Gestione dei terrini di coltura e degli incubatori

GESTIONE DEI TERRENI DI COLTURA E
DEGLI INCUBATORI NEL LABORATORIO IVF
M.L. Papale
CRA s.r.l. Catania
Introduzione
GOOD
LABORATORY
PRACTICE
QUALITY
Invisible when “good”, impossible to ignore when “bad”
“People forget how fast you did a job but they remember how well you
did it”
Howard W. Newton
“Quality is never an accident, it is always the result of intelligent efforts”
John Ruskin
“Quality is never an accident; it is always the result of high intention,
sincere effort, intelligent direction and skilfull execution; it represents
the wise choice of many alternatives”
William A. Foster
CRA
Qualità nel laboratorio IVF
 Alti livelli di “patients care”
 Alti tassi di successo
Quality Control (QC):
L’insieme delle azioni ed iniziative che consentono di definire e tenere sotto
controllo gli standard qualitativi richiesti.
Quality Assurance (QA):
L’insieme di tutte le attività pianificate e sistematiche richieste, in grado di
garantire il soddisfacimento degli obiettivi della qualità
CRA
Qualità nel laboratorio IVF
Quality Improvement:
 Gestione del rischio
 Valutazione della qualità
 Risoluzione dei problemi
Say what you do…
…do what you say…
and
Show that you do as you say
CRA
PDCA
CYCLE
IVF
Stimulation
PATIENT
Oocyte
quality
N° of Incubator
Oil
overlay
Gas
phase
CRA
CULTURE SYSTEM
LABORATORY
Embryo transfer and
luteal support
N° of Embriologist
and training level
Air quality
N° of
embryos/drop
Tissue culture- ware /
contact supplies
Culture
media
OUTCOME
QC &
QA
Oocyte/Embryo handling
outside the incubator
Gardner and Lane, 2007
Colture embrionali
I principi base:
 Favorire la fertilizzazione e lo sviluppo embrionale in vitro
 “Normale” fertilizzazione
 “Normale” sviluppo embrionale
 Selezionare gli embrioni per il replacement in utero
 Elevato birth rate e bassa percentuale di gravidanze multiple
 Ottenere embrioni disponibili per la crioconservazione( ??? )
 Evitare i fattori che possono influenzare lo sviluppo
embrionale dopo l’impianto ( epigenetica )
CRA
A. Sunde, 2010
Mantenere la vitalità embrionale
Gli embrioni in vitro sono esposti a stress significativamente più alti
che non in vivo
La vitalità embrionale in vitro dipende da:
 Composizione dei terreni di coltura
 Qualità dei terreni di coltura
 Caratteristiche fisico-chimiche dei terreni di coltura
 pH
 osmolarità
 temperatura
 Ambiente gassoso: O2 & CO2
 Condizione di coltura
CRA
E. Van den Abbeel, 2010
Conseguenze dello stress in vitro
 Ritardi nello sviluppo embrionale
 Arresto nello sviluppo spesso prima dell’attivazione
del genoma embrionale
 Alterazione della fisiologia embrionale, in particolare
del metabolismo
 Alterazione dell’espressione genica
 Alterazione dell’imprinting di alcuni geni
 Alterazione della vitalità
CRA
E. Van den Abbeel, 2010
Considerazioni
 L’embrione prima dell’impianto non fa
parte del corpo materno.
 Gli embrioni prima dell’impianto sono
circondati da una ancora indefinita
quantità di fluido tubarico ed uterino
che è molto diluito.
 Lo
zigote
è
programmato
per
intrinsecamente
l’hatching
senza
necessità di stimoli esterni.
CRA
G. Vayta, et al., 2010
Considerazioni
Prima
settimana
dello
sviluppo embrionale
Prima divisione
Attivazione
del
materno
genoma
Compattazione della morula
Formazione della Blastocisti
Eventi esattamente
programmati
Riprogrammazione
epigenetica, attivazione del
metabolismo e cell allocation
CRA
G. Vayta, et al., 2010
Definizione di un buon terreno di coltura
Definire i criteri di valutazione:
1) Performance
 Risultati clinici – gravidanze
 Sicurezza
 Documentazione
2) Produttore
 Documentazione
 Design philosophy
 Affidabilità e convenienza
- Distribuzione e trasporto
 Scadenza
CRA
A. Sunde, 2010
Scelta del terreno di coltura
PERFORMANCE
OUTCOMES
TAKE HOME BABY
CRA
COSTI/BENEFICI
Fonti principali di stress ossidativo
 Esposizione alla luce
 Tracce di metalli di transizione nei terreni di coltura
 Alta concentrazione di ossigeno (20%)
 Antiossidanti
– Combattere le Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
Possono presentarsi come normale prodotto del metabolismo cellulare.
