PisAcqua
2010
Patologie delle specie ittiche, igiene
degli allevamenti e sicurezza dei
prodotti
“Patologie virali associate al consumo di
molluschi bivalvi HAV e Norovirus”
Pisa 7 maggio 2010
Dr. Laura Serracca
Trasmissione di virus con gli
alimenti:
• Sottostimata (inadeguata
sorveglianza)
– Assenza di metodiche ufficiali
• legislazione
• Trend in aumento
– Maggiore invecchiamento della
popolazione
– Globalizzazione del commercio
Virus negli alimenti
Gli alimenti e l’acqua sono veicoli dei virus
Eliminati con le feci in grande quantità
(108-1010 /g)
Bassa dose infettante (10-100 unità virali)
Trasmissione oro fecale
Sopravvivono nell’ambiente (130 giorni
acqua di mare HAV)
Sopravvivenza ai trattamenti (clorazione
acque, depurazione, congelamento,
trattamenti termici domestici…)
STABILITA’ DEI VIRUS NELL’AMBIENTE
• Le particelle virali hanno proprietà che le
rendono stabili alle condizioni ambientali, a
valori estremi di pH ed a trattamenti
enzimatici (TEMP >60 ° < 0°C)
a disinf. Cloro sino a 100 ppm
• I virus resistono alle fasi di produzione,
processazione
e
conservazione
degli
alimenti così possono essere veicolo di
contaminazione
• Alimenti maggiormente coinvolti sono
molluschi bivalvi e vegetali
Attività di filtrazione dei
molluschi
°C
Litri/ora
Mitilo
14
1,5
Ostrica Europea
15
12
Ostrica Americana
20
18
36-432 litri/giorno
Virus trasmessi con gli
alimenti:
• Virus responsabili di gastroenteriti
(astrovirus, rotavirus, adenovirus, calicivirus)
• Virus responsabili di epatiti a
trasmissione oro-fecale (HAV e HEV)
• Virus responsabili di altre
manifestazioni cliniche (enterovirus)
CLASSIFICAZIONE
Virus
N° di sierotipi conosciuti
Sintomatologia causata
ENTEROVIRUS
–
–
–
–
HEPATOVIRUS
CALICIVIRUS
•
•
Poliovirus
Echovirus
Coxsackievirus A
Coxsachievirus B
3
32
23
6
Meningite, paralisi, febbre
Meningite, diarrea, rash, febbre, malattie respiratorie
Meningite, erpagina, febbre malattie respiratorie
Miocarditi, anomalie cardiache congenite, pleurodinia,
malattie respiratorie, febbre, rash, meningite
Meningiti, encefaliti, congiuntivite acuta
emorragica, febbre, malattie respiratorie
Epatite infettiva
Diarrea, sintomi respiratori
Febbre, sintomi respiratori, congiuntiviti, diarrea
Non chiaramente stabilito
Diarrea, vomito, febbre
Diarrea, vomito, in età pediatrica
Epatite
– Nuovi enterovirus
>4
– (tipi 68-71)
– Epatite A (ex enterovirus 72) 1
– Rotavirus
6
– Adenovirus
47
– Reovirus
3
– Norovirus1
2
– Sapovirus2
2
– Epatite E
1
– Astrovirus e altri piccoli virus a
– struttura rotondeggiante (SRSVs)
5+7
Gastroenteriti
– Coronavirus e altri possibili virus
– (torovirus, picobirnavirus,
– parvovirus, ecc)
?
?
1- anche conosciuti come “Small-Round-Structured-Viruses” o SRSV, prima definiti “Norwalk-like”
2- anche definiti come “Calicivirus tipici”, prima detti “Sapporo-like”
Problemi nell’individuazione
delle contaminazioni
• I prodotti contaminati appaiono normali alla
vista ed all’olfatto
• Scarsa disponibilità e di impiego routinario delle
metodiche di analisi
•
Mancanza correlazione con indicatori batterici
Gastroenteriti virali sono
sottostimate:
Tradizionalmente confermate da:
• Ricerca del virus nelle feci
• Sieroconversione
Ricerca negli alimenti limitata da:
• Assenza di metodi
• Non idoneità del campione
Metodi tradizionalmente usati per
la diagnosi di infezione da virus:
Non applicabili alla matrice alimento
•
•
•
•
Isolamento in colture cellulari
Microscopia elettronica
ELISA
Immunofluorescenza
BGM
FRHK4
Alcuni dati epidemiologici
32-42 % delle infezioni enteriche negli USA sono virali
27% delle infezioni virali in UK sono attribuibili ad Norov.
In Finlandia nel 56% dei casi di gastroenteriti umane
virali è stata riscontrata presenza di Norov.
84 mila casi di HAV all’anno in USA: il 5% di origine
alimentare
Virus ed infezioni alimentari
Italia: alcuni dati epidemiologici
ITALIA: diminuzione dei casi di epatite A nel periodo 1985-1990 (10/100 mila a 2/100 mila).
Minimo storico nella II metà anni 80 e nel 1995. Aumento dell’incidenza dopo il 1991.
