PUÒ LA NUTRIZIONE AZOTATA DEL LIEVITO
CAMBIARE IL PROFILO AROMATICO DEL VINO?
Daniel Ramón Vidal
Biópolis S.L.
Piacenza, 22 Aprile 2009
LA BIOTECNOLOGIA DEL VINO
Vitis vinifera
Homo sapiens
Saccharomyces
cerevisiae
LE INTERAZIONI
Vitis vinifera
Homo sapiens
Saccharomyces
cerevisiae
PROPRIETA’
PROPRIETA’ DEL VINO
9 Proprietà fisico chimiche
9 Proprietà organolettiche
9Proprietà funzionali
MANCANZA DI
CONOSCENZE SCIENTIFICHE
L’AROMA DEL VINO
9 Determinato da composti volatili: alcoli, esteri,
aldeidi, chetoni e idrocarburi
9 Composti con soglia di precezione molto bassa:
da 0.1 mg/l a 0.1 fg/l
9 Concentrazioni molto basse nel vino: da 10 mg
a 0.1 μg/Kg
9 Concentrazioni variabili in funzione di: clima,
suolo, irrigazione, momento della vendemmia,
processo di fermentazione, operazioni di
processo
9 Percezione finale è il risultato dell’interazione
di centinaia di composti
CLASSIFICAZIONE DEGLI AROMI
Terziari
Primari
Secondari
AROMA VARIETALE O PRIMARIO
9 Nella fase finale della maturazione, nella buccia e
polpa dell’acino si accumulano: esteri, aldeidi, chetoni
e alcoli
9 Esteri più importanti: esteri dell’acido acetico ed
esteri di alcoli a corta catena
9 Aldeidi sono quantitativamente importanti, si formano
enzimaticamente; spiccano il trans-2-esenale il esenale
9 Tra i chetoni importanti i 2- e 3-alcanoni
9 Tra gli alcoli spiccano quelli con 4-11 atomi di
carbonio, alcoli insaturi e ramificati a corta catena e
composti aromatici come l’alcol benzilico, 1- e 2feniletanolo e i monoterpeni
IL CASO PARTICOLARE DEI TERPENI
C
9 Complesso terpene-zucchero formato
da un disaccaride di cui la molecola
legata al terpene è sempre glucosio
9 Il secondo zucchero è di solito
arabinosio, ramnosio o apiosio;
geraniolo, nerolo e linalolo sono i
terpeni più comuni
9 Frazione non volatile quindi
potenzialmente aromatica
solo
C
CH3
HO
CH3
C
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
C
CH3
HC
C
CH3
C
CH2OH
H
Linalolo
Nerolo
G
R
C
CH3
HC
CH2OH
CH2
T
CH3
HC
HC
HC
9 I terpeni sono i composti aromatici
in forma glicosidata più abbondanti
nell’uva
CH3
CH3
CH3
9 Molti composti volatili sono tossici
per la cellula vegetale per questo
sono presenti in forma glicosilata
non volatile
Geraniolo
Terpene legato
(senza aroma)
AROMA SECONDARIO
O DI FERMENTAZIONE
9 Prodotto dal metabolismo fermentativo del lievito
9 Alcoli superiori, esteri, aledidi, chetoni, acidi
organici, fenoli, composti organici solforati e
terpeni
9 Spiccano alcuni alcoli alifatici (1-propanolo, 2metil-1-propanolo, 2-metil-a-butanolo e 3-metil-1butanolo) e aromatici come il 2-feniletanolo
9 Anche esteri come l’acetato d’etile, aldeidi come
l’acetaldeide o chetoni come l’acetone, l’acetoina
e il 2,3-pentadione
9 Molto importanti i composti solforati di origine
organica perchè hanno soglia di percezione bassa;
spiccano il 4-mercapto-4-metil pentanone, il 3mercaptoesanolo e il 3-mercaptoesil acetato
9 Terpeni formati a partire dai precursori glicosilati
del mosto per azione glicosidica
9 Tutti gli aromi secondari formati a partire da
precursori presenti nel mosto
AROMA TERZIARIO O
BOUQUET DI MATURAZIONE
9 Sviluppato durante l’invecchiamento: bouquet
ossidativo in barrique, bouquet di riduzione in
bottiglia
9 Nel bouquet ossidativo si ha la sintesi di
acetaldeide e acetali e contemporaneamente
l’estrazione
dal legno di composti fenolici
derivati dalla lignina e lattoni come il 3-metil-γoctolattone
9 Nel bouquet di riduzione si hanno reazioni tra
derivati dei norisoprenoidi, carboidrati e
composti solforati ridotti
9 In generale durante l’invecchiamento spariscono
esteri acetati, alcoli superiori e alcoli
monoterpenici e aumentano furfurale, acetato
d’etile, alcuni esteri etilici e l’ossido di nerolo,
hotrienolo, idrossilinalolo e idrossicitronellolo
¿E’ POSSIBILE MIGLIORARE L’AROMA?