La composizione dei terreni di coltura può influenzare il tasso di produzione
dei ROS.
La maggior parte dei terreni in commercio contiene antiossidanti.
 Concentrazione di O2
– 5% vs 20% O2 ?? – dibattito in corso …
CRA
E. Van den Abbeel, 2010
Design dei terreni di coltura
Henry Leese, York:
“It seems that is it the quiet embryos that implant”
“Metabolically silent”
Gli embrioni che hanno un metabolismo più alto hanno
un tasso di impianto inferiore ?
“Embrione stressato”
Approccio Hands-off
 Embrione silente
 No stress
 Composizione simile a quella fisiologica
 Assenza di componenti bioattivi,
ormoni e fattori di crescita
CRA
Approccio Hands-in
 Stress/stimolo
d e l l ’e m b r i o n e
 Presenza di componenti
bioattivi
 R i s p o n d e s o l o l ’e m b r i o n e
migliore?
A. Sunde, 2010
Successo clinico
Un buon sistema di coltura dovrebbe garantire:
 Alto tasso di fertilizzazione
 Clivaggio corretto e buona morfologia embrionale
 Un alto numero di embrioni con buona morfologia
 Un alto pregnancy rate con transfer da fresco
 Un basso tasso di aborti
 Un alto cumulative delivery rate (fresh + frozen)
 Un basso tasso di gravidanze multiple
CRA
A. Sunde, 2010
Challenges In Vitro
Problema:
• Temperatura
– Gli ovociti non tollerano l’ipotermia
• pH
– Esiste una relazione intrinseca tra
regolazione del pH e concentrazione
di CO2
• Osmolarità
– può verificarsi evaporazione
• Luce
– La luce diretta può danneggiare il
terreno di coltura
– I raggi UV possono danneggiare gli
embrioni
CRA
Soluzione:
• Lavorare velocemente
– Controllo continuo della T (sonde,
termometri, piani riscaldati, etc);
– Coltura con olio
• Lavorare velocemente
– Utilizzare buffers (HEPES etc…)
– Coltura con olio
• Lavorare velocemente
– Coprire con olio
– Aggiungere osmoliti?
• Evitare l’esposizione alla luce
A. Sunde, 2010
Challenges In Vitro
Problema:
Soluzione:
• Contaminanti chimici
- Componenti dei terreni di coltura o
i terreni stessi
• Utilizzare terreni con certificazioni
di qualità del produttore
- Volatile Organic Components (VOC)
• “Air quality” in laboratorio e quindi
negli incubatori
Pulire e/o sterilizzare i nuovi
strumenti
CRA
A. Sunde, 2010
Challenges In Vitro
Problema:
Soluzione:
• Microrganismi
– I follicoli aspirati contengono
spesso flora vaginale
– Il liquido seminale può contenere
microrganismi.
– Gli operatori, le colture e le
metodiche di preparazione possono
introdurre
microrganismi
nel
sistema
• Aggiungere antibiotici
– Penicillina
– Streptomicina
– Gentamicina
• Gli embrioni sono sensibili alle
endotossine
• Monitorare la qualità dell’aria
• Utilizzare
materiale
monouso
destinato all’ART.
CRA
• Good working routines
• Tenere puliti le superfici di lavoro,
microscopi ed incubatori
A. Sunde, 2010
Embryo tested disposable
 MEA Test e HSSA Test (embrio-citotossicità)
 Rintracciabilità e controllo di tutti i lotti
 LAL Test (endotossine batteriche)
 ISO 11137 e ISO 13485 (Sterile R)
 Ames Test (per le mutazioni geniche)
 Marchio CE
 USP Classe VI (reazione cellulare al contatto
diretto o indiretto con la plastica)
CRA
Migliorare la coltura embrionale
Umidità all’interno
dell’incubatore
Gocce da 10-80µl
Coltura sotto
olio
Mantiene separate le gocce le une
dalle altre
Previene la rapida evaporazione
Previene le variazioni di pH e
temperatura
QUESTIONS TO ANSWER
Monocolture o
terreni sequenziali?
