Biotecnologie

Biotecnologie
Con il termine “Biotecnologie” si intende qualsiasi processo produttivo che preveda l’impiego
di cellule viventi o di loro componenti.
Le cellule rappresentano l’unità morfo-funzionale degli esseri viventi: tutti gli esseri viventi
(monocellulari o pluricellulari) sono infatti costituiti da cellule. Ogni nuova cellula può derivare solo
da una cellula preesistente. Nell’ambito dell’ingegneria biochimica le cellule sono considerate dei
microreattori, in cui i nutrienti (ossia le specie chimiche scambiabili presenti nella fase abiotica= fase
esterna ai microorganismi) vengono immessi, rappresentando i reagenti delle trasformazioni
chimiche che avvengono all’interno della cellula; in seguito alle trasformazioni metaboliche si
formano nella fase biotica (costituita dai microorganismi) sostante più semplici, successivamente
convertite in:
 Prodotti metabolici: specie chimiche prodotte e scambiabili attraverso la membrana cellulare;
 Componenti della biomassa: specie chimiche prodotte non scambiabili attraverso la membrana
cellulare.
I processi industriali basati sull’impiego di microorganismi possono avere diversi obiettivi:
 Generazione di biomassa o di un suo specifico componente;
 Generazione di prodotti metabolici (metaboliti primari o secondari);
 Rimozione di nutrienti (processi di bonifica ambientale).
Esempi di processi industriali basati sull’impiego di microorganismi sono:
1. Fermentazione alcolica: l’obiettivo di tale processo è la produzione di etanolo che è un
prodotto metabolico;
2. Produzione di lievito da cucina: i lieviti costituiscono la biomassa;
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3. Bonifica di reflui urbani.
Sono di seguito elencati differenti processi fermentativi utilizzati dall’uomo nel corso della storia per
scopo industriale:
Per microorganismi si intendono organismi viventi monocellulari o pluricellulari, invisibili ad occhio
nudo.
La cellula rappresenta l’unità morfofunzionale degli organismi viventi. È la più piccola struttura ad
essere classificabile come vivente, essendo chiusa ed autosufficiente, in grado di assumere nutrienti,
di convertirli in prodotti metabolici o energia, di svolgere funzioni specializzate e di riprodursi.
Tali cellule sono caratterizzate da tempi di sdoppiamento in fase liquida di circa 20 secondi. A causa
della proliferazione il liquido nel quale avviene la riproduzione cellulare diventa torbido.
Temperatura, pH e presenza di ossigeno sono i parametri che devono essere tenuti sotto controllo
quando sono effettuati esperimenti in reattore miscelato. La proliferazione è favorita da piastre di
Petri: i microorganismi sono inizialmente isolati, in seguito si forma una colonia di microorganismi
identici (ogni colonia ha una morfologia caratteristica). Come vedremo è possibile anche una crescita
dei microorganismi su base solida, ma quest’ultima risulta meno efficiente.
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Le cellule si dividono in eucariote e procariote. In tabella 1 sono riportate le caratteristiche per le
quali i due tipi di cellula differiscono.
Tabella 1. Classificazione cellule
Cellula procariota
Cellule eucariote (Lieviti)
Le cellule sono avvolte da membrane cellulari flessibili, costituite prevalentemente da fosfolipidi, che
determinano la selezione delle specie chimiche in ingresso ed in uscita. All’esterno delle membrane
si trovano le pareti cellulari, la cui funzione principale è quella di conferire rigidità e resistenza
meccanica alla struttura. I costituenti principali delle cellule sono:
 Nucleo: contiene il materiale genetico ed è la sede di diversi processi legati alla riproduzione
cellulare (replicazione e trascrizione del DNA).
 Citoplasma: è la porzione di cellula che circonda il nucleo ed è delimitata esternamente dalle
membrane cellulari. È la sede di importanti trasformazioni come la glicolisi e la biosintesi di
acidi grassi.
 Mitocondri: sede di importanti reazioni biochimiche come il ciclo TCA, la fosforilazione
ossidativa, l’ossidazione di acidi grassi e la degradazione di amminoacidi.
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
Reticolo endoplasmatico: sede di reazioni metaboliche, quali sintesi di lipidi e modificazione
delle proteine cellulari.