PRIMARIO
SECONDARIO
TERZIARIO
9 Miglioramento delle varietà d’uva
9 Ricevimento dell’uva (antiossidanti, CO2)
9 Normalizzazione del mosto
9 Nuovi ceppi di lievito
9 Miglioramento del lievito
9 Precursori del mosto (nutrizione)
9 Nuovi materiali barriera
9 Direzionare le reazioni
¿E’ POSSIBILE MIGLIORARE L’AROMA?
9 S. cerevisiae: microorganismo
eucariota più semplice e meglio
conosciuto dal punto di vista
biochimico
9 Genoma interamente sequenziato
9
9
9
9
9
9
9
Acidi organici
Alcoli superiori
Aldeidi
Chetoni
Composti solforati
Esteri
Fenoli
9 Mutanti in tutti i geni
9 Molti ceppi industriali con diverso
potenziale aromatico
TIPOLOGIA DI LIEVITO
IN FUNZIONE DEL POTENZIALE AROMATICO
LIEVITI VARIETALI
Evidenziano aromi primari
LIEVITI AROMATICI
Producono aromi di fermentazione
USO DI LIEVITI VARIETALI
9 Evidenziano e valorizzano
aromi primari dell’uva
gli
9 Biochimicamente dipende dalla
presenza di geni che codificano
enzimi capaci di liberare i
precursori
aromatici
presenti
nell’uva
9 Due esempi: liberazione di terpeni
e composti solforati
USO DI LIEVITI VARIETALI
PER INCREMENTARE I TERPENI
T
G
Terpene legato
(senza aroma)
R
T
O
CH3
HO
CH2
HO
O
O
Ramnosidasi
O
OH
OH OH
OH
Ramnopiranosil-glucoside
T
G
β-glucosidasi
T
Terpene volatile
(aromatici)
STRATEGIA PER LA
LIBERAZIONE DEI TERPENI
USO DI
ENZIMI ESOGENI
USO DI LIEVITI
SELEZIONATI
USO DI LIEVITI
TRANSGENICI
Inibizione dell’attività
Distruzione degli enzimi
Numero limitato di ceppi
Inibizione parziale
Rifiuto sociale
LIEVITI VARIETALI PER
INCREMENTARE I COMPOSTI SOLFORATI
9 Formati a partire da precursori legati
alla cisteina (non volatili) liberati da
liasi non presenti in commercio
9 In S. cerevisiae almeno 4 geni
implicati nella liberazione del 4MMP
da Cys-4MMP
9 Ceppi commerciali di
elevata attività liasica
4-mercapto-4-metilpentanone (4MMP)
3-mercaptoesanolo (3MHA)
lievito
con
9 Ceppi transgenici che esprimono una
triptofanasi di E. coli con elevata
attività tiolasica
USO DI LIEVITI AROMATICI
9 Sintetizzano ex novo composti
volatili: esteri, acetati, alcoli
superiori e aldeidi
9 Necessario
attivare
la
via
biochimica che conduce alla loro
sintesi
9 Per la sintesi di molti di questi
composti è necessario disporre di
una buona fonte aminoacidica
INTERMEDIARI METABOLICI RILEVANTI:
GLI ALCOLI SUPERIORI
Propanolo
9 Alcoli superiori ed esteri sono intermediari
metabolici rilevanti nella sintesi dei composti
aromatici
Isobutanolo
9 Alcoli superiori prodotti in quantità elevata,
odore penetrante e, a concentrazioni > 400 mg/l,
effetto negativo sulla percezione olfattiva
Alcol
isoamilico
9 Anche se di per sè negativi per la qualità del
vino,
tecnologicamente
importanti
perchè
precursori degli esteri dell’acido acetico
2-feniletanolo
9 I più importanti prodotti a partire da amnoacidi
INTERMEDIARI METABOLICI RILEVANTI
ESTERI
9 Sintetizzati in piccole quantità, fragranza
gradevole
9 Esteri acetati degli alcoli superiori - associati
all’aroma fruttato, floreale e fresco dei vini
giovani - sono i più importanti
9 Composti tipici del metabolismo secondario
del lievito; la loro sintesi non è specifica; la
sfumatura aromatica del vino è il risultati
dell’iterazione tra tutti
9 Acetato d’etile, acetato d’isoamile, acetato
d’isobutile e acetato di 2-feniletile sono i più
rilevanti
ALCUNI ALCOLI SUPERIORI
PRODOTTI DAL LIEVITO
ALCOL
Propanolo
Isobutanolo
Alcol isoamilico
2-feniletanolo
AMINOACIDO
PRECURSORE
CONCENTRAZIONE
(mg/l)
AROMA
Treonina
2-amino-butirrico
9-68
Solvente
Valina
9-28
Alcol
Leucina
45-490
Marzapane
Fenilalanina
10-180
Florale
ALCUNI ESTERI
PRODOTTI DAL LIEVITO
ESTERE
Acetato d’etile
CONCENTRAZIONE
(mg/l)
AROMA
10-100
Solvente
Acetato di 2-feniletile
0.01-4.5
Rosa, fruttato
Acetato d’isoamile
0.03-8.1
Banana, pera
Acetato d’isobutile
0.01-0,8
Banana
Acetato d’esile
0-4.8
Mela matura
Butanoato d’etile
0.01-3
Florale, fruttato
Capronato d’etile
Tracce-3.4
Mela, banana
SINTESI E DEGRADAZIONE
9 Formazione
9 Degradazione
9 Diffusione di membrana
SINTESI DEGLI ALCOLI SUPERIORI
9 Sintetizzati a partire da aminoacidi
ramificati:
fenilalanina,
valina,
isoleucina e leucina
9 Due possibili vie: sintesi ex novo a
partire da una fonte di carbonio (via
catabolica) o la via anabolica del
metabolismo generale degli aminoacidi
9 Prosegue con la via di Ehrlich o di
desaminazione ossidativa
9 La chiave è la formazione del chetoacido
che puo essere transaminato per
generare un aminoacido e decarbossilato
per generare un alcol superiore
GENI ED ENZIMI IMPLICATI
Pdc1p
Pdc5p
Pdc6p
YDR380w (Aro10p)
YDL080c (Thi3p)
Gnp1p
Agp1p
Bap2p
Bap3p
Tat1p
Tat2p
Ptr2p
Decarbossilazione
Aminoacidi
Gap1p
Aminoacidi
Adh1p
Adh2p
Adh3p
Adh4p
Adh5p
Sfa1p
Riduzione
ALCOL
SUPERIORE
SINTESI DEGLI ESTERI AROMATICI
9 Condensazione chimica tra alcol superiore
e acido possibile ma lenta e poco
probabile durante la fermentazione
9 La biosintesi richiede energia: necessaria
la presenza di alcol superiore e una
molecola attiva in forma di acil-CoA che
di solito è acetil-CoA
9 Enzimi implicati: estere-sintasi, etanolacetiltransferasi e alcol-acetiltransferasi
(AATasi)
9 Gli esteri possono essere idrolizzati da
estere-idrolasi o esterasi; al termine della
fermentazione questa attività aumenta
GENI ED ENZIMI IMPLICATI
Atf1p
Atf2p
Eth1p
Iah1p
LIEVITI AROMATICI CON PROFILO MIGLIORE
9 Lieviti commerciali con elevata produzione
di esteri fruttati
9 La
sovraespressione
del
gene
ATF1
incrementa 180 volte la produzione di
acetato d’isoamile e di 10 - 200 volte quella
di altri esteri come l’acetato d’etile e
l’acetato di 2-feniletile
9 La perdita del gene IAH1 duplica la
concentrazione di esteri di interesse
enologico
9 Le condizioni di fermentazione (presenza di
aminoacidi) possono influenzare in modo
drammatico la produzione di composti
volatili in relazione con l’aroma del vino
AMINOACIDI, VINO E AROMA
9 La presenza nel mosto di alcuni
