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PUÒ LA NUTRIZIONE AZOTATA DEL LIEVITO CAMBIARE IL PROFILO AROMATICO DEL VINO? Daniel Ramón Vidal Biópolis S.L. Piacenza, 22 Aprile 2009 LA BIOTECNOLOGIA DEL VINO Vitis vinifera Homo sapiens Saccharomyces cerevisiae LE INTERAZIONI Vitis vinifera Homo sapiens Saccharomyces cerevisiae PROPRIETA’ PROPRIETA’ DEL VINO 9 Proprietà fisico chimiche 9 Proprietà organolettiche 9Proprietà funzionali MANCANZA DI CONOSCENZE SCIENTIFICHE L’AROMA DEL VINO 9 Determinato da composti volatili: alcoli, esteri, aldeidi, chetoni e idrocarburi 9 Composti con soglia di precezione molto bassa: da 0.1 mg/l a 0.1 fg/l 9 Concentrazioni molto basse nel vino: da 10 mg a 0.1 μg/Kg 9 Concentrazioni variabili in funzione di: clima, suolo, irrigazione, momento della vendemmia, processo di fermentazione, operazioni di processo 9 Percezione finale è il risultato dell’interazione di centinaia di composti CLASSIFICAZIONE DEGLI AROMI Terziari Primari Secondari AROMA VARIETALE O PRIMARIO 9 Nella fase finale della maturazione, nella buccia e polpa dell’acino si accumulano: esteri, aldeidi, chetoni e alcoli 9 Esteri più importanti: esteri dell’acido acetico ed esteri di alcoli a corta catena 9 Aldeidi sono quantitativamente importanti, si formano enzimaticamente; spiccano il trans-2-esenale il esenale 9 Tra i chetoni importanti i 2- e 3-alcanoni 9 Tra gli alcoli spiccano quelli con 4-11 atomi di carbonio, alcoli insaturi e ramificati a corta catena e composti aromatici come l’alcol benzilico, 1- e 2feniletanolo e i monoterpeni IL CASO PARTICOLARE DEI TERPENI C 9 Complesso terpene-zucchero formato da un disaccaride di cui la molecola legata al terpene è sempre glucosio 9 Il secondo zucchero è di solito arabinosio, ramnosio o apiosio; geraniolo, nerolo e linalolo sono i terpeni più comuni 9 Frazione non volatile quindi potenzialmente aromatica solo C CH3 HO CH3 C CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C CH3 HC C CH3 C CH2OH H Linalolo Nerolo G R C CH3 HC CH2OH CH2 T CH3 HC HC HC 9 I terpeni sono i composti aromatici in forma glicosidata più abbondanti nell’uva CH3 CH3 CH3 9 Molti composti volatili sono tossici per la cellula vegetale per questo sono presenti in forma glicosilata non volatile Geraniolo Terpene legato (senza aroma) AROMA SECONDARIO O DI FERMENTAZIONE 9 Prodotto dal metabolismo fermentativo del lievito 9 Alcoli superiori, esteri, aledidi, chetoni, acidi organici, fenoli, composti organici solforati e terpeni 9 Spiccano alcuni alcoli alifatici (1-propanolo, 2metil-1-propanolo, 2-metil-a-butanolo e 3-metil-1butanolo) e aromatici come il 2-feniletanolo 9 Anche esteri come l’acetato d’etile, aldeidi come l’acetaldeide o chetoni come l’acetone, l’acetoina e il 2,3-pentadione 9 Molto importanti i composti solforati di origine organica perchè hanno soglia di percezione bassa; spiccano il 4-mercapto-4-metil pentanone, il 3mercaptoesanolo e il 3-mercaptoesil acetato 9 Terpeni formati a partire dai precursori glicosilati del mosto per azione glicosidica 9 Tutti gli aromi secondari formati a partire da precursori presenti nel mosto AROMA TERZIARIO O BOUQUET DI MATURAZIONE 