ENZIMI
Catalizzatori prodotti da cellule viventi ma capaci di
agire indipendentemente da esse
Determinano tutti i processi di degradazione,
sintesi, trasformazione e conservazione
dell’energia nella formazione ed evoluzione della
materia vivente.
Sono PROTEINE spesso associate ad un metallo o
molecola organica
• Gli enzimi sono altamente
specifici sia nei riguardi della
reazione catalizzata sia nei
riguardi dei substrati
• Esiste in vasto repertorio chimico dei gruppi
funzionali degli aa. Tuttavia essi spesso non
riescono a soddisfare i fabbisogni chimici
della catalisi.
• L’attività catalitica di molti enzimi dipende
dalla presenza di piccole molecole,
chiamate cofattori, il cui ruolo può essere
diverso da enzima ad enzima
• La proteina enzimatica senza il suo
cofattore è detto apoenzima, mentre la sua
forma completa e cataliticamente attiva è
detta oloenzima.
• I cofattori possono essere suddivisi in due
gruppi:
• piccole molecole organiche dette coenzimi
• metalli
Il ΔG è utile per comprendere il
funzionamento degli enzimi
• L’energia libera (G) è una funzione
termodinamica che rappresenta una misura
dell’energia utile, cioè dell’energia in
grado di compiere un lavoro
• Il ΔG non fornisce informazioni sulla
velocità di reazione.
• ΔG < 0 non significa che la reazione
avviene ad una velocità apprezzabile
• Gli enzimi aumentano la velocità ma non
influenzano la posizione dell’equilibrio
CATALISI
⇓
legata ai gruppi R degli amminoacidi la cui natura e
disposizione residua individua una tasca detta SITO
ATTIVO. E’ fondamentale la conformazione nativa
della proteina per la sua funzione catalitica.
DENATURAZIONE ⇒ MODIFICA STRUTTURA
NATIVA ⇒ DISATTIVAZIONE DELL’ENZIMA
La formazione del complesso enzimasubstrato è la prima tappa nella catalisi
enzimatica
• Il potere catalitico degli enzimi deriva dalla
loro capacità di avvicinare i substrati con un
orientamento favorevole e promuovere la
formazione di stati di transizione
• Gli enzimi formano il complesso enzimasubstrato (ES) in una specifica regione detta
sito attivo
Il sito attivo di un enzima è la regione a cui si
lega il substrato
E’ costituito da una tasca o fenditura
tridimensionale formata da gruppi che derivano
da parti diverse della sequenza amminoacidica
della proteina
Quasi tutti gli enzimi sono costituiti da più di
100 aa
Il sito attivo occupa una parte relativamente
piccola del volume totale di un enzima
Il sito attivo
Un enzima complementare al suo
substrato potrebbe essere un
cattivo enzima.
Per poter catalizzare una reazione,
un enzima deve essere
complementare allo stato di
transizione della reazione
Meccanismo catalisi enzimatica
CATALISI OMOGENEA
CATALISI ETEROGENEA
sub. e cat. nella stessa fase
sub. e cat. in fasi diverse
Incremento di velocità 108-1020 volte con eventuale fondamentale
intervento di componenti non proteiche (ioni Me o coenzimi).
Struttura tridimenzionale dell’E
fondamentale per la
conoscenza dello stato di transizione e quindi del meccanismo di
reazione.
SITO ATTIVO = PARTE DELL’ENZIMA IN CONTATTO CON
IL SUBSTRATO (zona piccola in confronto alle dimensioni
dell’enzima).
Modificazioni sito attivo scomparsa attività enzimatica.
Struttura primaria e strutture superiori determinate dalla sintesi
proteica = predestinazione di una proteina a funzionare da
enzima.
PM enzimi = da 12000 a 106
Molecola su cui opera l’enzima = substrato
DIMENSIONE ENZIMA » DIMENSIONE SUBSTRATO
Apoenzima(denaturato con cal.)
+
cofattore o gruppo prostetico (stabile al riscaldamento)
⇓
Enzima completo
(oleoenzima)
Enzimi richiedono cofattori per funzionare che possono essere
ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn, Mo etc.) o molecole
organiche (coenzimi) che possono essere:
Ø
Ø
legati debolmente alla proteina
legati saldamente alla proteina (gruppo prostetico)
ATP ⇒ metabolita coezimatico + comune (cosubstrato
modificato nella reazione e dissociato)
NAD+ e NADP+ ⇒ coenzimi nucleotidici piridinici
associati a deidrogenasi che catalizzano il trasferimento di
un H- da un substrato al nucleotide portandolo nella
forma ridotta con rilascio di H+
Coenzima A ⇒ coenzima derivato dall’acido
pantotenico è coinvolto nel trasferimento di gruppi acilici
CH3COAltri coenzimi sono: Biotina, Acido Lipoico, vitamine A,
D, E e K.
Idrolizzano il legame
peptitico e glicosidico
Enzimi identificati da 4 numeri:
1. Appartenenti a una delle classi relative alla
reazione catalizzata
2. Appartenenza ad una sottoclasse
3. Appartenenza ad una sottosottoclasse
4. Posizione progressiva nella sottosottoclasse
Esempio
ATP + glucosio = ADP + glucosio-6-fosfato
Catalizzatore esochinasi (nome comune) o
ATP-glucofosfotransferasi (catalizza il
trasferimento del P da ATP a glucosio).
Numero dell’enzima 2.7.1.1.
2. classe delle transferasi
7. sottoclasse fosfotransferasi
1. sottosottoclasse fosfotransferasi con OH
come gruppo accettore
1.glucosio come accettore del gruppo
fosforico.
Enzima Chirale
riesce a distinguere tra gruppi della
molecola stericamente non equivalenti.
Risulta perciò altamente specifico e distingue due diversi
stereoisomeri o nella reazione con un centro Pro-chirale genera uno
solo dei possibili isomeri (geometrici o ottici)
SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI
Un enzima può avere diversi gradi di specificità:
v Specificità che tiene conto del legame (specificità di legame, Bassa
specificità)
v Specificità che tiene conto di una parte della molecola (specificità di
gruppo)
v Specificità che richiede le due parti della molecola ed il legame che
le unisce (specificità assoluta).
Es.
A-B + H2O = AOH + BH
• la natura di A e B non è importante
• A o B devono essere determinate
• A e B devono essere del tipo appropriato.
Maltasi: catalizza l’idrolisi del maltosio ma essa
può operare sugli α-glucosidi cioè sul glucosio
legato con legame α-glucosidico ad un altro
zucchero qualsiasi (specificità di gruppo).
Meccanismo reazione enzimatica
Catalisi per abbassamento Ea per stabilizzazione chimica
del complesso attivato e/o + corretto orientamento
geometrico per la formazione del complesso attivato
E con S forma ES ad energia + bassa in un equilibrio non
alterato, riuscendo a discriminare tra parecchi substrati
(specificità) in competizione per il S.A. nel quale ci sono
gruppi funzionali che:
• Reagiscono temporaneamente con S
• Predispongono S a formare P
I gruppi catalitici di E interagendo con S lo
preparano (attivano) alla reazione abbassando Ea.
Tra substrato-enzima si forma il complesso ES la
cui energia di legame serve per:
Ø ridurre l’entropia (avvicinamento e orientamento
substrato)
Ø desolvatare il substrato
Ø indurre binding produttivo o adattamento indotto
Dall’energia del legame E-S dipendono la catalisi
e la specificità.
Desolvatazione
DIVERSI TIPI DI CATALISI
Catalisi acido base specifica se dovuta a H+ o OH- o generale se
dovuta a gruppi accettori o donatori di protoni (sulle catene
laterali degli a.a. e più comune al pH 7 della cellula)
Catalisi covalente mediante formazione di un complesso attivato
stabile per la formazione di legami covalenti tra E ed S.
Cinetica Enzimatica
La velocità iniziale di una reazione
aumenta quasi linearmente all'aumentare
della concentrazione di substrato.
Vo
L a v e l o c i t à è d i re t t a m e n t e
proporzionale alla concentrazione
del substrato e la reazione è di
primo ordine V = k [S]
[S]
Cinetica Enzimatica
La proporzionalità fra V e [S]
progressivamente diminuisce.
Vmax
V
La velocità iniziale
diventa indipendente
dalla [substrato] e la
reazione è di ordine zero
rispetto al substrato.
[S]
Il complesso ES è la chiave per comprendere la
cinetica enzimatica
E+S
ES
K1
K-1
K2
K-2
ES
E +P
La seconda reazione è più lenta e quindi limita la
velocità globale.