 Vacuoli: raccolgono nutrienti di riserva o rifiuti da espellere all’esterno della cellula.
 Vescicole: racchiudono componenti cellulari assunti dall’ambiente esterno.
 Apparato di Golgi: indirizza, attraverso modifiche chimiche, specifici componenti cellulari
verso la loro destinazione (altri organi, membrana plasmatica o ambiente esterno).
Gli organismi viventi sono classificati sulla base delle cellule costituenti in procarioti ed eucarioti:
ciascun dominio è costituito da sottoclassi dette regni ( a sua volta divisi in phylum, classi, ordini,
famiglia, genere e specie). Sono di seguito riportati esempi di organismi viventi. La scienza che si
occupa della descrizione completa delle specie individuando anche la morfologia microscopica e ad
occhio nudo è la tassonomia.
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Metabolismo
Per metabolismo si intende il complesso di reazioni chimiche che hanno luogo in ogni organismo
vivente. Attraverso le reazioni metaboliche, l’energia chimica dei nutrienti (zuccheri, grassi e
proteine) viene immagazzinata e successivamente impiegata per lo svolgimento delle funzioni
indispensabili alla sopravvivenza della cellula, quali sintesi di componenti cellulari, mantenimento e
movimento. Le reazioni metaboliche sono classificate in reazioni cataboliche (Catabolismo) e
reazioni anaboliche (Anabolismo).
Catabolismo
È il complesso di reazioni attraverso le quali molecole complesse vengono decomposte in molecole
più semplici.
Carboidrati, grassi, proteine  molecole piccole+ CO2+ H2O+ energia
La maggior parte delle reazioni cataboliche è esoergonica ed avviene spontaneamente: l’energia
rilasciata per effetto delle reazioni cataboliche viene in parte immagazzinata ed in parte utilizzata per
consentire lo svolgimento delle reazioni anaboliche, che sono endoergoniche.
Anabolismo
Si tratta del complesso di reazioni attraverso le quali, partendo da molecole semplici, vengono
sintetizzati nuovi componenti cellulari e svolte funzioni necessarie per la sopravvivenza della cellula.
Molecole piccole+ energia  molecole complesse
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L’energia prodotta dalle reazioni cataboliche è recuperata trasformando ADP (contenente 2 legami
fosfodiestere) in ATP (molecola contenente 3 legami fosfodiestere).
ADP+ PO3+ energia  molecole piccole+ CO2+ H2O+ energia
ADP+ PO3+ energia  ATP
L’energia immagazzinata sotto forma di ATP può essere spesa per far avvenire le reazioni anaboliche
che sono endoergoniche e quindi termodinamicamente sfavorite.
La scissione di una molecola di ATP con separazione di un gruppo fosfato determina la rottura di un
legame ad alta energia e rappresenta una reazione esoergonica.
L’ATP può essere considerato come un serbatoio temporaneo nel quale viene immagazzinata
l’energia prodotta dalle reazioni cataboliche, successivamente spesa per far avvenire le reazioni
anaboliche.
ATP ADP+ PO3+ energia
ΔG0=-7.3 kcal/mol *
Molecole piccole+ energia  molecole complesse
Una reazione termodinamicamente sfavorita (ΔG0 >0) può aver luogo se è accoppiata ad una
reazione termodinamicamente favorita se esiste un intermedio comune di reazione. Consideriamo il
seguente esempio:
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L’accoppiamento delle due reazioni avviene attraverso la formazione di un intermedio comune: il
glutammato reagisce prima con l’ATP e poi con l’ammoniaca.
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Crescita microbica
Una coltura di microorganismi è un metodo per la moltiplicazione di microorganismi in determinate
condizioni operative. La coltura può avvenire in:
 Terreno liquido: i microorganismi sono sospesi in un terreno liquido contenente i nutrienti.
Il liquido è miscelato per cui i microorganismi si distribuiscono omogeneamente nel terreno.
 Terreno solido: i microorganismi sono cresciuti sulla superficie di un terreno solido o al suo
interno. Non essendo il terreno miscelato, i microorganismi rimangono vicini e non sono
quindi in grado di spostarsi. Ciascun microorganismo può originare una colonia contenente
milioni di nuovi organismi, visibile ad occhio nudo.