9 Sviluppato durante l’invecchiamento: bouquet ossidativo in barrique, bouquet di riduzione in bottiglia 9 Nel bouquet ossidativo si ha la sintesi di acetaldeide e acetali e contemporaneamente l’estrazione dal legno di composti fenolici derivati dalla lignina e lattoni come il 3-metil-γoctolattone 9 Nel bouquet di riduzione si hanno reazioni tra derivati dei norisoprenoidi, carboidrati e composti solforati ridotti 9 In generale durante l’invecchiamento spariscono esteri acetati, alcoli superiori e alcoli monoterpenici e aumentano furfurale, acetato d’etile, alcuni esteri etilici e l’ossido di nerolo, hotrienolo, idrossilinalolo e idrossicitronellolo ¿E’ POSSIBILE MIGLIORARE L’AROMA? PRIMARIO SECONDARIO TERZIARIO 9 Miglioramento delle varietà d’uva 9 Ricevimento dell’uva (antiossidanti, CO2) 9 Normalizzazione del mosto 9 Nuovi ceppi di lievito 9 Miglioramento del lievito 9 Precursori del mosto (nutrizione) 9 Nuovi materiali barriera 9 Direzionare le reazioni ¿E’ POSSIBILE MIGLIORARE L’AROMA? 9 S. cerevisiae: microorganismo eucariota più semplice e meglio conosciuto dal punto di vista biochimico 9 Genoma interamente sequenziato 9 9 9 9 9 9 9 Acidi organici Alcoli superiori Aldeidi Chetoni Composti solforati Esteri Fenoli 9 Mutanti in tutti i geni 9 Molti ceppi industriali con diverso potenziale aromatico TIPOLOGIA DI LIEVITO IN FUNZIONE DEL POTENZIALE AROMATICO LIEVITI VARIETALI Evidenziano aromi primari LIEVITI AROMATICI Producono aromi di fermentazione USO DI LIEVITI VARIETALI 9 Evidenziano e valorizzano aromi primari dell’uva gli 9 Biochimicamente dipende dalla presenza di geni che codificano enzimi capaci di liberare i precursori aromatici presenti nell’uva 9 Due esempi: liberazione di terpeni e composti solforati USO DI LIEVITI VARIETALI PER INCREMENTARE I TERPENI T G Terpene legato (senza aroma) R T O CH3 HO CH2 HO O O Ramnosidasi O OH OH OH OH Ramnopiranosil-glucoside T G β-glucosidasi T Terpene volatile (aromatici) STRATEGIA PER LA LIBERAZIONE DEI TERPENI USO DI ENZIMI ESOGENI USO DI LIEVITI SELEZIONATI USO DI LIEVITI TRANSGENICI Inibizione dell’attività Distruzione degli enzimi Numero limitato di ceppi Inibizione parziale Rifiuto sociale LIEVITI VARIETALI PER INCREMENTARE I COMPOSTI SOLFORATI 9 Formati a partire da precursori legati alla cisteina (non volatili) liberati da liasi non presenti in commercio 9 In S. cerevisiae almeno 4 geni implicati nella liberazione del 4MMP da Cys-4MMP 9 Ceppi commerciali di elevata attività liasica 4-mercapto-4-metilpentanone (4MMP) 3-mercaptoesanolo (3MHA) lievito con 9 Ceppi transgenici che esprimono una triptofanasi di E. coli con elevata attività tiolasica USO DI LIEVITI AROMATICI 9 Sintetizzano ex novo composti volatili: esteri, acetati, alcoli superiori e aldeidi 9 Necessario attivare la via biochimica che conduce alla loro sintesi 9 Per la sintesi di molti di questi composti è necessario disporre di una buona fonte aminoacidica INTERMEDIARI METABOLICI RILEVANTI: GLI ALCOLI SUPERIORI Propanolo 9 Alcoli superiori ed esteri sono intermediari metabolici rilevanti nella sintesi dei composti aromatici Isobutanolo 9 Alcoli superiori prodotti in quantità