Gestione dei terrini di coltura e degli incubatori
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GESTIONE DEI TERRENI DI COLTURA E DEGLI INCUBATORI NEL LABORATORIO IVF M.L. Papale CRA s.r.l. Catania Introduzione GOOD LABORATORY PRACTICE QUALITY Invisible when “good”, impossible to ignore when “bad” “People forget how fast you did a job but they remember how well you did it” Howard W. Newton “Quality is never an accident, it is always the result of intelligent efforts” John Ruskin “Quality is never an accident; it is always the result of high intention, sincere effort, intelligent direction and skilfull execution; it represents the wise choice of many alternatives” William A. Foster CRA Qualità nel laboratorio IVF Alti livelli di “patients care” Alti tassi di successo Quality Control (QC): L’insieme delle azioni ed iniziative che consentono di definire e tenere sotto controllo gli standard qualitativi richiesti. Quality Assurance (QA): L’insieme di tutte le attività pianificate e sistematiche richieste, in grado di garantire il soddisfacimento degli obiettivi della qualità CRA Qualità nel laboratorio IVF Quality Improvement: Gestione del rischio Valutazione della qualità Risoluzione dei problemi Say what you do… …do what you say… and Show that you do as you say CRA PDCA CYCLE IVF Stimulation PATIENT Oocyte quality N° of Incubator Oil overlay Gas phase CRA CULTURE SYSTEM LABORATORY Embryo transfer and luteal support N° of Embriologist and training level Air quality N° of embryos/drop Tissue culture- ware / contact supplies Culture media OUTCOME QC & QA Oocyte/Embryo handling outside the incubator Gardner and Lane, 2007 Colture embrionali I principi base: Favorire la fertilizzazione e lo sviluppo embrionale in vitro “Normale” fertilizzazione “Normale” sviluppo embrionale Selezionare gli embrioni per il replacement in utero Elevato birth rate e bassa percentuale di gravidanze multiple Ottenere embrioni disponibili per la crioconservazione( ??? ) Evitare i fattori che possono influenzare lo sviluppo embrionale dopo l’impianto ( epigenetica ) CRA A. Sunde, 2010 Mantenere la vitalità embrionale Gli embrioni in vitro sono esposti a stress significativamente più alti che non in vivo La vitalità embrionale in vitro dipende da: Composizione dei terreni di coltura Qualità dei terreni di coltura Caratteristiche fisico-chimiche dei terreni di coltura pH osmolarità temperatura Ambiente gassoso: O2 & CO2 Condizione di coltura CRA E. Van den Abbeel, 2010 Conseguenze dello stress in vitro Ritardi nello sviluppo embrionale Arresto nello sviluppo spesso prima dell’attivazione del genoma embrionale Alterazione della fisiologia embrionale, in particolare del metabolismo Alterazione dell’espressione genica Alterazione dell’imprinting di alcuni geni Alterazione della vitalità CRA E. Van den Abbeel, 2010 Considerazioni L’embrione prima dell’impianto non fa parte del corpo materno. Gli embrioni prima dell’impianto sono circondati da una ancora indefinita quantità di fluido tubarico ed uterino che è molto diluito. Lo zigote è programmato per intrinsecamente l’hatching senza necessità di stimoli esterni. CRA G. Vayta, et al., 2010 Considerazioni Prima settimana dello sviluppo embrionale Prima divisione Attivazione del materno genoma Compattazione della morula Formazione della Blastocisti Eventi esattamente programmati Riprogrammazione epigenetica, attivazione del metabolismo e cell allocation CRA G. Vayta, et al., 2010 Definizione di un buon terreno di coltura Definire i criteri di valutazione: 1) Performance Risultati clinici – gravidanze Sicurezza Documentazione 2) Produttore Documentazione Design philosophy Affidabilità e convenienza - Distribuzione e trasporto Scadenza CRA A. Sunde, 2010 Scelta del terreno di coltura PERFORMANCE OUTCOMES TAKE HOME BABY CRA COSTI/BENEFICI Fonti principali di stress ossidativo Esposizione alla luce Tracce di metalli di transizione nei terreni di coltura Alta concentrazione di ossigeno (20%) Antiossidanti – Combattere le Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) Possono presentarsi come normale prodotto del metabolismo cellulare. La composizione dei terreni di coltura può influenzare il tasso di produzione dei ROS. La maggior parte dei terreni in commercio contiene antiossidanti. Concentrazione di O2 – 5% vs 20% O2 ?? – dibattito in corso … CRA E. Van den Abbeel, 2010 Design dei terreni di coltura Henry Leese, York: “It seems that is it the quiet embryos that implant” “Metabolically silent” Gli embrioni che hanno un metabolismo più alto hanno un tasso di impianto inferiore ? “Embrione stressato” Approccio Hands-off Embrione silente No stress Composizione simile a quella fisiologica Assenza di componenti bioattivi, ormoni e fattori di crescita CRA Approccio Hands-in Stress/stimolo d e l l ’e m b r i o n e Presenza di componenti bioattivi R i s p o n d e s o l o l ’e m b r i o n e migliore? A. Sunde, 2010 Successo clinico Un buon sistema di coltura dovrebbe garantire: Alto tasso di fertilizzazione Clivaggio corretto e buona morfologia embrionale Un alto numero di embrioni con buona morfologia Un alto pregnancy rate con transfer da fresco Un basso tasso di aborti Un alto cumulative delivery rate (fresh + frozen) Un basso tasso di gravidanze multiple CRA A. Sunde, 2010 Challenges In Vitro Problema: • Temperatura – Gli ovociti non tollerano l’ipotermia • pH – Esiste una relazione intrinseca tra regolazione del pH e concentrazione di CO2 • Osmolarità – può verificarsi evaporazione • Luce – La luce diretta può danneggiare il terreno di coltura – I raggi UV possono danneggiare gli embrioni CRA Soluzione: • Lavorare velocemente – Controllo continuo della T (sonde, termometri, piani riscaldati, etc); – Coltura con olio • Lavorare velocemente – Utilizzare buffers (HEPES etc…) – Coltura con olio • Lavorare velocemente – Coprire con olio – Aggiungere osmoliti? • Evitare l’esposizione alla luce A. Sunde, 2010 Challenges In Vitro Problema: Soluzione: • Contaminanti chimici - Componenti dei terreni di coltura o i terreni stessi • Utilizzare terreni con certificazioni di qualità del produttore - Volatile Organic Components (VOC) • “Air quality” in laboratorio e quindi negli incubatori Pulire e/o sterilizzare i nuovi strumenti CRA A. Sunde, 2010 Challenges In Vitro Problema: Soluzione: • Microrganismi – I follicoli aspirati contengono spesso flora vaginale – Il liquido seminale può contenere microrganismi. – Gli operatori, le colture e le metodiche di preparazione possono introdurre microrganismi nel sistema • Aggiungere antibiotici – Penicillina – Streptomicina – Gentamicina • Gli embrioni sono sensibili alle endotossine • Monitorare la qualità dell’aria • Utilizzare materiale monouso destinato all’ART. CRA • Good working routines • Tenere puliti le superfici di lavoro, microscopi ed incubatori A. Sunde, 2010 Embryo tested disposable MEA Test e HSSA Test (embrio-citotossicità) Rintracciabilità e controllo di tutti i lotti LAL Test (endotossine batteriche) ISO 11137 e ISO 13485 (Sterile R) Ames Test (per le mutazioni geniche) Marchio CE USP Classe VI (reazione cellulare al contatto diretto o indiretto con la plastica) CRA Migliorare la coltura embrionale Umidità all’interno dell’incubatore Gocce da 10-80µl Coltura sotto olio Mantiene separate le gocce le une dalle altre Previene la rapida evaporazione Previene le variazioni di pH e temperatura QUESTIONS TO ANSWER Monocolture o terreni sequenziali? Rinnovare il terreno? Supplementazione con macromolecole Concentrazione dell’O2 Communal o individual culture CRA Mantenere il microambiente??? Incrementare la formazione di blastocisti e l’I.R. ? Bassa concentrazione ? Aumentare il numero di blastomeri e l’impianto ? G. Vajta, 2010 Mantenimento della qualità USA EU 24 h – 48 h >48 h ? Australia Verificare corrispondenza lotto Verificare Refrigerazione ALIQUOTARE CRA CRA Studio dell’uso di 2 diversi terreni di coltura - CRA srl 2011 o I 2 gruppi di ICSI sono stati divisi tra M1 e M2 solo in base al numero “ciclo ID “( pari o dispari ). o Dopo l’analisi dei dati , nessuna differenza di età ( 34.6 vs 35.1 ), percentuale di patologia femminile e /o maschile era presente tra i due gruppi ICSI. o Parametri fondamentali di confronto : % 2PN , % G1 , % Gr.Cl , % I.R. CRA Risultati di uno studio dell’uso di 2 diversi terreni di coltura CRA srl 2011 N. ICSI M1 M2 M1 % M2 % 46 50 47.9 52.1 65 74 % 2PN % Em.G1Ot 50/156 82/240 32 34 % Em.G1Tr 50/110 74/140 45 53 6/46 16/50 13 32* 10/110 24/140 9 17* % Gr. Cl. % I.R. χ >0.65 *NS per numero di casi CRA CONCLUSIONI • Obiettività / Criticità sull’uso di un medium da parte di altri laboratori • Distanza di produzione • Qualità della produzione • Certificati di analisi e componenti • Uso preventivo , in parallelo , con il medium in uso • Valutazioni dei dati , anche a breve termine ! • Costi / benefici CRA Preimplantation embryo is a free-living organism Periodo critico per determinare la competenza dell’ovocita Condizioni di coltura non ottimali possono alterare irreversibilmente accrescimento e sviluppo fetale e postnatale Periodo critico per determinare la qualità della blastocisti EMBRIONE CONDIZIONI DI COLTURA ??? ↑Parti pretermine ↑Mortalità prenatale Basso peso alla nascita Doyle, 1992 Hansen, 2002 Oliveness, 2002 Estremamente vulnerabile CRA ↑Numero embrioni di Bassa concentrazione di O2→ 5% buona qualità Ottima % di clivaggio No frammentazione Expanded Blastocoel Blastocisti Cohesive Trophoectoderm qualità di buona ICM Oval Shaped Kovacic e Vlaisavijevic (2008) 5% O2 VS 20% O 2 988 ovociti La concentrazione di O2 non ha effetto sulla percentuale di fertilizzazione, ma solo sulla capacità di formare blastocisti di buona qualità. 31% di Blastocisti con il 5% O2 CRA VS 15% di Blastocisti con il 20% O2 Varghese, AC et al.2011. (Article in Press) Terreni di coltura Sovrapproduzione di ROS dovuta ad alti livelli di O2 durante le procedure IVF Alterata espressione genica Compromessa produzione di energia CRA Tensione di O2 in vivo ≠ da tensione di O2 in vitro Maggiore esposizione degli embrioni ai ROS Condizioni di coltura non ottimali Danneggiamento dell’ovocita Alterazione dello sviluppo embrionale Varghese, AC et al.2011. (Article in Press) Piccoli cambiamenti dei terreni di coltura possono determinare significativi cambiamenti dell’assetto genetico laddove esista il rischio della non disgiunzione Aumento del pH al di sopra di 7.45 → Frammentazione Esposizione a T <37°C per più di 10 minuti → disorganizzazione dello spindle ? CRA Varghese, AC et al.2011. (Article in Press) Stimolazione ormonale Pick-up FIVET ICSI/Micromanipolazione Effetti a lungo termine Espressione Genica 700 geni Bimbi “IVF” Bimbi concepiti naturalmente Piccola ma significativa riduzione della metilazione del DNA Caratteristiche genetiche della popolazione infertile CRA Stress in vitro??? Varghese, AC et al.2011. (Article in Press) Incubatori La chiave per il successo della coltura embrionale è minimizzare le perturbazioni dell’ambiente attorno all’embrione. TEMPERATURA COMPOSIZIONE DEI TERRENI DI COLTURA CRA QUALITA’ DELL’ARIA GAS Gas phase e pH pH 7.2-7.6 Osmolarità 0.276 Condizioni ottimali per i gameti Garantita da: 5-6% CO2all’interno dell’incubatore Misurazione del pH: – Standard gas pH probes – ISFET probes – pH meter – MTG pH meter – Bloodgas analyser Utilizzo di sistemi tampone Temperatura di 37°C Rapide variazioni di CO2 non sono evidenziabili dal cambiamento del pH Occorre Misurare la CO2 Difficoltà: accuratezza, errore, contaminazione, non utilizzabili nella routine CRA R. Janssens, 2010 Misurare la CO2 e la temperatura Metodo riproducibile e affidabile, Veloce e facile da ripetere, Rileva rapidi variazioni nella concentrazione Dal 1969 è ampiamente dimostrato che la temperatura più adatta alle colture embrionali è di 37°C. della CO2 (malfunzionamento dell’incubatore). Colture sotto olio per ridurre le variazioni di pH osmolarità e temperatura Gli strumenti per taratura e controllo devono essere certificati dal Sistema di Taratura Italiano (SIT) CRA R. Janssens, 2010 Qualità dell’aria Il massimo controllo della contaminazione viene garantito limitando al minimo il rischio di contaminanti presenti nell’aria, nell’acqua e sulle superfici. DEFINIZIONE DELLA QUALITÀ DELL’ARIA Le classificazioni della qualità dell’aria sono definite dalle norme Federal Standard 209E e dallo Standard internazionale ISO 14644-1 (Classe 1, 10, 100 e ISO Classe 1, 2,…). Il numero della classe definito dal Federal Standard rappresenta il massimo numero consentito di particelle di 0,5 micron o di dimensioni maggiori presenti in un piede cubo d’aria. La classe 2 ISO è quella che meglio corrisponde alla classe 100 dello Standard federale. Filtrazione HEPA 100% per ottenere rapidamente condizioni di qualità dell’aria di classe 100. Il filtro HEPA cattura i contaminanti biologici e particolati aero-dispersi impedendone la diffusione. HEPA CRA Sistema di filtrazione dei VOC Composti Organici Volatili I VOC possono dividersi in due categorie: Antropogenici (benzene, toluene, metano, CCl4, etano, etc…). Biogenici (terpeni, isoprene, alcoli, aldeidi e chetoni) Le emissioni biogeniche dominano spesso quelle di carattere antropogenico, soprattutto nel periodo estivo in concomitanza dell'aumento del quantitativo di ozono. Membrane a Carbonio Attivo Membrane a Carbonio Attivo La filtrazione sui carboni attivi è una tecnologia di depurazione dell’aria per mezzo della quale una corrente gassosa viene privata degli elementi inquinanti facendola passare attraverso un filtro che contiene carbone attivo. L'operazione si basa sulla capacità del carbone attivo di adsorbire, grazie alla sua porosità, la maggior parte delle sostanze organiche e sulla conseguente possibilità di estrarle utilizzando un "veicolo" che generalmente è vapore o azoto. Il carbone attivo è costituito per la gran parte da atomi di carbonio di origine vegetale o minerale, è caratterizzato da una porosità estremamente elevata e ha un colore nero; si può trovare in polvere (PAC) in granuli (GAC). Meccanismo L’adsorbimento è un fenomeno prevalentemente fisico, in cui le molecole delle sostanze adsorbite vengono trattenute sul carbone da forze deboli tipo Van der Wals. Al contempo vi è una parziale deposizione delle particelle colloidali sulla superficie del carbone. Mediante il trattamento a carboni attivi la corrente aeriforme viene aspirata da uno o più ventilatori, a valle dei quali può essere installato un filtro a protezione del carbone e una batteria di condizionamento (per ottimizzare umidità e temperatura). Il carbone è contenuto negli assorbitori, di cui almeno uno in fase di rigenerazione. L'aeriforme inquinato, attraversando il carbone, deposita gli organici e viene direttamente espulso depurato al camino. Ciclicamente, in controcorrente, il carbone viene rigenerato da un flusso di vapore o azoto. CRA Qualità dell’aria Sistema di filtrazione dei composti organici volatili (VOC). Elimina i composti organici volatili tossici che entrano in laboratorio dall’ambiente esterno : aria ….incubatori….colture….embrioni ! Potenzialmente presenti anche negli articoli in plastica che vengono introdotti nell’incubatore. Uso di plastica Embryo tested CRA Dentro l’incubatore La concentrazione di CO2 dipende dal terreno di coltura utilizzato e deve essere monitorata. Il pH dei terreni di coltura dovrebbe essere controllato. Le fluttuazioni di temperatura dovrebbero essere evitate. L’aria dovrebbe essere filtrata e purificata. CRA Incubatori Standard CRA Incubatori Standard Incubatori a camicia d’acqua Massima protezione e rapidità di ripristino termico dagli sbalzi della temperatura ambiente e dalle oscillazioni della alimentazione elettrica. Porta ermetica e termoriscaldata Sensore CO2 IR o T/C Filtri HEPA e VOC Sportelli interni? Affidabilità - Allarme acustico - Possibilità di utilizzo di sonde indipendenti - Commutatore telefonico - UPS / GE Ergonomico: i ripiani devono facilmente accessibili Facile da pulire e disinfettare CRA essere Mini Incubatori Ripristino veloce della temperatura Ripristino veloce del pH Facile da pulire Facile accesso Piccole dimensioni Riduce al minimo il consumo di gas Utilizza una piastra per paziente per un totale di 4 pazienti 4 aperture a paziente ….. ma per 4 pazienti in giorni diversi di check !!! Utilizza pre-mixed gas Costi molto alti Difficoltà ad effettuare monitoraggi costanti CRA Good Laboratory Practice Temperatura: 37°C ± 0.1 Umidità > 90% Daily record di temperatura e CO2 Controllare il pH dei terreni di coltura quando si introduce un nuovo lotto Sostituire l’acqua una volta alla settimana (acqua ultrapura) Pulire i ripiani una volta alla settimana Campionamenti microbiologici ogni trimestre Sostituire i filtri HEPA e VOC ogni anno Cosa fare e non fare CRA Leggere sempre il manuale prima di utilizzare l’incubatore “If it is not broken, do not fix it” (controlli di routine) Non introdurre contenitori con etichette Ricordare che l’ambiente del laboratorio può avere effetti sull’ambiente dell’incubatore Grazie per l’attenzione! Ginecologia Embriologia Dir.Clinico Prof.G.Giuffrida Dir.Laboratorio IVF/ICSI Dott.ssa M.L. Papale Prof. M. Palumbo Dott. A. Mangiacasale Dott.ssa T. Pasqualetto Dott. A. Giuffrida Dott. L. Di Leo Dott.ssa A. Aglianò Dott.ssa G. Petralia CRA Dott.ssa R. Cavallaro Dott.ssa G. Tomasi Dott.ssa A. Bruno
