LEZIONE DEL 09/05/2017 . VIA AEROBICA DEL PIRUVATO: CICLO DI KREBS; . IL CICLO DI CALVIN; ANTICAMERA (del Paradiso) DEL CICLO DI KREBS Se non viene usato per fermentazione, il piruvato è trasportato nel mitocondrio, dove si trova un enzima con tre unità funzionali (la PIRUVATO DEIDROGENASI) NAD+, NADP+, FAD dipendenti, che sono dei derivati vitaminici ossidoriducenti (caricano, scaricano) e le loro reazioni sono reversibili tranne quando associate a decarbossilazione. Le tre subunità ( E1, E2, E3 : deidrogenasi) costituiscono un complesso enzimatico così grosso da poter essere visto col microscopio elettronico (gli elettroni hanno anche massa; per rendere visibile ciò che si ingrandisce col microscopio si riveste il tessuto d'oro, così gli elettroni si sparano su tessuti metallici). Esse non sono monomeriche, ma dimeri o trimeri ripetuti in decin di copie e disposte a strati con E2 all'interno (collegati l'uno all'altro come sfere). (I - E1) La TPP interviene nella prima subunità e induce carbossilazione nel piruvato per tagliare COO-, che si lega alla componente tiazolica della 1 TPP. A seguito di questo, E1 ruota sotto E2 e CO2 legato al g. tiazolico viene passato all'acido lipoico, che reagisce con la lisina, creando un braccio mercanico (forcello). L'acido lipoico si trova in uno stato ridotto (per ossidarsi fa un ponte disolfuro come il glutatione), ospita CH3COO- e se lo aggancia su un SH; la TPP si sgancia e riceve una nuova molecola di piruvato. Nelle reazioni sono stati coinvolti già coinvolti due cofattori (1) TPP e (2) e lipoato. Il lipoato si sposta su un'altra unità, sulla subunità 2 (E2) e poi arriva (3) CoASH , che già aspettava il lipoato per prendere da esso l'acetato e fare acetil-CoA. Il lipoato se ne va nel suo stato ridotto e dev'essere ricaricato; per questo serve il terzo blocco (E3), che ha altri due cofattori vitaminici: (4) FAD, che lipoato (FAD per il ciclo L'acetil-CoA stacca i due protoni e riossida il -> FADH2); serve a preparare acetil-CoA di Krebs e per produrre energia. aspetta che arrivi il (5) NAD che provoca un'ossidoriduzione: (NAD+ -> NADH) FADH2 -> FAD Preferisco NADH come navetta mobile, perché solubile; FAD invece è vincolato, perché sta sempre legato ad una proteina. CoAS∼COCH3 è fortemente energetica; il NADH è fortemente riducente nel mitocondrio (mentre nella glicolisi il NADH si trovava nel citosol). Se potessi invertire queste reazioni, dall'acetato rifarei piruvato e conseguentemente uno zucchero. L'acetil-CoA, oltre che a provenire dallo zucchero, lo fa anche dal metabolismo delle proteine e da acidi grassi. Questa reazione della deidrogenasi è irreversibile: non può trasformare i grassi in zuccheri. C'è un solo organismo che può fare questa reazione al contrario: nel ciclo del GLIOSSILATO, nelle piante sotto forma di semi (non può accumulare zuccheri nel seme perché richiede acqua). Le piante 2 riescono a pprodurre piruvato da CoA e a partire da gliossilato. Regolazione delle subunità E2 ed E3 vengono controllate retroattivamente (a feedback negativo), bloccate ad alte concentrazioni di acetil-CoA e NADH rispettivamente; E1, invece, subisce una regolazione per modificazione covalente tramite la fosforilazione dell'ossidrile della catena laterale della tirosina. [ APPROFONDIMENTO: Piruvato Deidrogenasi Introduzione Una combinazione di più tecniche, cristallografia ai raggi X, spettroscopia NMR, e microscopia elettronica, sta rivelando i segreti dell'enzima piruvato deidrogenasi. Questo enzima si trova nei mitocondri, organelli cellulari specializzati nelle reazioni ossidative, e qui realizza la decarbossilazione ossidativa, una tappa centrale della produzione di energia nella cellula, che collega la glicolisi al ciclo di Krebs. Questa reazione viene realizzata in tre passaggi distinti da tre enzimi diversi (E1, E2, E3), tutti e tre sono legati tra loro in modo funzionale in un grande complesso multienzimatico, la piruvato deidrogenasi. 