Genetica dei microrganismi 2
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Utilità dei mutanti
Una mutazione modifica o elimina la funzionalità di un particolare prodotto
genico.
Si può dedurre la funzione cellulare del prodotto del gene osservando
l’effetto del cambiamento genotipico sul fenotipo della cellula.
L’uso dei mutanti ha consentito di determinare le vie di biosintesi degli
intermedi metabolici, la regolazione e le risposte all’ambiente, la successione
di espressione di geni che controllano il ciclo cellulare etc.
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Fig. 10.1
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Isolamento di mutanti
Screening: mutazione non selezionabile (es.
cambiamento colore della colonia)
Selezione: mutazione che conferisce al mutante
un vantaggio (es. resistenza ad un farmaco)
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Isolamento di mutanti: selezione positiva
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Isolamento di mutanti: selezione negativa
Es.: mutanti nutrizionali
Fig. 10.2
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Isolamento di mutanti: selezione negativa
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Test di Ames
Misura il grado di mutagenicità
potenziale di una data sostanza.
Attualmente in questo test sono
stati introdotti due elementi:
1. ceppo batterico che utilizzi
esclusivamente una via per il
riparo del DNA soggetta ad errori
2. l’uso di estratti di enzimi
epatici
Fig. 10.8
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Isolamento di ceppi mutanti
Espressione fenotipica
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Prima generazione
Mutante eterocarionte
Seconda generazione
Cellule batteriche con due o quattro
nucleoidi. Se una mutazione avviene
in una cellula tetranucleata, affinché
appaia in una cellula omocarionte
sono necessarie due generazioni. Se
la mutazione è recessiva non può
essere espressa finché il nucleoide
mutante non si è separato dal
nucleoide parentale
Mutante omocarionte
Dopo la mutagenesi affinché la cellula mutata esprima il corrispondente fenotipo è
necessario un periodo di crescita. Questo fenomeno è definito ritardo fenotipico. Questo
periodo sarà più breve nel caso di mutazioni dominanti, più lungo nel caso di mutazioni
recessive.
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L’arricchimento di cellule mutanti
Esempi di schemi utilizzabili per arricchire in un particolare
tipo di mutante una coltura mutagenizzata
Classi di mutanti
Trattamento
Selezione
I. ARRICCHIMENTO DIRETTO
Resistenza ai fagi
Resistenza a sostanze
chimiche o antibiotici
II. CONTROSELEZIONE
Auxotrofi
Fonte di carbonio
Fonte di azoto
Coltura in piastra su un terreno
contenente virioni di fago
Coltura in piastra su un terreno contenete
la sostanza chimica o l’antibiotico
Controselezione in assenza del nutriente
richiesto
Controselezione in un terreno contenente
solo la fonte di carbonio che il ceppo
mutato non può metabolizzare
Controselezione in un terreno contenente
solo la fonte d’azoto che il ceppo mutato
non può metabolizzare
positiva
negativa
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L’arricchimento di cellule mutanti per la
selezione negativa
Agenti controselettivi e meccanismi con cui uccidono le cellule
in crescita
Agente
Meccanismo
Penicillina
8-Azaguanina
Nutrienti radioattivi
Privazione di timina
Uccide le cellule in accrescimento inibendo la formazione dei
legami crociati nel peptidoglicano
Le cellule in crescita incorporano l’8-azaguanina nel DNA
rendendolo non funzionale
Le cellule in crescita incorporano il nutriente radioattivo nei
componenti cellulari. In seguito al decadimento radioattivo,
durante il periodo di conservazione seguente, le cellule
lentamente muoiono
Cellule auxotrofe per timina muoiono quando sono private di
timina. Una coltura di queste cellule può essere impiegata per
arricchire una seconda mutazione, perché esse non muoiono se
la loro crescita è bloccata per mancanza di un altro fattore di
crescita o per altre ragioni
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L’arricchimento di cellule mutanti per la
selezione positiva
Agenti controselettivi e meccanismi con cui uccidono le cellule
in crescita
Agente
Meccanismo
Alcol allilico
Acido 5-fluoroorotico
L’alcol allilico viene convertito dall’alcol deidrogenasi in
aldeide acroleica, altamente tossica per la cellula. In presenza di
alcol allilico verranno selezionati mutanti che non presentano
attività alcol deidrogenasica
Il 5-FOA viene convertito in uncomposto tossico quando le
cellule hanno la via biosintetica dell’uracile completa. In
presenza di 5-FOA verranno selezionati mutanti ura-
Acido α-aminoadipico Viene usato per controselezionare il marcatore Lys (Lys2). Su
acido α-aminoadipico non cresce il prototrofo mentre crescono i
ceppi lys-.
