PisAcqua 2010 Patologie delle specie ittiche, igiene degli allevamenti e sicurezza dei prodotti “Patologie virali associate al consumo di molluschi bivalvi HAV e Norovirus” Pisa 7 maggio 2010 Dr. Laura Serracca Trasmissione di virus con gli alimenti: • Sottostimata (inadeguata sorveglianza) – Assenza di metodiche ufficiali • legislazione • Trend in aumento – Maggiore invecchiamento della popolazione – Globalizzazione del commercio Virus negli alimenti Gli alimenti e l’acqua sono veicoli dei virus Eliminati con le feci in grande quantità (108-1010 /g) Bassa dose infettante (10-100 unità virali) Trasmissione oro fecale Sopravvivono nell’ambiente (130 giorni acqua di mare HAV) Sopravvivenza ai trattamenti (clorazione acque, depurazione, congelamento, trattamenti termici domestici…) STABILITA’ DEI VIRUS NELL’AMBIENTE • Le particelle virali hanno proprietà che le rendono stabili alle condizioni ambientali, a valori estremi di pH ed a trattamenti enzimatici (TEMP >60 ° < 0°C) a disinf. Cloro sino a 100 ppm • I virus resistono alle fasi di produzione, processazione e conservazione degli alimenti così possono essere veicolo di contaminazione • Alimenti maggiormente coinvolti sono molluschi bivalvi e vegetali Attività di filtrazione dei molluschi °C Litri/ora Mitilo 14 1,5 Ostrica Europea 15 12 Ostrica Americana 20 18 36-432 litri/giorno Virus trasmessi con gli alimenti: • Virus responsabili di gastroenteriti (astrovirus, rotavirus, adenovirus, calicivirus) • Virus responsabili di epatiti a trasmissione oro-fecale (HAV e HEV) • Virus responsabili di altre manifestazioni cliniche (enterovirus) CLASSIFICAZIONE Virus N° di sierotipi conosciuti Sintomatologia causata ENTEROVIRUS – – – – HEPATOVIRUS CALICIVIRUS • • Poliovirus Echovirus Coxsackievirus A Coxsachievirus B 3 32 23 6 Meningite, paralisi, febbre Meningite, diarrea, rash, febbre, malattie respiratorie Meningite, erpagina, febbre malattie respiratorie Miocarditi, anomalie cardiache congenite, pleurodinia, malattie respiratorie, febbre, rash, meningite Meningiti, encefaliti, congiuntivite acuta emorragica, febbre, malattie respiratorie Epatite infettiva Diarrea, sintomi respiratori Febbre, sintomi respiratori, congiuntiviti, diarrea Non chiaramente stabilito Diarrea, vomito, febbre Diarrea, vomito, in età pediatrica Epatite – Nuovi enterovirus >4 – (tipi 68-71) – Epatite A (ex enterovirus 72) 1 – Rotavirus 6 – Adenovirus 47 – Reovirus 3 – Norovirus1 2 – Sapovirus2 2 – Epatite E 1 – Astrovirus e altri piccoli virus a – struttura rotondeggiante (SRSVs) 5+7 Gastroenteriti – Coronavirus e altri possibili virus – (torovirus, picobirnavirus, – parvovirus, ecc) ? ? 1- anche conosciuti come “Small-Round-Structured-Viruses” o SRSV, prima definiti “Norwalk-like” 2- anche definiti come “Calicivirus tipici”, prima detti “Sapporo-like” Problemi nell’individuazione delle contaminazioni • I prodotti contaminati appaiono normali alla vista ed all’olfatto • Scarsa disponibilità e di impiego routinario delle metodiche di analisi • Mancanza correlazione con indicatori batterici Gastroenteriti virali sono sottostimate: Tradizionalmente confermate da: • Ricerca del virus nelle feci • Sieroconversione Ricerca negli alimenti limitata da: • Assenza di metodi • Non idoneità del campione Metodi tradizionalmente usati per la diagnosi di infezione da virus: Non applicabili alla matrice alimento • • • • Isolamento in colture cellulari Microscopia elettronica ELISA Immunofluorescenza BGM FRHK4 Alcuni dati epidemiologici 32-42 % delle infezioni enteriche negli USA sono virali 27% delle infezioni virali in UK sono attribuibili ad Norov. In Finlandia nel 56% dei casi di gastroenteriti umane virali è stata riscontrata presenza di Norov. 