3 Anatomia di un complesso multienzimatico Il complesso ha molte parti mobili che lavorano insieme per realizzare la reazione globale. E' costruito attorno ad un nocciolo simmetrico (E2) mostrato qui in blu. Tutte le catene proteiche che compongono il nocciolo terminano con una lunga coda flessibile che si avvolge per realizzare molti altri domini funzionali. Uno di questi domini lega gli altri enzimi del complesso, mostrati in verde (E1) e in giallo-aramcione (E3). Vi sono poi molti altri piccoli domini che agiscono da trasportatori. Una amminoacido lisina su questi trasportatori, mostrato in magenta, è legato ad una speciale molecola, l'acido lipoico (non mostrato nella struttura). Questo trasporta le molecole parzialmente reagite da E1 (verde, dove il piruvato viene decarbossilato) ad E2 (nocciolo blu, dove il residuo viene ossidato dall'acido lipoico e trasferito al coenzima A), e alla fine si porta in E3 (giallo-arancione, dove l'acido lipoico ridotto viene ossidato ad opera di FAD e NAD+). Qui il complesso enzimatico è stato rappresentato in modo semplificato e contiene solo 6 delle 24 code proteiche. Nel complesso vero il nocciolo centrale è completamente circondato da catene proteiche. Scoprire il Complesso Dato che il complesso è flessibile, si è rivelato difficile da studiare, infatti solo le proteine che hanno una forma ben definita si possono vedere con la tecnica della diffrazione ai raggi X, o con la spettroscopia NMR. Per questo motivo i chimici strutturisti hanno scelto la via del "divide et impera" e hanno diviso il complesso in piccoli frammenti, questi, avendo una struttura più rigida, sono stati determinati con facilità. Infine, per capire come assemblare i vari frammenti, hanno usato immagini in bassa risoluzione ottenute con il miscroscopio elettonico. Nell'immagine qui sopra sono state incluse le strutture di più frammenti: Il nocciolo centrale E2 (PDB 1eaa), i domini di trasporto (PDB 1lac), e i due enzimi E1 ed E3 legati alle code proteiche (PDB 1w85 e 1ebd). L'Importanza di Assumere vitamine La reazione di decarbossilazione ossidativa che viene compiuta dalla piruvato deidrogenasi è complessa, e quindi utilizza diverse molecole di supporto. 4 L'enzima E1 che realizza il primo passaggio, decarbossilazione, è mostrato qui a destra (file PDB 1w85), usa tiamina pirofosfato (vitamina B1) per estrarre anidride carbonica, CO2, dal piruvato. La molecola di tiamina ha un atomo di carbonio particolarmente reattivo, mostrato qui con un asterisco, che compie l'attacco al piruvato. Anche altre molecole sono indispensabili per realizzare la reazione complessiva: i piccoli domini trasportatori usano acido lipoico per legare il piruvato (dopo che ha perso CO2) e ossidarlo ad acetile e alla fine (in E2) cedono l'acetile ad un'altra molecola strana, il coenzima A (che contiene acido pantotenico, vitamina B5). L'enzima che realizza l'ultimo passaggio (E3) usa FAD (che contiene