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Identificazione dei cloni mutanti
Es. 1 - Isolamento di mutanti nel metabolismo: uso del tetrazolio
Cellule che fermentano abbassano il pH
colonie bianche
Cellule che non fermentano
colonie rosse
Es. 2 - Isolamento di mutanti che accumulano glicogeno:
colorazione delle colonie con iodio.
Poiché questo trattamento uccide le cellule è necessaria la
presenza di una piastra master: la colorazione viene effettuata su
una replica.
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NB: I mutanti condizionali consentono l’analisi di geni essenziali in organismi aploidi
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Selezione e adattamento
Le colture pure sono veramente costituite da cellule
geneticamente identiche?
La crescita dei microrganismi in condizioni di
laboratorio li rende leoni o tartarughe?
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Genetica dei microrganismi
scambi genici e ricombinazione
Capitolo 10 Brock
Capitolo 11 Stanier
Capitolo 13 Prescott
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La
ricombinazione
genetica
La ricombinazione genetica comporta lo
scambio fisico tra elementi genetici
diversi.
La ricombinazione omologa è molto
importante e complessa (circa 25 geni in
E. coli) che esistono più sistemi
ridondanti.
Il processo inizia con un taglio, quindi il
filamento viene divaricato da proteine
con attività elicasica. Il complesso
RecBCD contiene sia attività nucleasica
che elicasica. Una proteina che lega il
DNA a singolo filamento si associa al
filamento di DNA (SSB), seguita dalla
proteina RecA
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La
ricombinazione
genetica
•
•
•
Questo complesso facilita il
riappaiamento con la sequenza
complementare nel duplex adiacente
mentre avviene lo scostamento del
filamento residente (invasione del
filamento).
Dopo l’appaiamento può avvenire lo
scambio con la formazioni di estese
regioni eteroduplex, dove ciascun
filamento è originato da cromosomi
differenti.
Infine si ha la risoluzione
dell’eteroduplex ad opera della
nucleasi e ligasi
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Ricombinazione non
reciproca:
modello di Fox
Nella
ricombinazione
non
reciproca, soltanto una delle due
doppie eliche conserva la sua
lunghezza originaria.
Un pezzo del DNA donatore viene
inserito, il resto viene degradato
dalle nucleasi.
Una ricombinazione non reciproca
si
verifica
durante
la
trasformazione batterica.
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Destino dei marcatori genetici
Nell’eteroduplex si possono
avere
degli
appaiamenti
difettosi. Il destino di un
eteroduplex può seguire due
vie:
1 - la regione eteroduplex
viene duplicata dando luogo a
due omoduplex ovvero, le
sequenze segregano l’una
dall’altra.
1
un
filamento
dell’eteroduplex
viene
eliminato e rimpiazzato da un
nuovo filamento di DNA
(riparazione dell’appaiamento
difettoso = mismatch repair).