In qualsiasi istante l’enzima è presente nella forma libera e
in quella combinata. Quando la [S] è bassa, l’enzima sarà
per lo più nella forma libera. Quindi via via che [S] tende ad
aumentare viene favorita la formazione di ES.
• La velocità iniziale massima della reazione
(Vmax) si osserva quando tutto l’enzima è
presente sotto forma di complesso ES.
• Questa condizione, però, esiste solo quando
[S] è elevata. L’effetto saturante del
substrato è una proprietà caratteristica degli
enzimi responsabile dell’appiattimento
della curva.
• E +S
K1
K-1
ES
K2
E +P
• La velocità di catalisi Vo, definita come
moli di prodotto formate al secondo, viene
determinata dalla demolizione di ES per
dare origine a P, quindi
• Vo = K2[ES]
Alla fine
Vo =
Vmax [S]
Km + S
Equazione di Michaelis-Menten
dove:
costante di Michaelis-Menten
Quando Vo= 1/2Vmax
Vmax
2
=
Vmax [S]
Km + S
Dividendo per Vmax si ha:
[S]
1
=
2
Km +[S]
Risolvendo per Km abbiamo Km+[S] = 2S
Oppure Km=[S] quando Vo=1/2 Vmax
Quindi Km è equivalente alla concentrazione
del substrato a cui Vo è metà della Vmax
Vmax e Km possono variare considerevolmente passando
da un enzima all’altro. Sono parametri calcolabili
sperimentalmente
Grafico di Michaelis-Menten
Significato delle costanti cinetiche
• Lo studio della cinetica enzimatica è importante
per vari motivi:
1) Aiutano a comprendere come lavorano gli enzimi
2) Aiutano a comprendere come lavorano in vivo: le
costanti cinetiche Km e Vmax, sono di estrema
importanza per capire come gli enzimi si
coordinano tra loro a livello metabolico
3) Permettono confronti tra organi e tra specie
4) Possono essere usate a scopo clinico-diagnostico
Andamento cinetico
Cinetica Enzimatica
Vo=Vmax
Vmax
V
½
Vmax
Km
[S]
La costante di Michaelis (KM)
KM = K2 +K-1 /K1
K2 è la costante che limita la velocità (stadio lento) per
cui è >> di K-1 che è la costante di dissociazione del
complesso ES
kM kM
kM kM
kM kM
kM
affinità
Quindi la KM è la concentrazione del substrato alla
quale la metà dei siti per il substrato sono saturati.
Quindi KM fornisce una misura della conc di
substrato richiesta affinchè la catalisi abbia luogo
KM e Vmax sono importanti
caratteristiche degli enzimi
• Per la maggior parte degli enzimi KM varia
da 10-1 a 10-7
Effetti della concentrazione dell’enzima
Vmax è direttamente proporzionale alla [E]
Km è indipendente dalla [E] e dalla [S]
• La Vmax esprime il numero di turnover degli
enzimi, cioè il numero di molecole di
substrato convertite in prodotto da una
molecola enzimatica nell’unità di tempo
quando l’enzima è totalmente saturato dal
substrato
Unità Internazionale
la quantità di enzima che catalizza la
formazione di una micromole di prodotto
in un minuto
kcat o numero di turnover
il numero di molecole di substrato convertite in prodotto
nell'unità di tempo da una molecola di enzima quando è
saturata con il substrato.
• Il numero di turnover dipende da k2 che è
detta anche kcat. Se è nota la conc totale di
siti attivi [E]T, allora
• Vmax = k2 [E]T quindi
• K2 = Vmax/ [E]T
E+S
k1
k-1
kcat = k2
kcat
ES
k2
E+P
Vmax = kcat [ET]
kcat kcat
kcat kcat kcat
efficienza catalitica
Enzima
catalasi
kcat
40 000 000
anidrasi carbonica
1 000 000
acetilcolinesterasi
14 000
lattato deidrogenasi
chimotripsina
1 000
100
DNA polimerasi
15
lisozima
0,5
Il rapporto Kcat/KM è una misura
dell’efficienza catalitica
• Quando la conc del substrato è molto più
elevata di KM la velocità della reazione
catalizzata è uguale a Vmax
• Però dentro la cellula la maggior parte degli
enzimi non sono saturati dal substrato
• Riportando l'equazione di Michaelis-Menten nella forma
è possibile ottenere il grafico dei doppi reciproci (o di
Lineweaver-Burk), rappresentando graficamente
l'andamento di 1/V in funzione di 1/[S]. In tal modo si
ottiene una retta con intercetta sull'asse delle ascisse nel
punto - 1/KM, sull'asse delle ordinate nel punto 1/Vmax e
con coefficiente angolare pari al rapporto KM/Vmax.