riboflavina, vitamina B2) e NAD (che contiene niacina, vitamina B3 o PP) per riportare l'acido lipoico nella sua forma iniziale ridotta. Le nostre cellule non sono in grado di sintetizzare molte di queste molecole complesse e quindi le dobbiamo assumere con la dieta, per questo si chiamano vitamine, ammine della vita. Esplorando la Struttura Come accade spesso in biochimica, le cose si rivelano ancora più complesse quando vengono osservate in dettaglio. Esistono molte varianti della piruvato deidrogenasi nei vari tipi di cellule. Alcune cellule hanno uno o due domini di trasporto sulle code proteiche invece dei tre mostrati qui. Il complesso nelle nostre cellule include un'altra proteina nel nocciolo che possiede dei propri domini di trasporto. Inoltre lo stesso nocciolo può avere geometrie 5 diverse: un nocciolo a subunità (mostrato qui un nocciolo a forma di subunità (mostrato qui 1b5s). forma di cubo composto di 24 sotto a sinistra PDB 1eaa) o dodecaedro composto di 6o sotto a destra, file PDB Il nocciolo di sinistra è stato preso da Azobacter, quello sulla destra da Geobacillus. Qui sotto sono mostrati i due tipi di nocciolo lievemente ruotati per apprezzare la loro complessità tridimensionale. La fine di ogni catena è stata colorata in ciano, da qui escono le code proteiche che costituiscono ulteriori domini e che legano gli altri due enzimi del complesso. Nel vocciolo di sinistra sono anche state evidenziate in rosa le molecole di coenzima A legate nei siti attivi dell'enzima. ] CICLO DI KREBS (oppure DEGLI ACIDI TRICARBOSSILICI, o dell'ACIDO CITRICO) Ciclo di Krebs Il ciclo di Krebs, o ciclo degli acidi carbossilici, è una via metabolica centrale negli eucarioti che prende posto all'interno dei mitocondri. In tale processo si assiste alla fase centrale della degradazione degli zuccheri, dei grassi, delle proteine per fornire, sotto forma di composti eterogenei, energia. Il ciclo di Krebs, inoltre, è un ciclo anfibolitico poichè gli intermedi di catalisi servono per la sintesi di costituenti essenziali della vita biologica. Le tappe del ciclo di Krebs. (Può essere visto come un orologio che parte da ore 12; la prima metà delle reazioni è riducente, l'altra ossidante) Il ciclo di Krebs è regolato da dieci tappe nelle quali si assistono a diversi tipi di reazioni. Ogni tappa è mediata da almeno un enzima. 1) Condensazione di Acetil-CoA e ossalacetato. 6 Tipo di reazione: Condensazione Reagente: Acetil-coenzima-A, ossalacetato Prodotto: Citrato Enzima coinvolto: Citrato sintasi La prima reazione del ciclo di Krebs è una condensazione tra Ossalacetato ed acetil coenzima A. L'enzima coinvolto è il citrato sintasi che trasferisce il gruppo acetilico dal coenzima A all'ossalacetato. La reazione è fortemente esoergonica e non è reversibile. 2) Deidratazione-Idratazione del citrato. Tipo di reazione: Disidratazione / Idratazione Reagente: Citrato Prodotto: Isocitrato Enzima coinvolto: Aconitasi (moonlight [job] enzyme: che fa il doppio lavoro; inoltre regola l'omeostasi del ferro) Nella seconda reazione il citrato viene disidratato dall'enzima aconitasi. Si forma un intermedio insaturo chiamato cis-aconiato che, per mezzo dello stesso enzima aconiato, viene idratato per formare l'isocitrato. 3) Decarbossilazione ossidativa dell'isocitrato. 