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Genetica batterica
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Trasformazione batterica
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La trasformazione avviene in natura, ma
non tutti i batteri possono essere
trasformati naturalmente
Batteri in grado di essere trasformati naturalmente
Batteri Gram positivi
Streptococcus pneumoniae, S. sanguis, Baccillus
subtilis, B. cereus, B. licheniformis, B.
stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris
Batteri Gram negativi
Neisseriae gonorrheae, Acinetobacter calcoaceticus,
Moraxella osloensis, M. urethalis, Psychrobacter ssp.,
Azotobacter agilis, Haemophilus influenzae, H
parainfluenzae, Pseudomonas stutzeri, P. alcaligenes, P.
pseudoalcaligenes, P. mendocina
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Trasformazione naturale in Streptococcus
pneumoniae
Il fattore di competenza viene sintetizzato durante la fase di
crescita esponenziale.
Affinché la trasformazione avvenga, il DNA donatore deve
essere di grandi dimensioni (0,3/8X106 Dalton) e a doppia elica.
L’idrolisi di uno dei due filamenti di DNA fornisce l’energia
per far penetrare il filamento intatto.
Streptococcus pneumoniae assorbe DNA di qualsiasi origine,
ma solo DNA che trova una regione di omologia con il
cromosoma verrà integrato nell’ospite.
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Trasformazione naturale
Nella maggior parte dei batteri la competenza è regolata e vi
sono proteine specifiche che hanno il compito di prelevare e
processare il DNA.
Uno dei meccanismi di attivazione della competenza in
Bacillus fa parte di un sistema “quorum-sensing” regolato
da un sistema a due componenti.
Le cellule producono un peptide che, quando si accumula,
agisce su un sensore (ComP) che trasmette il segnale ad una
proteina regolatrice (ComA) che attiva i geni della
trasformazione.
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Formazione dell’eteroduplex
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Fase di eclissi del DNA trasformante
Se si usa il DNA di un ceppo
trasformato per un’ulteriore
trasformazione, solo dopo un
certo periodo di tempo questo
DNA assume la capacità
trasformante.
Spiegazione:
per
ottenere
la
trasformazione è necessario
utilizzare DNA a doppia
elica. In un primo momento il
DNA si trova all’interno della
cellula in forma di singolo
filamento e quindi perde la
sua capacità di trasformare
un’altra cellula.
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Trasformazione naturale in Haemophilus
influenzae
E’ indispensabile la presenza
di una sequenza di DNA di
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basi
(5’AAGTGCGGTCA3’)
presente 600 volte nel
genoma (una ogni 4000bp).
Per questo motivo si può
ottenere la trasformazione
solo con DNA omologo.
Dopo l’aggiunta del DNA
omologo
le
vescicole
all’esterno scompaiono e ne
compaiono alcune all’interno
delle cellule.
Queste vescicole vengono
definite trasformasomi
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Differenze tra i sistemi di trasformazione naturali codificati da S.
pneumoniae e H. parainfluenzae
Proprietà
Streptococcus
Haemophylus
Competenza indotta da un
fattore di competenza
Forma in cui il DNA
penetra nella cellula
Origine del DNA in grado
di trasformare la cellula
Forma del DNA legato
alla superficie cellulare
Stato fisico del DNA
all’interno della cellula
Presenza di un periodo di
eclisse
Si
No
Singolo filamento
Doppio filamento
Qualsiasi
DNA omologo
DNA doppia elica
DNA doppia elica
Legato a proteine
Contenuto in un
“trasformasoma”
No
Si
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Trasformazione artificiale
Young cells are incubated with a CALCIUM CHLORIDE SOLUTION for
approximately 30 min on ice. In some cases magnesium is also present.
The cells are concentrated and suspended as a thick suspension in the calcium
solution. The cells may be mixed with reagents like glycerol and stored at -80oC for
later use or they may be used immediately.
Cell-free DNA is then mixed with these competent cells on ice for approximately 30
min followed by a brief mild heating (42°C 3’).
The transformed cells are incubated in a rich medium for approximately 1 to 1.5 hr.
and then plated on medium containing materials that will detect the presence of the
transformed genes.
