11-MIMC-2014-Varnier-Meningiti-Virali 25

DIAGNOSI DELLE
INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE
PP Slide Presentation by O E. Varnier!
Oliviero E. Varnier
USD di Microbiologia – IRCCS Hsan Martino
…. più di 100 virus sono noti
per causare encefaliti acute
nell’uomo ....
NEUROLOGO
PAZIENTE
MICROBIOLOGO
INFETTIVOLOGO
2 di 25
INDICE
! Encefaliti virali
! Meningiti batteriche
! Riattivazione di virus latenti
3 di 25
1. A. Giovanni 70 anni
! Diagnosi clinica: encefalite
! Liquor: 2 linfociti, proteine elevate, danno di barriera, bande
oligoclonali addizionali in liquor e siero
! Virologia: 125.000 copie di HSV-1 DNA/ml nel liquor
! Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa
4 di 25
2. L. Paola 42 anni
! Ricovero: sospetta encefalite
! Liquor: 160 GB (80% linfo) proteine, glucosio normali danno
di barriera, bande oligoclonali in liquor e siero
! Virologica: 33.000 copie di HSV-1 DNA/ml nel liquor
! Terapia: aciclovir iv, risoluzione clinica
! Riflessioni: l’esame liquorale standard quantifica la gravità
dell’encefalite. La PCR identifica l’eziologia e indirizza la
terapia
5 di 25
3. M. Ileana 27 anni
! Ricovero: Sospetta meningite
! Liquor: 20 GB (100% linfo), citochimico, immunochimico
nella norma, bande assenti in liquor e siero
! Virologica: 175 copie di VZV DNA/ml nel liquor
! Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa
! Riflessioni: l’esame liquorale standard identifica un lieve
danno iniziale; la PCR identifica una lieve infezione virale
e indirizza al trattamento specifico con risoluzione
completa
6 di 25
4.
C. Emanuela 19 anni
! Cefalea ingravescente accompagnata da nausea, vomito e
rigidità nucale.
! Pronto soccorso: EEG e TAC negative
! Liquor: 230 linfociti, danno di barriera, assenza di bande
oligoclonali su liquor e siero all’immunoblot
! Virologia: anticorpi antivirus assenti
4,800 copie di VZV DNA/ml nel liquor
! Terapia con aciclovir iv e valaciclovir per os
! Rapida guarigione senza sofferanza assonale del facciale e
conseguente deficit funzionale.
! Diagnosi: meningite in sindrome di Ramsay Hunt paucisintomatica con riattivazione di VZV
7 di 25
5.
M. Francesca 23 anni
ID
Data
Diagnosi Clinica
HSV 1
HSV 2
VZV
CMV
EBV
HHV6
4238
14-01-05
Sindrome Cerebrale
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
4248
31-01-05
Sindrome Cerebrale
NEG
NEG
NEG
NEG
700
NEG
!
A 5 anni, sindrome linfoistocitica post infezione da EBV
!
A 17 anni, sindrome cerebellare subacuta con probabile riattivazione di
EBV
!
Terapia: Rituximab
!
Nel gennaio 2005 ospedalizzata: quadro clinico invariato.
!
Liquor: 3 linfociti, es citochimico, immunochimico normali, bande
oligoclonali assenti in liquor e siero.
!
Virologia: 700 copie di EBV DNA/ml nel liquor
!
Diagnosi: ematofagocitosi maligna con infezione cronica da EBV e
cerebellite subacuta ricorrente
!
Trapianto di Midollo
8 di 25
6. S. Gabriele 54 anni
!
Ricovero: lievo sindrome psicorganica, turbe espressione verbale,
cefalea
!
TAC encefalo e doppler TSA nella norma; EEG: alterazioni discrete
temporale sx
!
Liquor: completamente negativo
!
Virologia: 538.000 copie BKV DNA/ml nel liquor
!
Terapia: nessuna
!
Risoluzione completa del quadro clinico e normalizzazione dell’EEG in
circa 72 ore
!
Diagnosi: ?
!
Riflessioni: interdisciplinarietà
!
