutanti Trattamento Selezione I. ARRICCHIMENTO DIRETTO Resistenza ai fagi Resistenza a sostanze chimiche o antibiotici II. CONTROSELEZIONE Auxotrofi Fonte di carbonio Fonte di azoto Coltura in piastra su un terreno contenente virioni di fago Coltura in piastra su un terreno contenete la sostanza chimica o l’antibiotico Controselezione in assenza del nutriente richiesto Controselezione in un terreno contenente solo la fonte di carbonio che il ceppo mutato non può metabolizzare Controselezione in un terreno contenente solo la fonte d’azoto che il ceppo mutato non può metabolizzare positiva negativa MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni L’arricchimento di cellule mutanti per la selezione negativa Agenti controselettivi e meccanismi con cui uccidono le cellule in crescita Agente Meccanismo Penicillina 8-Azaguanina Nutrienti radioattivi Privazione di timina Uccide le cellule in accrescimento inibendo la formazione dei legami crociati nel peptidoglicano Le cellule in crescita incorporano l’8-azaguanina nel DNA rendendolo non funzionale Le cellule in crescita incorporano il nutriente radioattivo nei componenti cellulari. In seguito al decadimento radioattivo, durante il periodo di conservazione seguente, le cellule lentamente muoiono Cellule auxotrofe per timina muoiono quando sono private di timina. Una coltura di queste cellule può essere impiegata per arricchire una seconda mutazione, perché esse non muoiono se la loro crescita è bloccata per mancanza di un altro fattore di crescita o per altre ragioni MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 12 L’arricchimento di cellule mutanti per la selezione positiva Agenti controselettivi e meccanismi con cui uccidono le cellule in crescita Agente Meccanismo Alcol allilico Acido 5-fluoroorotico L’alcol allilico viene convertito dall’alcol deidrogenasi in aldeide acroleica, altamente tossica per la cellula. In presenza di alcol allilico verranno selezionati mutanti che non presentano attività alcol deidrogenasica Il 5-FOA viene convertito in uncomposto tossico quando le cellule hanno la via biosintetica dell’uracile completa. In presenza di 5-FOA verranno selezionati mutanti ura- Acido α-aminoadipico Viene usato per controselezionare il marcatore Lys (Lys2). Su acido α-aminoadipico non cresce il prototrofo mentre crescono i ceppi lys-. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 13 14 Identificazione dei cloni mutanti Es. 1 - Isolamento di mutanti nel metabolismo: uso del tetrazolio Cellule che fermentano abbassano il pH colonie bianche Cellule che non fermentano colonie rosse Es. 2 - Isolamento di mutanti che accumulano glicogeno: colorazione delle colonie con iodio. Poiché questo trattamento uccide le cellule è necessaria la presenza di una piastra master: la colorazione viene effettuata su una replica. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 15 NB: I mutanti condizionali consentono l’analisi di geni essenziali in organismi aploidi MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 16 Selezione e adattamento Le colture pure sono veramente costituite da cellule geneticamente identiche? La crescita dei microrganismi in condizioni di laboratorio li rende leoni o tartarughe? MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni Genetica dei microrganismi scambi genici e ricombinazione Capitolo 10 Brock Capitolo 11 Stanier Capitolo 13 Prescott 18 La ricombinazione genetica La ricombinazione genetica comporta lo scambio fisico tra elementi genetici diversi. La ricombinazione omologa è molto importante e complessa (circa 25 geni in E. coli) che esistono più sistemi ridondanti. Il processo inizia con un taglio, quindi il filamento viene divaricato da proteine con attività elicasica. Il complesso RecBCD contiene sia attività nucleasica che elicasica. Una proteina che lega il DNA a singolo filamento si associa al filamento di DNA (SSB), seguita dalla proteina RecA MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 19 La ricombinazione genetica • • • Questo complesso facilita il riappaiamento con la sequenza complementare nel duplex adiacente mentre avviene lo scostamento del filamento residente (invasione del filamento). Dopo l’appaiamento può avvenire lo scambio con la formazioni di estese regioni eteroduplex, dove ciascun filamento è originato da cromosomi differenti. Infine si ha la risoluzione dell’eteroduplex ad opera della nucleasi e ligasi MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 20 Ricombinazione non reciproca: modello di Fox Nella ricombinazione non reciproca, soltanto una delle due doppie eliche conserva la sua lunghezza originaria. Un pezzo del DNA donatore viene inserito, il resto viene degradato dalle nucleasi. Una ricombinazione non reciproca si verifica durante la trasformazione batterica. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 21 Destino dei marcatori genetici Nell’eteroduplex si possono avere degli appaiamenti difettosi. Il destino di un eteroduplex può seguire due vie: 1 - la regione eteroduplex viene duplicata dando luogo a due omoduplex ovvero, le sequenze segregano l’una dall’altra. 1 un filamento dell’eteroduplex viene eliminato e rimpiazzato da un nuovo filamento di DNA (riparazione dell’appaiamento difettoso = mismatch repair). MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 22 Genetica batterica MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 23 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 24 Trasformazione batterica MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni La trasformazione avviene in natura, ma non tutti i batteri possono essere trasformati naturalmente Batteri in grado di essere trasformati naturalmente Batteri Gram positivi Streptococcus pneumoniae, S. sanguis, Baccillus subtilis, B. cereus, B. licheniformis, B. stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris Batteri Gram negativi Neisseriae gonorrheae, Acinetobacter calcoaceticus, Moraxella osloensis, M. urethalis, Psychrobacter ssp., Azotobacter agilis, Haemophilus influenzae, H parainfluenzae, Pseudomonas stutzeri, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, P. mendocina MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 25 26 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 27 Trasformazione naturale in Streptococcus pneumoniae Il fattore di competenza viene sintetizzato durante la fase di crescita esponenziale. Affinché la trasformazione avvenga, il DNA donatore deve essere di grandi dimensioni (0,3/8X106 Dalton) e a doppia elica. L’idrolisi di uno dei due filamenti di DNA fornisce l’energia per far penetrare il filamento intatto. Streptococcus pneumoniae assorbe DNA di qualsiasi origine, ma solo DNA che trova una regione di omologia con il cromosoma verrà integrato nell’ospite. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 28 Trasformazione naturale Nella maggior parte dei batteri la competenza è regolata e vi sono proteine specifiche che hanno il compito di prelevare e processare il DNA. Uno dei meccanismi di attivazione della competenza in Bacillus fa parte di un sistema “quorum-sensing” regolato da un sistema a due componenti. Le cellule producono un peptide che, quando si accumula, agisce su un sensore (ComP) che trasmette il segnale ad una proteina regolatrice (ComA) che attiva i geni della trasformazione. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 29 Formazione dell’eteroduplex MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 30 Fase di eclissi del DNA trasformante Se si usa il DNA di un ceppo trasformato per un’ulteriore trasformazione, solo dopo un certo periodo di tempo questo DNA assume la capacità trasformante. Spiegazione: per ottenere la trasformazione è necessario utilizzare DNA a doppia elica. In un primo momento il DNA si trova all’interno della cellula in forma di singolo filamento e quindi perde la sua capacità di trasformare un’altra cellula. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 31 Trasformazione naturale in Haemophilus influenzae E’ indispensabile la presenza di una sequenza di DNA di 11 basi (5’AAGTGCGGTCA3’) presente 600 volte nel genoma (una ogni 4000bp). Per questo motivo si può ottenere la trasformazione solo con DNA omologo. Dopo l’aggiunta del DNA omologo le vescicole all’esterno scompaiono e ne compaiono alcune all’interno delle cellule. Queste vescicole vengono definite trasformasomi MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 32 Differenze tra i sistemi di trasformazione naturali codificati da S. pneumoniae e H. parainfluenzae Proprietà Streptococcus Haemophylus Competenza indotta da un fattore di competenza Forma in cui il DNA penetra nella cellula Origine del DNA in grado di trasformare la cellula Forma del DNA legato alla superficie cellulare Stato fisico del DNA all’interno della cellula Presenza di un periodo di eclisse Si No Singolo filamento Doppio filamento Qualsiasi DNA omologo DNA doppia elica DNA doppia elica Legato a proteine Contenuto in un “trasformasoma” No Si MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 33 Trasformazione artificiale Young cells are incubated with a CALCIUM CHLORIDE SOLUTION for approximately 30 min on ice. In some cases magnesium is also present. The cells are concentrated and suspended as a thick suspension in the calcium solution. The cells may be mixed with reagents like glycerol and stored at -80oC for later use or they may be used immediately. Cell-free DNA is then mixed with these competent cells on ice for approximately 30 min followed by a brief mild heating (42°C 3’). The transformed cells are incubated in a rich medium for approximately 1 to 1.5 hr. and then plated on medium containing materials that will detect the presence of the transformed genes. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 34 Trasformazione artificiale L’elettroporazione è una tecnica che consiste nell’esporre la cellule a campi elettrici pulsanti, in modo da aprire piccoli pori nella membrana, attraverso i quali possono entrare molecole di DNA presenti al di fuori delle cellule. Viene usata per procarioti, eucarioti, Archaea e batteri MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 35 Coniugazione batterica MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 36 Coniugazione batterica Nella coniugazione lo scambio dipende dal contatto fisico tra cellule, avviene anche in presenza di DNasi ed è polarizzato MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 37 Coniugazione batterica Caratteristiche del plasmide F rep: geni che ne permettono la replicazione inc: geni per l’incompatibilità (IncF1) phi: inibizione dei fagi finP: inibizione della fertilità tra: geni (13) necessari per il trasferimento (occupano circa 30 kbp). I geni tra del plasmide F sono sempre derepressi. Tra questi ci sono geni che codificano la sintesi dei pili F (pili sessuali). I pili F si legano alla proteina OmpA situata sulla membrana esterna delle cellule F-, dando inizio alla coniugazione OriT: punto in cui viene prodotta una rottura (Origine del Trasferimento); successivamente ha inizio la replicazione tramite il meccanismo del cerchio rotante. La molecola di DNA potrebbe passare all’interno del pilo o in un altro punto di contatto All’interno della cellula F- la molecola di DN A viene replicata e ricircolarizzata MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 38 Coniugazione batterica I pili F si legano alla proteina OmpA In F viene prodotta una rottura nel sito OriT e la replicazione avviene con il meccanismo del rolling circle MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 39 Coniugazione batterica F viene replicato e ricircolarizzato nella cellula ricevente Le due cellule sono ora entrambe F+ MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 40 Ceppi Hfr (High frequency of recombination) In questi ceppi il plasmide F è integrato nel cromosoma batterico Durante la coniugazione vengono trasferiti anche geni cromosomici I ceppi Hfr si formano a causa di un crossing-over tra regioni omologhe presenti nel cromosoma batterico e nel plasmide F (sequenze d’inserzione IS) I ceppi riceventi divengono F+ solo se rimangono in contatto un tempo sufficiente per il trasferimento dell’intero cromosoma (100 min circa). La porzione che entra nella cellula ricevente può essere degradata oppure incorporata nel genoma dell’F- per ricombinazione. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 41 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 42 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 43 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 44 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 45 Esperimento di incrocio interrotto Poiché il trasferimento del DNA avviene a velocità costante (40kbp/min), la coniugazione Hfr può essere usata per mappare le posizioni dei geni batterici Per questo motivo sulla mappa genetica di E. coli la posizione dei geni è espressa in minuti. Si possono mappare i geni che si trovano nel primo terzo di cromosoma. Utilizzando diversi ceppi Hfr in cui il plasmide F è integrato in diversi siti, si possono mappare tutti i geni MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 46 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 47 Coniugazione F’ A volte, quando il plasmide F si stacca dal cromosoma batterico, si possono avere degli errori e alcuni geni cromosomali vengono trasferiti (excisione imperfetta). In un trasferimento il ricevente diventa parzialmente diploide (merodiploide). La coniugazione F’ è importante perché 1 - il comportamento del diploide parziale mette in evidenza se una mutazione è dominante o recessiva 2 - è utile nella mappatura: se due geni vengono inseriti in un fattore F devono essere vicini. Questo tipo di trasferimento viene anche chiamato sexduzione. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 48 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 49 Test di complementazione MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 50 Trasferimento di altri plasmidi mediato da F Il plasmide F è capace di promuovere il trasferimento di altri plasmidi incapaci di trasferimento autonomo (es. ColE1) con un meccanismo simile al trasferimento di se stesso. La capacità di un plasmide di essere mobilizzato dipende dalla presenza di una regione specifica del DNA chiamata mob. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni