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Trasformazione artificiale
L’elettroporazione è una tecnica che consiste nell’esporre la
cellule a campi elettrici pulsanti, in modo da aprire piccoli pori
nella membrana, attraverso i quali possono entrare molecole di
DNA presenti al di fuori delle cellule.
Viene usata per procarioti, eucarioti, Archaea e batteri
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Coniugazione batterica
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Coniugazione batterica
Nella coniugazione lo scambio dipende dal contatto fisico tra cellule, avviene anche
in presenza di DNasi ed è polarizzato
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Coniugazione batterica
Caratteristiche del plasmide F
rep: geni che ne permettono la replicazione
inc: geni per l’incompatibilità (IncF1)
phi: inibizione dei fagi
finP: inibizione della fertilità
tra: geni (13) necessari per il trasferimento (occupano
circa 30 kbp). I geni tra del plasmide F sono sempre
derepressi. Tra questi ci sono geni che codificano la
sintesi dei pili F (pili sessuali). I pili F si legano alla
proteina OmpA situata sulla membrana esterna delle
cellule F-, dando inizio alla coniugazione
OriT: punto in cui viene prodotta una rottura (Origine
del Trasferimento); successivamente ha inizio la
replicazione tramite il meccanismo del cerchio rotante.
La molecola di DNA potrebbe passare all’interno del
pilo o in un altro punto di contatto
All’interno della cellula F- la molecola di DN A viene
replicata e ricircolarizzata
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Coniugazione batterica
I pili F si
legano alla
proteina
OmpA
In F viene
prodotta una
rottura nel sito
OriT e la
replicazione
avviene con il
meccanismo del
rolling circle
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Coniugazione batterica
F viene replicato
e ricircolarizzato
nella cellula
ricevente
Le due cellule
sono ora
entrambe F+
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Ceppi Hfr (High frequency of
recombination)
In questi ceppi il plasmide F è integrato nel cromosoma
batterico
Durante la coniugazione vengono trasferiti anche geni
cromosomici
I ceppi Hfr si formano a causa di un crossing-over tra regioni
omologhe presenti nel cromosoma batterico e nel plasmide F
(sequenze d’inserzione IS)
I ceppi riceventi divengono F+ solo se rimangono in contatto un
tempo sufficiente per il trasferimento dell’intero cromosoma
(100 min circa).
La porzione che entra nella cellula ricevente può essere
degradata oppure incorporata nel genoma dell’F- per
ricombinazione.
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Esperimento di incrocio interrotto
Poiché il trasferimento del DNA avviene a velocità costante
(40kbp/min), la coniugazione Hfr può essere usata per
mappare le posizioni dei geni batterici
Per questo motivo sulla mappa genetica di E. coli la posizione
dei geni è espressa in minuti.
Si possono mappare i geni che si trovano nel primo terzo di
cromosoma. Utilizzando diversi ceppi Hfr in cui il plasmide F
è integrato in diversi siti, si possono mappare tutti i geni
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Coniugazione F’
A volte, quando il plasmide F si stacca dal cromosoma
batterico, si possono avere degli errori e alcuni geni
cromosomali vengono trasferiti (excisione imperfetta).
In un trasferimento il ricevente diventa parzialmente
diploide (merodiploide).
La coniugazione F’ è importante perché
1 - il comportamento del diploide parziale mette in
evidenza se una mutazione è dominante o recessiva
2 - è utile nella mappatura: se due geni vengono inseriti in
un fattore F devono essere vicini.
Questo tipo di trasferimento viene anche chiamato
sexduzione.
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Test di complementazione
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Trasferimento di altri plasmidi mediato da
F
Il plasmide F è capace di promuovere il trasferimento di
altri plasmidi incapaci di trasferimento autonomo (es.
ColE1) con un meccanismo simile al trasferimento di se
stesso.
La capacità di un plasmide di essere mobilizzato dipende
dalla presenza di una regione specifica del DNA chiamata
mob.
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