elevata, odore penetrante e, a concentrazioni > 400 mg/l, effetto negativo sulla percezione olfattiva Alcol isoamilico 9 Anche se di per sè negativi per la qualità del vino, tecnologicamente importanti perchè precursori degli esteri dell’acido acetico 2-feniletanolo 9 I più importanti prodotti a partire da amnoacidi INTERMEDIARI METABOLICI RILEVANTI ESTERI 9 Sintetizzati in piccole quantità, fragranza gradevole 9 Esteri acetati degli alcoli superiori - associati all’aroma fruttato, floreale e fresco dei vini giovani - sono i più importanti 9 Composti tipici del metabolismo secondario del lievito; la loro sintesi non è specifica; la sfumatura aromatica del vino è il risultati dell’iterazione tra tutti 9 Acetato d’etile, acetato d’isoamile, acetato d’isobutile e acetato di 2-feniletile sono i più rilevanti ALCUNI ALCOLI SUPERIORI PRODOTTI DAL LIEVITO ALCOL Propanolo Isobutanolo Alcol isoamilico 2-feniletanolo AMINOACIDO PRECURSORE CONCENTRAZIONE (mg/l) AROMA Treonina 2-amino-butirrico 9-68 Solvente Valina 9-28 Alcol Leucina 45-490 Marzapane Fenilalanina 10-180 Florale ALCUNI ESTERI PRODOTTI DAL LIEVITO ESTERE Acetato d’etile CONCENTRAZIONE (mg/l) AROMA 10-100 Solvente Acetato di 2-feniletile 0.01-4.5 Rosa, fruttato Acetato d’isoamile 0.03-8.1 Banana, pera Acetato d’isobutile 0.01-0,8 Banana Acetato d’esile 0-4.8 Mela matura Butanoato d’etile 0.01-3 Florale, fruttato Capronato d’etile Tracce-3.4 Mela, banana SINTESI E DEGRADAZIONE 9 Formazione 9 Degradazione 9 Diffusione di membrana SINTESI DEGLI ALCOLI SUPERIORI 9 Sintetizzati a partire da aminoacidi ramificati: fenilalanina, valina, isoleucina e leucina 9 Due possibili vie: sintesi ex novo a partire da una fonte di carbonio (via catabolica) o la via anabolica del metabolismo generale degli aminoacidi 9 Prosegue con la via di Ehrlich o di desaminazione ossidativa 9 La chiave è la formazione del chetoacido che puo essere transaminato per generare un aminoacido e decarbossilato per generare un alcol superiore GENI ED ENZIMI IMPLICATI Pdc1p Pdc5p Pdc6p YDR380w (Aro10p) YDL080c (Thi3p) Gnp1p Agp1p Bap2p Bap3p Tat1p Tat2p Ptr2p Decarbossilazione Aminoacidi Gap1p Aminoacidi Adh1p Adh2p Adh3p Adh4p Adh5p Sfa1p Riduzione ALCOL SUPERIORE SINTESI DEGLI ESTERI AROMATICI 9 Condensazione chimica tra alcol superiore e acido possibile ma lenta e poco probabile durante la fermentazione 9 La biosintesi richiede energia: necessaria la presenza di alcol superiore e una molecola attiva in forma di acil-CoA che di solito è acetil-CoA 9 Enzimi implicati: estere-sintasi, etanolacetiltransferasi e alcol-acetiltransferasi (AATasi) 9 Gli esteri possono essere idrolizzati da estere-idrolasi o esterasi; al termine della fermentazione questa attività aumenta GENI ED ENZIMI IMPLICATI Atf1p Atf2p Eth1p Iah1p LIEVITI AROMATICI CON PROFILO MIGLIORE 9 Lieviti commerciali con elevata produzione di esteri fruttati 9 La sovraespressione del gene ATF1 incrementa 180 volte la produzione di acetato d’isoamile e di 10 - 200 volte quella di altri esteri come l’acetato d’etile e l’acetato di 2-feniletile 9 La perdita del gene IAH1 duplica la concentrazione di esteri di interesse enologico 9 Le