1
1
KM ⎛ 1 ⎞
⎜⎜ ⎟⎟
=
+
V Vmax Vmax ⎝ [S] ⎠
Che cosa influenza la velocità della reazione?
pH
Chimotripsina
Tripsina
Velocità di reazione
TEMPERATURA
Velocità di reazione
Pepsina
pH
Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi:
Temperatura, °C
• si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima
La velocità
aumenta all’aumentare
di T,
ma nella
• si può modificare
la ionizzazione
di S influenzando
il legame
ES catalisi enzimatica un
aumentoladi
T può portare
admodificandone
una variazionel’affinità
di conformazione
con perdita
• si può modificare
ionizzazione
dell’E
per S
• si può modificare
la ionizzazione
la ionizzazione
del solito
complesso
conseguente
dell’attività
catalitica. Di
si haES
un max di attività tra 40°C e
Gli effetti 260°C
e 3 influenzano
la KM il 4completa
la Vmax. a 90-95 °C.
e la denaturazione
Influenza della temperatura
Lo studio attività/temperatura permette di calcolare dall’equazione di
Arrhenius
K=A e-Ea/RT
dalla cui linearizzazione si possono calcolare:
Ea (molto + basso nelle reazioni enzimaticamente catalizzate)
Q10= coefficiente termico ovvero fattore di cui aumenta la velocità
quando T aumenta di 10°C.
Reazioni non catalizzate Q10= 2
Reazioni catalizzate
1<Q10< 2
Influenza del pH
Andamento variabile con uno o più massimi di attività a
diversi pH. A pH estremi:
• si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima
• si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame
ES
• si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone
l’affinità per S
• si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del
complesso ES
Gli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax.
Fattori che influenzano la velocità di
reazione
•
•
•
•
•
Temperatura
pH
Concentrazione dell’enzima
Concentrazione del substrato
Nel caso di enzimi allosterici anche la
presenza di modulatori positivi e negativi
Temperatura
pH
[E]
[S]
Se mettiamo in grafico V in funzione di [S], troviamo che:
• A bassi valori di [S], la velocità V, aumenta quasi linearmente
con l’aumentare di [S].
• Ma come [S] aumenta, gli aumenti di V diventano via via più
piccoli (iperbole rettangolare).
• L’asintoto rappresenta la velocità massima della reazione,Vmax
• La concentrazione di substrato che produce una V che è la
metà di Vmax è detta costante di Michaelis-Menten, Km.
La maggior parte delle reazioni
chimiche ha più substrati
REAZIONI CON PIU’ SUBSTRATI
Reazioni sequenziali = reazioni con + substrati tutti presenti
affinchè si abbia la liberazione di prodotti
Reazioni a ping-pong = prodotto liberato prima che tutti i substrati siano
stati legati.
S1 per primo si lega ad E che subisce una modificazione per sostituzione
liberando il primo prodotto: poi l’enzima modificato si lega al secondo
substrato S2 formando il secondo prodotto e liberando l’E nella forma
originaria.
SISTEMI MULTIENZIMATICI
Reagiscono in una serie consecutiva di
reazioni in cui P diventa S della reazione
successiva (azione concertata da 2 a 20 E di
reazioni in sequenza).
INIBIZIONE ENZIMATICA
Inibitori (I) =diminuiscono le velocità di reazione
L’inibitore può legarsi all’enzima mediante legami:
Ø Fisici (inibizione reversibile) con l’allontanamento di I si
ripristina l’attività di E
Ø Chimici (inibizione irreversibile) la formazione di legami
covalenti impedisce il semplice allontanamento dell’I.
Inibitori enzimatici (piccole molecole o ioni)
Irreversibili
Reversibili
INIBIZIONE REVERSIBILE
Inibizione competitiva = I compete con S per il sito attivo di E
Si può ridurre aumentando la [S]. Cambia KM non cambia Vmax
Inibizione non competitiva = I si lega ad E in un sito diverso dal
sito attivo.