LA SPEZIA: (2002)
focolaio di Noro
per consumo di
ostriche
CAMPANIA nel 2004
882 casi di Epatite A
TAORMINA:
nel 2003 crociera con decine
di gastroenteriti da Noro
EMILIA ROMAGNA:
Aumento nel n° di casi epatite A
nel periodo 1996-99.
Nel 1999 il 70% dei casi ha reso
necessario il ricovero
(almeno 10 giorni)
PUGLIA: 11 mila casi di
epatite A nel 1997
(molluschi)
Source - Koopmans 2002; Costa-Mattioli 2003 SEIEVA)
CASI NEL MONDO DI PATOLOGIE DA
VIRUS PER CONSUMO DI MOLLUSCHI
ANNO
VIRUS
LUOGO
N. CASI
BIVALVE
1991
HAV
CINA
300.000
VONGOLE
PUGLIA
(9 MORTI)
5.649
AQUA/
11.000
MOLLUSCHI
AQUA/
1996
1996
HAV
HAV
PUGLIA
MOLLUSCHI
2000
2004
HAV
HAV
SPAGNA
ITALIA
183
OSTRICHE
800
(IMP.PERU’)
MITILI
Norovirus
• Piccole dimensioni, sferici, senza envelope
• Calicivirus
• Genoma RNA a singola elica e a polarità
positiva (7.3 - 7.6 kb)
• Norovirus 5 genogruppi e
30 genotipi
• Insorgenza rapida 24-48 ore
• Sintomatologia: vomito diarrea
febbre bassa o asente
Norovirus
Diagnosi tradizionale :
Sequenziamento e analisi filogenetica dei
prodotti della RT-PCR per evidenziare
diversi genotipi
Limiti:
Costoso
Non applicabile in tutti i laboratori
Non idoneo allo screening di molti campioni
Non evidenzia infettività
Calicivirus umani
Genogruppi
GGI
GGII
GG IV
Norovirus
Hawaii
NV
HV
Snow Mountain
Melksham
SMA
OTH-25
Mexico
Toronto
TV
Camberwell
Bristol
Lordsdale
LV
Metodi diagnostici per Norov.
• RT-PCR verso la regione pol del genoma
(gene della RNA polimerasi) altamente
conservata
• Sequenziamento della regione capsidica
ORF 2 per distinguere i due genogruppi
(GGI e GGII che possono diversificare sino
al 50% dei nucleotidi) e per l’assegnazione
in cluster: sono stati descritti 7 genotipi in
GGI e 8 in GGII
Zoonosi virali e consumo molluschi
Virus Epatite A
Famiglia Picornaviridae, genere Hepatovirus
Piccole dimensioni, sferici, senza envelope
RNAss lineare a polarità positiva
Ciclo oro-fecale
Colonizzazione intestinale ed epatica
Incubazione:
Incubazione 30 giorni
Picco di virus nelle feci:
feci 2 settimane prima
della comparsa dei sintomi (ittero, febbre,
spossatezza, inappetenza); Ep-A
fulminante=morte
Epatite A: distribuzione
mondiale
Incidenza Italia: 7 casi /100.000 abitanti
EPIDEMIOLOGIA E
PREVENZIONE
Dati di letteratura evidenziano come circa il
25% dei campioni di molluschi epatite A
-positivi in PCR contengano particelle
infettanti (positivi sulle cellule)
Migliori condizioni igienico sanitarie
Prevenzione
Controllo molluschi e catena di distribuzione
Informazione modalità di consumo
Profilassi immunizzante
Epatite A
Virus sferico con un diametro di 27-32 nm
Genoma RNA a polarità positiva di circa 7.5 kb
codificante poliproteina
Regione 5’: proteine strutturali (4) (segmento A)
Regione 3’: proteine non strutturali (7) (segmentoB-C)
A
5' UTR
VP4
VP2
B
VP3
C
VP1 2A 2B 2C 3A 3B 3C 3D
3' UTR
Fig. 1: Rappresentazione schematica del genoma dell’ Epatite A
PRIMERS:
Regione VP3-VP1
capside
AV1: 5’ GGAAATGTCTCAGGTACTTTCTTTG 3’
AV2: 5’ GTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATG 3’
AV3: 5’ TCCTCAATTGTTGTGATAGC 3’
Determinazione del virus HAV
Laboratorio Microbiologia Marina
ESTRAZIONE
7-10 gg
Retro trascrizione
Rt-PCR
HEMI-NESTED
Laboratorio Biotecnologie Torino
40-50 gg
Frp3/Frhk4
Dopo 10/20/30 gg
VALIDAZIONE HAV
SVILUPPO DI UN NUOVO METODO
MESSA A PUNTO/OTTIMIZZAZIONE DEL METODO
STUDIO PILOTA/PRE-VALIDAZIONE
VALIDAZIONE
VERIFICA DEGLI INDICI DI PERFORMANCE
PROCEDURA DEL METODO VALIDATO
RAPPORTO DI VALIDAZIONE
ALLERTA HAV
Virus epatite A in telline dal Peru’
congelate via Spagna.
Notifica 2008 n.1079 del 10/09/2008
Rintracciati e
distrutti 2500 kg
Allerta n 1387 del 20.10.2009 virus epatite A
in Clam (Mercenaria mercenaria)
Grazie per l’attenzione