Rinnovare il
terreno?
Supplementazione
con macromolecole
Concentrazione
dell’O2
Communal o
individual culture
CRA
Mantenere il microambiente???
Incrementare la formazione di
blastocisti e l’I.R. ?
Bassa concentrazione ?
Aumentare il numero di
blastomeri e l’impianto ?
G. Vajta, 2010
Mantenimento della qualità
USA
EU
24 h – 48 h
>48 h ?
Australia
Verificare
corrispondenza lotto
Verificare
Refrigerazione
ALIQUOTARE
CRA
CRA
Studio dell’uso di 2 diversi terreni di coltura - CRA srl 2011
o I 2 gruppi di ICSI sono stati divisi tra M1 e M2 solo
in base al numero “ciclo ID “( pari o dispari ).
o Dopo l’analisi dei dati , nessuna differenza di età
( 34.6 vs 35.1 ), percentuale di patologia femminile
e /o maschile era presente tra i due gruppi ICSI.
o Parametri fondamentali di confronto :
% 2PN , % G1 , % Gr.Cl , % I.R.
CRA
Risultati di uno studio dell’uso di 2 diversi terreni di coltura
CRA srl 2011
N. ICSI
M1
M2
M1 %
M2 %
46
50
47.9
52.1
65
74
% 2PN
% Em.G1Ot
50/156
82/240
32
34
% Em.G1Tr
50/110
74/140
45
53
6/46
16/50
13
32*
10/110
24/140
9
17*
% Gr. Cl.
% I.R.
χ >0.65 *NS per numero di casi
CRA
CONCLUSIONI
• Obiettività / Criticità sull’uso di un medium da
parte di altri laboratori
• Distanza di produzione
• Qualità della produzione
• Certificati di analisi e componenti
• Uso preventivo , in parallelo , con il medium
in uso
• Valutazioni dei dati , anche a breve termine !
• Costi / benefici
CRA
Preimplantation embryo is a free-living organism
Periodo critico per
determinare
la
competenza
dell’ovocita
Condizioni di coltura non ottimali possono
alterare irreversibilmente accrescimento e
sviluppo fetale e postnatale
Periodo critico per determinare la qualità della blastocisti
EMBRIONE
CONDIZIONI
DI COLTURA
???
↑Parti pretermine
↑Mortalità prenatale
Basso peso alla nascita
Doyle, 1992
Hansen, 2002
Oliveness, 2002
Estremamente vulnerabile
CRA
 ↑Numero embrioni di
Bassa concentrazione
di O2→ 5%
buona qualità
 Ottima % di clivaggio
 No frammentazione
Expanded Blastocoel
 Blastocisti
Cohesive Trophoectoderm
qualità
di
buona
ICM Oval Shaped
Kovacic e Vlaisavijevic (2008)
5% O2
VS 20% O
2
988 ovociti
La concentrazione di O2 non ha effetto sulla percentuale di fertilizzazione, ma solo
sulla capacità di formare blastocisti di buona qualità.
31% di Blastocisti con il
5% O2
CRA
VS
15% di Blastocisti con il
20% O2
Varghese, AC et al.2011. (Article in Press)
Terreni di coltura
Sovrapproduzione di ROS
dovuta ad alti livelli di O2
durante le procedure IVF
Alterata espressione
genica
Compromessa
produzione di energia
CRA
Tensione di O2 in vivo ≠
da tensione di O2 in
vitro
Maggiore esposizione
degli embrioni ai ROS
Condizioni di coltura non
ottimali
Danneggiamento
dell’ovocita
Alterazione dello sviluppo
embrionale
Varghese, AC et al.2011. (Article in Press)
Piccoli cambiamenti dei
terreni di coltura possono
determinare significativi
cambiamenti dell’assetto
genetico laddove esista il
rischio
della
non
disgiunzione
 Aumento del pH al di sopra di 7.45
→ Frammentazione
 Esposizione a T <37°C per più di 10
minuti → disorganizzazione dello
spindle
?
CRA
Varghese, AC et al.2011. (Article in Press)
Stimolazione ormonale
Pick-up
FIVET
ICSI/Micromanipolazione
Effetti a lungo termine
Espressione
Genica
700
geni
Bimbi
“IVF”
Bimbi concepiti
naturalmente
Piccola ma significativa riduzione
della metilazione del DNA
Caratteristiche genetiche
della popolazione infertile
CRA
Stress in
vitro???
Varghese, AC et al.2011. (Article in Press)
Incubatori
La chiave per il successo della coltura embrionale è minimizzare le perturbazioni
dell’ambiente attorno all’embrione.
TEMPERATURA
COMPOSIZIONE
DEI TERRENI DI
COLTURA
CRA
QUALITA’
DELL’ARIA
GAS
Gas phase e pH
pH 7.2-7.6
Osmolarità 0.276
Condizioni ottimali per i gameti
Garantita da:
 5-6% CO2all’interno dell’incubatore
Misurazione del pH:
– Standard gas pH probes
– ISFET probes
– pH meter
– MTG pH meter
– Bloodgas analyser
 Utilizzo di sistemi tampone
 Temperatura di 37°C
Rapide variazioni di CO2
non sono evidenziabili dal
cambiamento del pH
Occorre Misurare la CO2
Difficoltà:
accuratezza, errore,
contaminazione, non
utilizzabili nella routine
CRA
R. Janssens, 2010
Misurare la CO2 e la temperatura
 Metodo riproducibile e affidabile,
 Veloce e facile da ripetere,
 Rileva rapidi variazioni nella concentrazione
Dal 1969 è ampiamente dimostrato
che la temperatura più adatta alle
colture embrionali è di 37°C.
della CO2 (malfunzionamento dell’incubatore).
Colture sotto olio per ridurre le variazioni di pH osmolarità e temperatura
Gli strumenti per taratura e controllo devono essere certificati dal Sistema di Taratura Italiano (SIT)
CRA
R. Janssens, 2010
Qualità dell’aria
Il massimo controllo della contaminazione viene garantito limitando al
minimo il rischio di contaminanti presenti nell’aria, nell’acqua e sulle
superfici.
DEFINIZIONE DELLA QUALITÀ DELL’ARIA
Le classificazioni della qualità dell’aria sono definite dalle norme Federal Standard 209E e dallo Standard
internazionale ISO 14644-1 (Classe 1, 10, 100 e ISO Classe 1, 2,…). Il numero della classe definito dal Federal
Standard rappresenta il massimo numero consentito di particelle di 0,5 micron o di dimensioni maggiori
presenti in un piede cubo d’aria. La classe 2 ISO è quella che meglio corrisponde alla classe 100 dello Standard
federale.
Filtrazione HEPA 100% per ottenere
rapidamente condizioni di qualità
dell’aria di classe 100.
Il filtro HEPA cattura i contaminanti
biologici e particolati aero-dispersi
impedendone la diffusione.
HEPA
CRA
Sistema di filtrazione dei VOC Composti Organici
Volatili
I VOC possono dividersi in due categorie:
Antropogenici (benzene, toluene, metano, CCl4,
etano, etc…).
Biogenici (terpeni, isoprene, alcoli, aldeidi e
chetoni)
Le emissioni biogeniche dominano spesso quelle di
carattere antropogenico, soprattutto nel periodo
estivo in concomitanza
dell'aumento del
quantitativo di ozono.
Membrane a Carbonio Attivo
Membrane a Carbonio Attivo
La filtrazione sui carboni attivi è una tecnologia di depurazione dell’aria per mezzo della quale una
corrente gassosa viene privata degli elementi inquinanti facendola passare attraverso un filtro che
contiene carbone attivo.
L'operazione si basa sulla capacità del carbone attivo di adsorbire, grazie alla sua porosità, la maggior
parte delle sostanze organiche e sulla conseguente possibilità di estrarle utilizzando un "veicolo" che
generalmente è vapore o azoto.