condizioni di fermentazione (presenza di aminoacidi) possono influenzare in modo drammatico la produzione di composti volatili in relazione con l’aroma del vino AMINOACIDI, VINO E AROMA 9 La presenza nel mosto di alcuni aminoacidi determina il profilo aromatico del vino 9 Ogni varietà ha un proprio profilo aminoacidico: il Macabeo contiene molta metionina da cui origina il metionolo presente nel vino finale 9 Gli aminoacidi sono precursori della sintesi di alcoli superiori, aledeidi, acidi carbossilici e, indirettamente, esteri AROMI DERIVATI DAGLI AMINOACIDI AMINOACIDO ALDEIDE ALCOL AC. CARBOSSILICO Leucina 3-Mebutanale 3-Mebutanolo Ac 3 Mebutanoico Isoleucina 2-Mebutanale 2-Mebutanolo Ac 2 Mebutanoico Valina 2-Meropanale 2Mepropanolo Ac 2 Mepropanoico Fenialanina Ф-acetaldeide Ф-etanolo Ac. Ф-acetico Tirosina ρ-OH-Фacetaldeide ρ-OH-Фetanolo Ac p-OH-F-acetico ρ-cresolo Triptofano Indol-3acetaldeide Triptofolo Ac indol-3 acetico Skalote Metionina 3-Metiopropanale 3-Metiopropanolo Ac -3 Metiopropanoico Metanotiolo Malato Diacetile Acetoína Asparagina ALTRI STRATEGIE DI NUTRIZIONE AROMA Esteri Alcoli superiori Acidi grassi insaturi Polisaccaridi Aminoacidi Aminacidi Steroli MIGLIORAMENTO FERMENTATIVO TRASPORTO DEGLI AMINOACIDI 9 Assimilazione degli aminoacidi limitata da: competizione con ioni ammonio, presenza di acidi grassi insaturi nella membrana, presenza di etanolo 9 Ioni ammonio competono con molti aminoacidi per entrare nella cellula 9 La presenza nella membrana cellulare di acido oleico e linoleico facilita l’assimilazione degli aminoacidi 9 La presenza di etanolo modifica la composizione del doppio strato lipidico e diminuisce la concentrazione degli acidi grassi insaturi 9 L’etanolo aumenta la permeabilità della membrana ai protoni, aumenta l’attività ATPasica e si consuma energia per mantenere il pH intracellulare, di conseguenza si arresta il trsporto degli aminoacidi AGGIUNTA DI NUTRIENTI ORGANICI 9 Sempre all’inzio della fermentazione per evitare concentrazioni elevate di alcol 9 In questo modo si somministrano precursori rapidi per la sintesi proteica Atf1p Atf2p Eth1p 9 La cellula accumula l’eccesso di aminoacidi nel vacuolo per utilizzarli successivamente AGGIUNTA DI ATTIVANTI IN TIPI DIVERSI DI VINO 9 Ogni vino è una matrice diversa: non c’è una soluzione unica né un unico effetto nell’impiego degli attivanti 9 Nei vini bianchi, rossi e rosati aromatici l’effetto principale dell’uso di attivanti è il miglioramento delle caratteristiche organolettiche 9 Nei vini varietali o d’affinamento la nutrizione con steroli e acidi grassi garantisce la regolarità fermentativa BIOLOGIA MOLECOLARE DELL’AROMA 9 Si stanno identificando i geni implicati nella sintesi degli aromi in diverse specie vegetali 9 La genomica comparativa in pochi anni ci permetterà di disporre di molti di questi geni 9 La sequenza del genoma dell’uva è praticamente completata 9 Già esistono lieviti transgenici che esprimono geni di piante e incrementano gli aromi CONTACTO EN BIÓPOLIS S.L. http://www.biopolis.es Biópolis, S.L. Polígono La Coma s/n 46980 Paterna (Valencia) España Daniel Ramón (+34) 96 316 02 99 [email protected]