Si abbassa la Vmax ma non si modifica la KM
Inibizione incompetitiva = I si lega solo al complesso ES.
E + S ↔ ES ↔ E+P;
ES+I ↔ ESI
Si modificano entrambe le costanti cinetiche.
Inibizione Competitiva
Inibizione competitiva per formazione di legami col sito attivo.
I è spesso simile al substrato e si lega al sito attivo dell’enzima
impedendo al substrato di legarsi
Un inibitore competitivo diminuisce la velocità della reazione perché
riduce la frazione di molecole enzimatiche legate al substrato
Un inibitore competitivo
ridurrà l'affinità enzima
substrato, cioè aumenterà
il valore di KM.
Si può rimuovere
aumentando [S]. Ad alte
concentrazioni di substrato
la reazione non viene
rallentata e Vmax è
sempre la stessa.
Alcuni inibitori competitivi sono farmaci molto utili.
La sulfanilammide è un antibiotico contenente S
strutturalmente identico all’acido p-amminobenzoico
(PABA) un metabolita richiesto dai batteri per la sintesi
dell’acido folico. La sulfanilammide si lega all’enzima
che sintetizza la PABA e lo inibisce in modo competitivo
inibendo la sintesi di acido folico.
Altri inibitori competitivi sono le statine che inibiscono la
sintesi del colesterolo
Inibizione non competitiva: inibitore e substrato si
legano
simultaneamente in siti diversi dell’enzima
Inibizione competitiva per cambiamento di conformazione
Gli inibitori non competitivi agiscono diminuendo il numero
di turnover ma non agiscono sulla proporzione di molecole
che legano il substrato
Il substrato può ancora legarsi al complesso EI oltre che
all’enzima da solo. In ogni caso il complesso ESI non
procede verso la formazione dei prodotti
La KM rimane invariata
La Vmax diminuisce
I
L’inibitore abbassa
semplicemente la conc
dell’enzima funzionale
Inibizione incompetitiva: l’inibitore si lega
solo al complesso ES
Il complesso ESI non procede verso la formazione di alcun
prodotto.
Il substrato non viene più convertito in prodotto.
L’inibizione incompetitiva non può essere
rimossa da un eccesso di substrato
Inibizione non
competitiva
Inibitori irreversibili
• Alcuni inibitori irreversibili sono farmaci importanti. La
penicillina agisce modificando covalentemente l’enzima
transpeptidasi e in questo modo la sintesi della parete
batterica viene bloccata e i batteri tendono a morire.
• L’aspirina agisce modificando covalentemente l’enzima
cicloossigenasi riducendo la sintesi dei segnali
infiammatori
Gli inibitori irreversibili si combinano o distruggono un
gruppo funzionale dell’enzima essenziale per l’attività
catalitica.
Es. Inibitori suicidi o inattivatori basati sul meccanismo
che portano avanti le prime tappe della reazione enzimatica
normalmente, poi invece di essere convertiti nel prodotto di
reazione diventando composti molto reattivi che si legano
irreversibilmente all’enzima.
specificità
substrati
reazioni
complementarietà strutturale
mutuo riconoscimento
GLI ENZIMI REGOLATORI
modulazione dell’attività
quantità di proteina enzimatica
regolazione
ENZIMI REGOLATORI
• Gli enzimi regolatori sono capaci di modulare la
attività catalitica in risposta di certi segnali. Nei
metabolismi possono lavorare insieme in modo
sequenziale, ma almeno uno determina la velocità
complessiva catalizzando la reazione più lenta
(enzima regolatore).
• In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni
sequenza è un enzima regolatore.
Vi sono due classi di enzimi regolatori:
Enzimi allosterici che agiscono mediante il
legame reversibile di un metabolita
chiamato modulatore
• Enzimi regolati mediante modificazioni
covalenti reversibili
• Queste due classi di enzimi sono proteine a
struttura quaternaria che spesso non hanno
sulla stessa subunità sito attivo e sito
regolatore.
• Quando il substrato si comporta da
modulatore l’enzima è detto omotropico
• se si tratta di molecola diversa eterotropico
Gli E regolatori non seguono il modello di Michaelis e Menten con
andamento a sigmoide invece che iperbolico della curva Vo –[S] dovuto
a interazioni cooperative tra le subunità dell’E.