Per sopravvivere e riprodursi i microorganismi
hanno bisogno di assumere nutrienti dall’ambiente
esterno. La composizione chimica delle cellule ci da
una indicazione su quali siano le principali esigenze
nutrizionali. Gli elementi prevalenti sono C, O, N, H,
P, S, che sono presenti nei principali componenti
della biomassa (carboidrati, proteine, lipidi e acidi
nucleici).
Consideriamo
per
esempio
la
composizione elementare di una cellula di E.Coli
(vedi figura).
I nutrienti possono essere classificati in
micronutrienti e macronutrienti. I macronutrienti
sono gli elementi di cui i microorganismi hanno bisogno in quantità significative. Sono anche i
maggiori componenti della biomassa.
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I micronutrienti sono gli elementi necessari in quantitativi ridotti, in genere acquisiti come impurità
di altri composti): esempi sono manganese, zinco, cobalto, molibdeno, nickel e rame.
Alcuni microorganismi richiedono molecole organiche, come componenti cellulari e loro precursori,
che l’organismo è incapace di sintetizzare autonomamente e che devono essere somministrati
dall’ambiente esterno: essi costituiscono i fattori di crescita.
I terreni di coltura possono essere sintetici (composizione nota dal punto di vista qualitativo e
quantitativo) oppure complessi (composizione chimica non nota).
Sono riportati di seguito esempi per entrambe le categorie.
Oltre ai terreni liquidi possono essere utilizzati terreni solidi: essi consentono una crescita microbica
più senta rispetto ai terreni liquidi e sono
adatti per operazioni accessorie come
stoccaggio, conta e selezione. Per
ottenere un terreno solido si prepara
prima di tutto un terreno liquido con la
composizione desiderata, cui si aggiunge
in seguito AGAR (1-2%). Si tratta di un
polisaccaride estratto dalle alghe che
gelifica a temperature inferiori ai 40°C; non è tossico né metabolizzabile dai microorganismi. In
definitiva il terreno liquido è scaldato fino a temperature superiori a 40°C, si aggiunge agar ed in
seguito si ha passaggio sol gel per l’abbassamento della temperatura.
Alcuni terreni sono selettivi, ossia arricchiti con particolari composti per favorire la crescita di
specifici microorganismi allo scopo di isolare alcune specie. Un esempio è dato da terreno+antibiotici
che impedisce la crescita ai batteri che non resistono agli antibiotici usati. I terreni differenziali,
invece, permettono di differenziare alcune specie batteriche da altre mettendo in evidenza particolari
caratteristiche metaboliche. Un esempio è terreno+sangue che evidenzia la presenza di
microorganismi emolitici.
Altri impieghi dei terreni solidi sono:
•isolamento colture pure (striscio su piastra)
•osservazione morfologia delle colonie (caratteristica di ogni specie)
•conta batterica (conta vitale)
Isolamento dei microorganismi
Si immerge un’ansa nel campione, e si insemina su una piastra di terreno solido attraverso una serie
di strisci Il primo striscio depositerà sul terreno solido un numero relativamente grande di
microorganismi. Gli strisci successivi determineranno il rilascio di un numero inferiore di
microorganismi, consentendo l’isolamento di singole colonie. Queste operazioni sono eseguite in una
cappa a flusso laminare, ossia in un ambiente fatto per conservare la sterilità dell’ambiente. Il campo
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di moto laminare non favorisce la miscelazione, per cui aria fuoriesce e quella presente all’esterno
non può entrare. Utilizzando l’ansa si preleva una singola colonia e poi si depositano in una piastra
diversa strisciando. Lo striscio è ripetuto più volte in più direzioni: in questo modo all’aumentare del
numero di strisci si ottengono colonie sempre più distinguibili morfologicamente.
Classificazione dei microorganismi secondo le esigenze colturali.
Fattori che influenzano la crescita microbica.
I microorganismi possono essere classificati sulla base dell’influenza di differenti fattori, quali
temperatura, pH, concentrazione di soluti e fabbisogno di ossigeno.
 Temperatura
Gli organismi sono distinti in psicrofili, mesofili, termofili ed ipertermofili in base alla
temperatura di crescita; la maggior parte dei microorganismi noti è mesofila.
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pH
I microorganismi sono distinti in alcalifili e acidofili a seconda che vivano in ambienti basici o
acidi.
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