Il carbone attivo è costituito per la gran parte da atomi di carbonio di origine vegetale o minerale, è
caratterizzato da una porosità estremamente elevata e ha un colore nero; si può trovare in polvere (PAC)
in granuli (GAC).
Meccanismo
L’adsorbimento è un fenomeno prevalentemente fisico, in cui le molecole delle sostanze adsorbite
vengono trattenute sul carbone da forze deboli tipo Van der Wals. Al contempo vi è una parziale
deposizione delle particelle colloidali sulla superficie del carbone.
Mediante il trattamento a carboni attivi la corrente aeriforme viene aspirata da uno o più ventilatori, a
valle dei quali può essere installato un filtro a protezione del carbone e una batteria di
condizionamento (per ottimizzare umidità e temperatura). Il carbone è contenuto negli assorbitori, di
cui almeno uno in fase di rigenerazione.
L'aeriforme inquinato, attraversando il carbone, deposita gli organici e viene direttamente espulso
depurato al camino. Ciclicamente, in controcorrente, il carbone viene rigenerato da un flusso di vapore o
azoto.
CRA
Qualità dell’aria
Sistema di filtrazione dei composti organici volatili (VOC).
Elimina i composti organici volatili tossici che entrano in laboratorio dall’ambiente
esterno : aria ….incubatori….colture….embrioni !
Potenzialmente presenti anche negli articoli in plastica che vengono introdotti
nell’incubatore.
Uso di plastica Embryo tested
CRA
Dentro l’incubatore
La concentrazione di CO2
dipende dal terreno di
coltura utilizzato e deve
essere monitorata.
Il pH dei terreni di coltura
dovrebbe
essere
controllato.
Le
fluttuazioni
di
temperatura dovrebbero
essere evitate.
L’aria dovrebbe essere
filtrata e purificata.
CRA
Incubatori
Standard
CRA
Incubatori Standard
 Incubatori a camicia d’acqua
Massima protezione e rapidità di ripristino
termico dagli sbalzi della temperatura
ambiente
e
dalle
oscillazioni
della
alimentazione elettrica.
 Porta ermetica e termoriscaldata
 Sensore CO2 IR o T/C
 Filtri HEPA e VOC
Sportelli interni?
 Affidabilità
- Allarme acustico
- Possibilità di utilizzo di sonde indipendenti
- Commutatore telefonico
- UPS / GE
 Ergonomico:
i
ripiani
devono
facilmente accessibili
 Facile da pulire e disinfettare
CRA
essere
Mini Incubatori
 Ripristino veloce della temperatura
 Ripristino veloce del pH
 Facile da pulire
 Facile accesso
 Piccole dimensioni
 Riduce al minimo il consumo di gas
 Utilizza una piastra per paziente
per un totale di 4 pazienti
 4 aperture a paziente
….. ma per 4 pazienti in giorni diversi
di check !!!
 Utilizza pre-mixed gas
 Costi molto alti
 Difficoltà ad effettuare monitoraggi costanti
CRA
Good Laboratory Practice








Temperatura: 37°C ± 0.1
Umidità > 90%
Daily record di temperatura e CO2
Controllare il pH dei terreni di coltura quando si introduce un nuovo lotto
Sostituire l’acqua una volta alla settimana (acqua ultrapura)
Pulire i ripiani una volta alla settimana
Campionamenti microbiologici ogni trimestre
Sostituire i filtri HEPA e VOC ogni anno
Cosa fare e non fare




CRA
Leggere sempre il manuale prima di utilizzare l’incubatore
“If it is not broken, do not fix it” (controlli di routine)
Non introdurre contenitori con etichette
Ricordare che l’ambiente del laboratorio può avere effetti sull’ambiente
dell’incubatore
Grazie per l’attenzione!
Ginecologia
Embriologia
Dir.Clinico
Prof.G.Giuffrida
Dir.Laboratorio IVF/ICSI
Dott.ssa M.L. Papale
Prof. M. Palumbo
Dott. A. Mangiacasale
Dott.ssa T. Pasqualetto
Dott. A. Giuffrida
Dott. L. Di Leo
Dott.ssa A. Aglianò
Dott.ssa G. Petralia
CRA
Dott.ssa R. Cavallaro
Dott.ssa G. Tomasi
Dott.ssa A. Bruno