DIAGNOSI DELLE
INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE
PP Slide Presentation by O E. Varnier!
Oliviero E. Varnier
USD di Microbiologia – IRCCS Hsan Martino
…. più di 100 virus sono noti
per causare encefaliti acute
nell’uomo ....
NEUROLOGO
PAZIENTE
MICROBIOLOGO
INFETTIVOLOGO
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INDICE
! Encefaliti virali
! Meningiti batteriche
! Riattivazione di virus latenti
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1. A. Giovanni 70 anni
! Diagnosi clinica: encefalite
! Liquor: 2 linfociti, proteine elevate, danno di barriera, bande
oligoclonali addizionali in liquor e siero
! Virologia: 125.000 copie di HSV-1 DNA/ml nel liquor
! Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa
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2. L. Paola 42 anni
! Ricovero: sospetta encefalite
! Liquor: 160 GB (80% linfo) proteine, glucosio normali danno
di barriera, bande oligoclonali in liquor e siero
! Virologica: 33.000 copie di HSV-1 DNA/ml nel liquor
! Terapia: aciclovir iv, risoluzione clinica
! Riflessioni: l’esame liquorale standard quantifica la gravità
dell’encefalite. La PCR identifica l’eziologia e indirizza la
terapia
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3. M. Ileana 27 anni
! Ricovero: Sospetta meningite
! Liquor: 20 GB (100% linfo), citochimico, immunochimico
nella norma, bande assenti in liquor e siero
! Virologica: 175 copie di VZV DNA/ml nel liquor
! Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa
! Riflessioni: l’esame liquorale standard identifica un lieve
danno iniziale; la PCR identifica una lieve infezione virale
e indirizza al trattamento specifico con risoluzione
completa
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4.
C. Emanuela 19 anni
! Cefalea ingravescente accompagnata da nausea, vomito e
rigidità nucale.
! Pronto soccorso: EEG e TAC negative
! Liquor: 230 linfociti, danno di barriera, assenza di bande
oligoclonali su liquor e siero all’immunoblot
! Virologia: anticorpi antivirus assenti
4,800 copie di VZV DNA/ml nel liquor
! Terapia con aciclovir iv e valaciclovir per os
! Rapida guarigione senza sofferanza assonale del facciale e
conseguente deficit funzionale.
! Diagnosi: meningite in sindrome di Ramsay Hunt paucisintomatica con riattivazione di VZV
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5.
M. Francesca 23 anni
ID
Data
Diagnosi Clinica
HSV 1
HSV 2
VZV
CMV
EBV
HHV6
4238
14-01-05
Sindrome Cerebrale
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
4248
31-01-05
Sindrome Cerebrale
NEG
NEG
NEG
NEG
700
NEG
!
A 5 anni, sindrome linfoistocitica post infezione da EBV
!
A 17 anni, sindrome cerebellare subacuta con probabile riattivazione di
EBV
!
Terapia: Rituximab
!
Nel gennaio 2005 ospedalizzata: quadro clinico invariato.
!
Liquor: 3 linfociti, es citochimico, immunochimico normali, bande
oligoclonali assenti in liquor e siero.
!
Virologia: 700 copie di EBV DNA/ml nel liquor
!
Diagnosi: ematofagocitosi maligna con infezione cronica da EBV e
cerebellite subacuta ricorrente
!
Trapianto di Midollo
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6. S. Gabriele 54 anni
!
Ricovero: lievo sindrome psicorganica, turbe espressione verbale,
cefalea
!
TAC encefalo e doppler TSA nella norma; EEG: alterazioni discrete
temporale sx
!
Liquor: completamente negativo
!
Virologia: 538.000 copie BKV DNA/ml nel liquor
!
Terapia: nessuna
!
Risoluzione completa del quadro clinico e normalizzazione dell’EEG in
circa 72 ore
!
Diagnosi: ?
!
Riflessioni: interdisciplinarietà
!