aminoacidi determina il profilo
aromatico del vino
9 Ogni varietà ha un proprio profilo
aminoacidico:
il
Macabeo
contiene molta metionina da cui
origina il metionolo presente nel
vino finale
9 Gli aminoacidi sono precursori
della sintesi di alcoli superiori,
aledeidi, acidi carbossilici e,
indirettamente, esteri
AROMI DERIVATI DAGLI AMINOACIDI
AMINOACIDO
ALDEIDE
ALCOL
AC. CARBOSSILICO
Leucina
3-Mebutanale
3-Mebutanolo
Ac 3 Mebutanoico
Isoleucina
2-Mebutanale
2-Mebutanolo
Ac 2 Mebutanoico
Valina
2-Meropanale
2Mepropanolo
Ac 2 Mepropanoico
Fenialanina
Ф-acetaldeide
Ф-etanolo
Ac. Ф-acetico
Tirosina
ρ-OH-Фacetaldeide
ρ-OH-Фetanolo
Ac p-OH-F-acetico
ρ-cresolo
Triptofano
Indol-3acetaldeide
Triptofolo
Ac indol-3 acetico
Skalote
Metionina
3-Metiopropanale
3-Metiopropanolo
Ac -3
Metiopropanoico
Metanotiolo
Malato
Diacetile
Acetoína
Asparagina
ALTRI
STRATEGIE DI NUTRIZIONE
AROMA
Esteri
Alcoli superiori
Acidi grassi
insaturi
Polisaccaridi
Aminoacidi
Aminacidi
Steroli
MIGLIORAMENTO
FERMENTATIVO
TRASPORTO DEGLI AMINOACIDI
9 Assimilazione degli aminoacidi limitata da:
competizione con ioni ammonio, presenza di
acidi grassi insaturi nella membrana, presenza
di etanolo
9 Ioni ammonio competono con molti aminoacidi
per entrare nella cellula
9 La presenza nella membrana cellulare di acido
oleico e linoleico facilita l’assimilazione degli
aminoacidi
9 La presenza di etanolo modifica la composizione
del doppio strato lipidico e diminuisce la
concentrazione degli acidi grassi insaturi
9 L’etanolo aumenta la permeabilità della
membrana ai protoni, aumenta l’attività
ATPasica e si consuma energia per mantenere il
pH intracellulare, di conseguenza si arresta il
trsporto degli aminoacidi
AGGIUNTA DI NUTRIENTI ORGANICI
9 Sempre
all’inzio
della
fermentazione
per
evitare
concentrazioni elevate di alcol
9 In questo modo si somministrano
precursori rapidi per la sintesi
proteica
Atf1p
Atf2p
Eth1p
9 La cellula accumula l’eccesso di
aminoacidi nel vacuolo per
utilizzarli successivamente
AGGIUNTA DI ATTIVANTI
IN TIPI DIVERSI DI VINO
9 Ogni vino è una matrice diversa:
non c’è una soluzione unica né un
unico effetto nell’impiego degli
attivanti
9 Nei vini bianchi, rossi e rosati
aromatici l’effetto principale
dell’uso
di
attivanti
è
il
miglioramento
delle
caratteristiche organolettiche
9 Nei vini varietali o d’affinamento
la nutrizione con steroli e acidi
grassi garantisce la regolarità
fermentativa
BIOLOGIA MOLECOLARE DELL’AROMA
9 Si stanno identificando i geni
implicati nella sintesi degli aromi
in diverse specie vegetali
9 La genomica comparativa in pochi
anni ci permetterà di disporre di
molti di questi geni
9 La sequenza del genoma dell’uva
è praticamente completata
9 Già esistono lieviti transgenici
che esprimono geni di piante e
incrementano gli aromi
CONTACTO EN BIÓPOLIS S.L.
http://www.biopolis.es
Biópolis, S.L.
Polígono La Coma s/n
46980 Paterna (Valencia)
España
Daniel Ramón
(+34) 96 316 02 99
[email protected]