7 Tipo di reazione: Deidrogenazione / Decarbossilazione ossidativa Reagente: Isocitrato Prodotto: alfa-chetoglutarato, anidride carbonica. Enzima coinvolto: Isocitrato deidrogenasi, Catalizzatore: Mn++ Nella terza reazione l'isocitrato viene prima deidrogenato ad opera dell'enzima isocitrato deidrogenasi. A seguito di questo evento si verifica una decarbossilazione dovuta al riarrangiamento interno della molecola e viene a formarsi l'alphachetoglutarato. I protoni strappati dall'isocitrato vengono convogliati verso il NAD ossidato (NAD+) Meccanismo della decarbossilazione ossidativa dell'isocitrato: Nel primo passaggio l'isocitrato deidrogenasi strappa due protoni all'isocitrato trasferendoli al NAD+. Segue un riarrangiamento coadiuvato dal catalizzatore Mn++ che, in quanto elettron-attrattore, veicola verso sé gli elettroni del doppio legame alphacarbonilico. A questo punto l'ossigeno carbossilico, che ha tre doppietti, cede una coppia di elettroni per formare il doppio legame carbonio-ossigeno. Il carbonio carbossilico legato in gamma, in quanto pentavalente ed ibridizzato sp2 tende a liberarsi degli elettroni coinvolti nel legame i quali si localizzano tra i carboni alpha e beta. A questo 8 punto si forma un doppio legame tra carbonio alpha e beta che attrae un protone, fortissimo elettrofilo, per formare un legame covalente con il carbonio gamma. La molecola così formata e stabile e prende il nome di alpha-chetoglutarato. 4) Decarbossilazione ossidativa dell'alphachetoglutarato. Tipo di reazione: Deidrogenazione / Decarbossilazione ossidativa Reagente: Alfa-chetoglutarato, Coenzima A Prodotto: Succinil-CoA, anidride carbonica, NADH Enzima coinvolto: Complesso di deidrogenasi dell'alpha-chetoglutarato Nella quarta reazione avviene una decarbossilazione ossidativa preceduta da una deidrogenazione dell'alpha-chetoglutarato operata dal complesso di deidrogenasi dell'alpha-chetoglutarato. Contemporaneamente alla decarbossilazione una molecola di Coenzima A viene addizionata per formare Succinil-CoA. L'anidride carbonica viene liberata dal sistema. 5) Fosforilazione a livello del substrato del Succinil-CoA. Tipo di reazione: Fosforilazione a livello del substrato. Reagente: Succinil-CoA, Fosfato inorganico, GDP 9 Prodotto: Succinato, Coenzima-A Enzima coinvolto: Succinil-CoA sintetasi La quinta reazione avviene al livello del substrato. L'enzima Succinil-CoA sintetasi toglie dal SuccinilCoA il CoA e coadiuva la formazione di un gruppo carbossilico. Il Coenzima A viene reso disponibile e la molecola di GTP è immediatamente disponibile per la sintesi di ATP a partire da ADP. Meccanismo di sintesi del succinato: L'enzima Succinil-CoA sintetasi nel residuo di Istidina è capace di catturare il fosfato inorganico e veicolarslo verso il CoA legato al Succinile. A questo punto avviene una prima sostituzione e si forma un intermedio fosfosuccinico ad alta energia. L'enzima stesso catalizza il trasferimento del gruppo fosforico dal succinilfosfato al GDP formando GTP. Dopo questa reazione l'enzima è libero e viene rilasciato, proprio come viene rilasciato il GTP appena formato assieme al succinato. 6) Deidrogenazione del Succinato (avviene all'interno della membrana mitocondriale; il FADH2 rimane attaccato ad una proteina della membrana). Tipo di reazione: Deidrogenazione reversibile Reagente: Succinato, FAD Prodotto: Fumarato, FADH2 Enzima coinvolto: Succinato deidrogenasi 10 Nella sesta reazione il succinato viene ossidato a fumarato. Interviene l'enzima succinato deidrogenasi che strappa dal succinato due protoni trasferendoli al FAD che diventa FADH2. Il fumarato viene, dunque, sintetizzato. La reazione è modestamente esoergonica per cui è reversibile. 