Possibile errore diagnostico da contaminazione del campione
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7. donna 69 anni
! Ricovero: stato confusionale e febbre elevata
! Liquor: 100 cellule (90% linfociti), glucosio e proteine non
alterate
v Virologica: 80,000 HSV1 DNA copie per ml
v Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa
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RealTime PCR: LightCycler
… include amplificazione
(PCR), ibridizzazione e il
rilevamento del segnale in
una singola fase …… in
Real Time
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LightCycler Real Time PCR: Piattaforma
Sequenza DNA bersaglio
cDNA
Primer
Biotina
Biotina
cDNA
Primer
rTth DNA Polimerasi
Biotina
cDNA
Biotina
NEO AMPLICONE
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LightCycler Real Time PCR: Rapidità
min 02:48
9 Cicli in
min 05:50
min 08:38
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LightCycler Real Time PCR:
Accuratezza, Intervallo di Calcolo, Linearità
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LightCycler Real Time PCR:
Analisi delle Curve di Melting
tipo 1
AMPLICON
tipo 2
AMPLICON
tipo 2
tipo 2
tipo 1
tipo 1
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LightCycler Real Time PCR: Virus
BKV
VZV
CMV
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ID
Virus
Tm
HSV pol f
TCgAgTgCgAAAAAACgTTC
57,4 °C
HSV pol a
CggTTgATAAACgCgCAgT
58,9 °C
HSV-2 3FL
gCgCACCAgATCCACgCCCTTgATgAgC X
76,2 °C
HSV-2 5LC
CTTgCCCCCgCAgATgACgCC p
71,6 °C
VZV
29F
TgTCCTAgAggAggTTTTATCTg
52,8 °C
29R
CATCgTCTgTAAAgACTTAACCAg
53,8 °C
29FLU
gggAAATCgAgAAACCACCCTATCggAC X
68,1 °C
29LCR
gB For
LC-AAgTTCgCggTATAATTgTCAgTggCg p
ATAggAggCgCCACgTATTC
65,2 °C
gB Rev
TACCCCTATCgCgTgTgTTC
gB 3FL
CgTTTCgTCgTAgCTACgCRTACAT X
gB 5LC
LC-ACACCACTTATCTYCTgggCAgC p
EB-30
gAgggTggTTTggAAAgC
EB-40
AACAgACAATggACTCCCTTAg
EBNA 3FL
AgTCgTCTCCCCCTTTggAATggC X
EBNA 5LC
LC-CTggACCCggCCCACAACTg ph
HHV-6
101K-01
ACCCgAgAgATgATTTTgCg
52,8 °C
101K-02
gCAgAAgACAgCAgCgCgAT
53,8 °C
101K-LC
TAAgTAACCgTTTTCgTCCCA X
68,1 °C
101K-FL
LC-gggTCATTTATgTTATAgACggTg p
65,2 °C
HSV1/2
Light Cycler REALTIME PCR
Primers & Probes
CMV
EBV
57,6 °C
57,1 °C
62,0 °C
59,4 °C
54,9 °C
54,0 °C
64,9 °C
69,9 °C
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LightCycler Real Time PCR:
RICERCA di 11 VIRUS DIVERSI in CAMPIONI di LIQUOR
224 liquor analizzati
1287 test eseguiti
33 campioni positivi
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QUANTIFICAZIONE? 33 INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE
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AD OGGI
!
Abbiamo sperimentato protocolli diagnostici di LightCycler
Real Time PCR (incluso HHV-6 e HHV-8) da impiegare in
parallelo in una unica seduta.
!
Gli acidi nucleici sono estratti dai campioni (liquor, sangue,
urine, biopsie, ecc., purificati ed eventualmente concentrati
in meno di 60 min
!
Ogni campione può essere analizzato per la presenza di sei
herpesvirus umani (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV e
HHV-6) in circa 60 min. La presenza di DNA virale può
essere quantificata ed espressa come copie di DNA per ml.
!
Lo stesso campione può essere testato anche per HHV-8,
Poliomavirus (JCV e BKV) e Adenovirus.
!
In circa 120-180 min dall’arrivo del campione, i risultati sono
comunicati per telefono, inviati per e-mail (file pdf) e
stampati per l’invio cartaceo.
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LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti
Test LightCycler RealTime PCR per:
!
Identificazione e quantificazione di Neisseria meningitidis
!
Tipizzazione di N. meningitidis A, B e C
!
Identificazione di N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae
!
Identificazione e quantificazione di Listeria monocytogenes
!
Identificazione di Mycobacterium spp
!
Tipizzazione di M. tuberculosis e M. avium
!
Identificazione e quantificazione di Borrelia burgdorferi sensu lato
!
Tipizzazione di B.afzelii, B.garinii e B. burgdorferi sensu stricto
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LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti
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LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti
19 MARZO 2007
388 CAMPIONI
44 POSITIVI
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SEPSI E MENINGITI BATTERICHE
!
marzo 2004 – marzo 2007
!
20 casi di sospetta meningite batterica e 2 di sepsi:
!
12 maschi e 10 femmine di età da 4 mesi ad 80 anni
!
12 deceduti
!
Neisseria meningitidis è stata identificata in 11 pazienti:
6 ceppi erano di tipo B e i rimanenti 5 di tipo C
!
Streptococcus pneumoniae è stato identificato in 8 pazienti.
!
25 pazienti sono risultati negativi per la presenza di patogeni infettivi, ad
esempio:
! S.C. è deceduto per una causa violenta non ancora identificata
! IJ è deceduto per una polmonite ab ingestis
! ZAM di 80 anni è deceduta per decadimento generale
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RIFLESSIONI CONCLUSIVE
Disponibili le Conoscenze e le Biotecnologie per una
Diagnosi Avanzata delle Infezioni Neurologiche
! Identificazione
! Tipizzazione
! Quantificazione
! Referto rapido in 1,5 – 6 ore
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