84 mila casi di HAV all’anno in USA: il 5% di origine alimentare Virus ed infezioni alimentari Italia: alcuni dati epidemiologici ITALIA: diminuzione dei casi di epatite A nel periodo 1985-1990 (10/100 mila a 2/100 mila). Minimo storico nella II metà anni 80 e nel 1995. Aumento dell’incidenza dopo il 1991. LA SPEZIA: (2002) focolaio di Noro per consumo di ostriche CAMPANIA nel 2004 882 casi di Epatite A TAORMINA: nel 2003 crociera con decine di gastroenteriti da Noro EMILIA ROMAGNA: Aumento nel n° di casi epatite A nel periodo 1996-99. Nel 1999 il 70% dei casi ha reso necessario il ricovero (almeno 10 giorni) PUGLIA: 11 mila casi di epatite A nel 1997 (molluschi) Source - Koopmans 2002; Costa-Mattioli 2003 SEIEVA) CASI NEL MONDO DI PATOLOGIE DA VIRUS PER CONSUMO DI MOLLUSCHI ANNO VIRUS LUOGO N. CASI BIVALVE 1991 HAV CINA 300.000 VONGOLE PUGLIA (9 MORTI) 5.649 AQUA/ 11.000 MOLLUSCHI AQUA/ 1996 1996 HAV HAV PUGLIA MOLLUSCHI 2000 2004 HAV HAV SPAGNA ITALIA 183 OSTRICHE 800 (IMP.PERU’) MITILI Norovirus • Piccole dimensioni, sferici, senza envelope • Calicivirus • Genoma RNA a singola elica e a polarità positiva (7.3 - 7.6 kb) • Norovirus 5 genogruppi e 30 genotipi • Insorgenza rapida 24-48 ore • Sintomatologia: vomito diarrea febbre bassa o asente Norovirus Diagnosi tradizionale : Sequenziamento e analisi filogenetica dei prodotti della RT-PCR per evidenziare diversi genotipi Limiti: Costoso Non applicabile in tutti i laboratori Non idoneo allo screening di molti campioni Non evidenzia infettività Calicivirus umani Genogruppi GGI GGII GG IV Norovirus Hawaii NV HV Snow Mountain Melksham SMA OTH-25 Mexico Toronto TV Camberwell Bristol Lordsdale LV Metodi diagnostici per Norov. • RT-PCR verso la regione pol del genoma (gene della RNA polimerasi) altamente conservata • Sequenziamento della regione capsidica ORF 2 per distinguere i due genogruppi (GGI e GGII che possono diversificare sino al 50% dei nucleotidi) e per l’assegnazione in cluster: sono stati descritti 7 genotipi in GGI e 8 in GGII Zoonosi virali e consumo molluschi Virus Epatite A Famiglia Picornaviridae, genere Hepatovirus Piccole dimensioni, sferici, senza envelope RNAss lineare a polarità positiva Ciclo oro-fecale Colonizzazione intestinale ed epatica Incubazione: Incubazione 30 giorni Picco di virus nelle feci: feci 2 settimane prima della comparsa dei sintomi (ittero, febbre, spossatezza, inappetenza); Ep-A fulminante=morte Epatite A: distribuzione mondiale Incidenza Italia: 7 casi /100.000 abitanti EPIDEMIOLOGIA E PREVENZIONE Dati di letteratura evidenziano come circa il 25% dei campioni di molluschi epatite A -positivi in PCR contengano particelle infettanti (positivi sulle cellule) Migliori condizioni igienico sanitarie Prevenzione Controllo molluschi e catena di distribuzione Informazione modalità di consumo Profilassi immunizzante Epatite A Virus sferico con un diametro di 27-32 nm Genoma RNA a polarità positiva di circa 7.5 kb codificante poliproteina Regione 5’: proteine strutturali (4) (segmento A) Regione 3’: proteine non strutturali (7) (segmentoB-C) A 5' UTR VP4 VP2 B VP3 C VP1 2A 2B 2C 3A 3B 3C 3D 3' UTR Fig. 1: Rappresentazione schematica del genoma dell’ Epatite A PRIMERS: Regione VP3-VP1 capside AV1: 5’ GGAAATGTCTCAGGTACTTTCTTTG 3’ AV2: 5’ GTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATG 3’ AV3: 5’ TCCTCAATTGTTGTGATAGC 3’ Determinazione del virus HAV Laboratorio Microbiologia Marina ESTRAZIONE 7-10 gg Retro trascrizione Rt-PCR HEMI-NESTED Laboratorio Biotecnologie Torino 40-50 gg Frp3/Frhk4 Dopo 10/20/30 gg VALIDAZIONE HAV SVILUPPO DI UN NUOVO METODO MESSA A PUNTO/OTTIMIZZAZIONE DEL METODO STUDIO PILOTA/PRE-VALIDAZIONE VALIDAZIONE VERIFICA DEGLI INDICI DI PERFORMANCE PROCEDURA DEL METODO VALIDATO RAPPORTO DI VALIDAZIONE ALLERTA HAV Virus epatite A in telline dal Peru’ congelate via Spagna. Notifica 2008 n.1079 del 10/09/2008 Rintracciati e distrutti 2500 kg Allerta n 1387 del 20.10.2009 virus epatite A in Clam (Mercenaria mercenaria) Grazie per l’attenzione