7) Idratazione del fumarato. Tipo di reazione: Idratazione, reversibile Reagente: Fumarato, acqua Prodotto: Malato Enzima coinvolto: Fumarato idratasi La settima reazione vede la sintesi dell' L-Malato a partire dal fumarato. L'enzima fumarato idratasi addizione al doppio legame acqua per formare la molecola di L-Malato. La reazione è modestamente esoergonica per cui è reversibile. 8) Deidrogenazione del L-Malato. Tipo di reazione: Deidrogenazione, reversibile Reagente: Malato, NAD+ Prodotto: Ossalacetato Enzima coinvolto: Malato deidrogenasi L'ottava tappa vede la deidrogenazione del malato per 11 formare ossalacetato. Gli idrogeni strappati vengono trasferiti, mediante l'aiuto fornito dall'enzima malato deidrogenasi, al NAD+ che diventa NADH. A questo punto l'ossalacetato può ripartire dalla tappa numero uno con la condensazione del Coenzima A. La reazione è modestamente esoergonica per cui è reversibile. Bilancio energetico globale (2 x [3NADH + 1 GTP + 2CO2 + 1FADH2]) Di per sé il ciclo di Krebs non produce energia liberamente utilizzabile, se non nella reazione tra Succinil-Coa e Succinato dove si assiste alla formazione di GTP facilmente scambiabile in ATP. Il ciclo, però, fornisce due tipi di cofattori ridotti capaci di trasportare elettroni ad alta energia ovvero il NADH ed il FADH2 che possono essere agilmente utilizzati nella catena respiratoria. Tenendo conto che per ogni molecola di NADH e FADH2, possono essere sintetizzate circa 2,5 molecole di ATP e che una molecola di ATP è facilmente sintetizzabile da GTP nel ciclo di Krebs vengono formate un numero di molecole sufficienti per sintetizzare ben 11 molecole di ATP. CONSIDERAZIONI SUL CICLO DI KREBS - C'è una teoria secondo cui prima il ciclo di Krebs era aperto a metà, dividendo le reazioni riducenti (12 - 6) dalle ossidanti (6-12). - CoAS-COCH3 ---> 2CO2; complessivamente ho coinvolto reazioni 4 molecole di ossigeno: 2 provenienti dall'acqua, 1 dall'acetil-CoA e 1 dal fosfato inorganico. - Il ciclo di Krebs a produrre energia (dai riducenti e sotto forma di ATP e a ossidare ulteriormente il piruvato (è centrale perché i CO2 ottenuti sono forme più ossidate rispetto al sistema iniziale). - Quasi tutti i composti del ciclo di Krebs hanno altri destini (producono intermedi di altri cicli, tipo il malato, che sa attraversare la membrana interna del mitocondrio). - Ci sono anche intrusi nel ciclo di Krebs, tipo il glutammato, che, togliendogli +NH3, introduco a ore 3 12 nel ciclo di Krebs. - Il ciclo ha uno scopo di riciclo e donazione: reazioni anaplerotiche (di rifornimento) ossalacetato riprocessato con carbossil piruvato biotina dipendente. - Un ciclo di Krebs mi dà ZERO molecole in più di ossalacetato; se invece il ciclo inizia a metà, da alfa-chetoglutarato per mezzo di amminoacidi glucogenici guadagno una molecola di ossalacetato (una specie di "OSSALNEOGENESI"). - REGOLAZIONE NELLE REAZIONI IRREVERSIBILI; blocco a feedback per concentrazioni eccessive di acetil-CoA, NADH e ATP; - Avvelenamento (blocco in anticamera del ciclo): se all'acido lipoico si attacca l'arsenico (AsO) deprotonando i due zolfi, legandosi quindi ad entrambi. CICLO DI CALVIN Nelle piante c'è il gliossisoma, un organello che prende 2 molecole di acetil-CoA e ne manda una nel ciclo di Krebs, mentre all'altra gli fa fare quasi un ciclo di Krebs. 13