Possibile errore diagnostico da contaminazione del campione
9 di 25
7. donna 69 anni
! Ricovero: stato confusionale e febbre elevata
! Liquor: 100 cellule (90% linfociti), glucosio e proteine non
alterate
v Virologica: 80,000 HSV1 DNA copie per ml
v Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa
10 di 25
RealTime PCR: LightCycler
… include amplificazione
(PCR), ibridizzazione e il
rilevamento del segnale in
una singola fase …… in
Real Time
11 di 25
LightCycler Real Time PCR: Piattaforma
Sequenza DNA bersaglio
cDNA
Primer
Biotina
Biotina
cDNA
Primer
rTth DNA Polimerasi
Biotina
cDNA
Biotina
NEO AMPLICONE
12 di 25
LightCycler Real Time PCR: Rapidità
min 02:48
9 Cicli in
min 05:50
min 08:38
13 di 25
LightCycler Real Time PCR:
Accuratezza, Intervallo di Calcolo, Linearità
14 di 25
LightCycler Real Time PCR:
Analisi delle Curve di Melting
tipo 1
AMPLICON
tipo 2
AMPLICON
tipo 2
tipo 2
tipo 1
tipo 1
15 di 25
LightCycler Real Time PCR: Virus
BKV
VZV
CMV
16 di 25
ID
Virus
Tm
HSV pol f
TCgAgTgCgAAAAAACgTTC
57,4 °C
HSV pol a
CggTTgATAAACgCgCAgT
58,9 °C
HSV-2 3FL
gCgCACCAgATCCACgCCCTTgATgAgC X
76,2 °C
HSV-2 5LC
CTTgCCCCCgCAgATgACgCC p
71,6 °C
VZV
29F
TgTCCTAgAggAggTTTTATCTg
52,8 °C
29R
CATCgTCTgTAAAgACTTAACCAg
53,8 °C
29FLU
gggAAATCgAgAAACCACCCTATCggAC X
68,1 °C
29LCR
gB For
LC-AAgTTCgCggTATAATTgTCAgTggCg p
ATAggAggCgCCACgTATTC
65,2 °C
gB Rev
TACCCCTATCgCgTgTgTTC
gB 3FL
CgTTTCgTCgTAgCTACgCRTACAT X
gB 5LC
LC-ACACCACTTATCTYCTgggCAgC p
EB-30
gAgggTggTTTggAAAgC
EB-40
AACAgACAATggACTCCCTTAg
EBNA 3FL
AgTCgTCTCCCCCTTTggAATggC X
EBNA 5LC
LC-CTggACCCggCCCACAACTg ph
HHV-6
101K-01
ACCCgAgAgATgATTTTgCg
52,8 °C
101K-02
gCAgAAgACAgCAgCgCgAT
53,8 °C
101K-LC
TAAgTAACCgTTTTCgTCCCA X
68,1 °C
101K-FL
LC-gggTCATTTATgTTATAgACggTg p
65,2 °C
HSV1/2
Light Cycler REALTIME PCR
Primers & Probes
CMV
EBV
57,6 °C
57,1 °C
62,0 °C
59,4 °C
54,9 °C
54,0 °C
64,9 °C
69,9 °C
17 di 25
LightCycler Real Time PCR:
RICERCA di 11 VIRUS DIVERSI in CAMPIONI di LIQUOR
224 liquor analizzati
1287 test eseguiti
33 campioni positivi
18 di 25
QUANTIFICAZIONE? 33 INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE
19 di 25
AD OGGI
!
Abbiamo sperimentato protocolli diagnostici di LightCycler
Real Time PCR (incluso HHV-6 e HHV-8) da impiegare in
parallelo in una unica seduta.
!
Gli acidi nucleici sono estratti dai campioni (liquor, sangue,
urine, biopsie, ecc., purificati ed eventualmente concentrati
in meno di 60 min
!
Ogni campione può essere analizzato per la presenza di sei
herpesvirus umani (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV e
HHV-6) in circa 60 min. La presenza di DNA virale può
essere quantificata ed espressa come copie di DNA per ml.
!
Lo stesso campione può essere testato anche per HHV-8,
Poliomavirus (JCV e BKV) e Adenovirus.
!
In circa 120-180 min dall’arrivo del campione, i risultati sono
comunicati per telefono, inviati per e-mail (file pdf) e
stampati per l’invio cartaceo.
20 di 25
LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti
Test LightCycler RealTime PCR per:
!
Identificazione e quantificazione di Neisseria meningitidis
!
Tipizzazione di N. meningitidis A, B e C
!
Identificazione di N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae
!
Identificazione e quantificazione di Listeria monocytogenes
!
Identificazione di Mycobacterium spp
!
Tipizzazione di M. tuberculosis e M. avium
!
Identificazione e quantificazione di Borrelia burgdorferi sensu lato
!
Tipizzazione di B.afzelii, B.garinii e B. burgdorferi sensu stricto
21 di 25
LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti
22 di 25
LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti
19 MARZO 2007
388 CAMPIONI
44 POSITIVI
23 di 25
SEPSI E MENINGITI BATTERICHE
!
marzo 2004 – marzo 2007
!
20 casi di sospetta meningite batterica e 2 di sepsi:
!
12 maschi e 10 femmine di età da 4 mesi ad 80 anni
!
12 deceduti
!
Neisseria meningitidis è stata identificata in 11 pazienti:
6 ceppi erano di tipo B e i rimanenti 5 di tipo C
!
Streptococcus pneumoniae è stato identificato in 8 pazienti.
!
25 pazienti sono risultati negativi per la presenza di patogeni infettivi, ad
esempio:
! S.C. è deceduto per una causa violenta non ancora identificata
! IJ è deceduto per una polmonite ab ingestis
! ZAM di 80 anni è deceduta per decadimento generale
24 di 25
RIFLESSIONI CONCLUSIVE
Disponibili le Conoscenze e le Biotecnologie per una
Diagnosi Avanzata delle Infezioni Neurologiche
! Identificazione
! Tipizzazione
! Quantificazione
! Referto rapido in 1,5 – 6 ore
25 di 25