Elucigene® QST*R-21 Euplex Istruzioni per l`uso

Elucigene® QST*R-21 Euplex Istruzioni per l'uso del test
Elucigene® QST*R-21 Euplex
Istruzioni per l’uso
Prodotto
Elucigene QST*R-21 - Euplex
Size
10 test
Codice catalogo
ANE21BX
Per uso diagnostico in vitro
Prodotto da:
Elucigene Diagnostics
Citylabs
Nelson Street
Manchester
M13 9NQ
Vendita, assistenza clienti e assistenza tecnica:Tel.: +44 (0) 161 669 8122
Fax: +44 (0) 161 669 8129
E-mail: E: [email protected]
E-mail: [email protected]
Elucigene Diagnostics è il nome commerciale di Delta Diagnostics (UK) Limited, una società iscritta in Inghilterra e nel Galles al
numero di iscrizione 8696299.
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Elucigene® QST*R-21 Euplex Istruzioni per l'uso del test
Elucigene QST*R-21 - Euplex
Uso previsto
QST*R-21 Euplex è un kit supplementare studiato per essere utilizzato congiuntamente a QST*R o QST*Rplusv2
per la diagnosi routinaria quantitativa in vitro della trisomia associata al Cromosomo 21 (sindrome di Down). Questo
test fornisce un'ulteriore analisi dei cromosomi, qualora necessario, o la conferma di risultati positivi. La metodica
impiegata da questi kit è la tecnica QFPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa in fluorescenza). I
dispositivi sono destinati all’uso su DNA estratto dal liquido amniotico o da campioni di villi coriali (VC) prelevati
durante l’amniocentesi. La popolazione target di interesse è costituita da donne in gravidanza che, in seguito a
procedure diagnostiche ecografiche e biochimiche, sono ritenute "ad alto rischio”"di sviluppare un feto affetto da
anomalie, oppure sono ritenute "a rischio" in seguito ad anamnesi familiare o per età materna. Il dispositivo è
destinato all’uso congiuntamente ad altre procedure diagnostiche al fine di supportare o scartare la diagnosi clinica
proposta.
Il dispositivo è destinato esclusivamente all’uso professionale in ambiente di laboratorio citogenetico o molecolare.
Riepilogo e spiegazione
Il rischio di dare alla luce un bambino con la sindrome di Down aumenta in modo significativo con l’età della madre,
da circa 1:1.600 all’età di 20-24 anni, a 1:200 all’età di 35 anni e 1:19 all’età di 45 anni o superiore. Alle donne in
gravidanza viene offerto uno screening routinario per la sindrome di Down nel primo trimestre di gravidanza. Un
test standard è il cosiddetto test "OSCAR", One Stop Clinical Assessment of Risk (test combinato per la valutazione
clinica del rischio) da effettuarsi tra le 10 e le 13,5 settimane di gravidanza. Questo test associa due marker
biochimici, la free beta hCG (gonadotropina corionica umana libera) e la PAPP-A (proteina plasmatica A associata
alla gravidanza) con la misurazione dello spessore della plica nucale del feto (translucenza nucale) (1).
Combinando i risultati di questi tre test si ottiene una stima complessiva del rischio. Alle donne identificate per
l’alto rischio di dare alla luce un bambino con la sindrome di Down viene proposta l’amniocentesi per provare in
maniera diretta l’eventuale presenza dell’anomalia. L’amniocentesi è un test invasivo che consiste nell’inserimento
di un ago all’interno del sacco amniotico intorno al feto, sotto controllo ecografico. In questo modo viene prelevato
un piccolo campione di liquido amniotico, tipicamente di 10-20 ml, che viene successivamente analizzato.
La sindrome di Down prende il nome dal dott. John Langdon Down che la descrisse nel 1866 (sebbene fosse stata
già descritta in precedenza). È causata dalla trisomia di tutto il cromosoma 21 o di una parte di esso (2). Oltre a
manifestare una disabilità cognitiva di grado variabile, gli individui affetti da sindrome di Down mostrano tipicamente
un certo numero di caratteristiche comuni, tra cui ipotonia (scarso tono muscolare), protrusione della lingua, occhi
a mandorla dovuti alla piega epicantica, fessure palpebrali oblique e rivolte verso l’alto, plica palmare unica e arti
più corti. Tali individui sono anche ad alto rischio di sviluppare difetti congeniti cardiaci e in età tardiva di sviluppare
una forma della malattia di Alzheimer.
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Principi della procedura
La metodica impiegata dai kit Elucigene QST*R è la tecnica QF-PCR (reazione a catena della polimerasi
quantitativa in fluorescenza) (3-7). Utilizzando l’amplificazione mediante PCR, i primer marcati con un colorante
fluorescente sono diretti a individuare le regioni altamente polimorfiche delle sequenze di DNA denominate
ripetizioni in tandem brevi (short tandem repeat, STR) che sono localizzate sui cromosomi di interesse. Ogni
marker STR individuato è specifico per il cromosoma su cui si trova, pertanto il numero di copie del marker STR
può essere indicativo del numero di copie del cromosoma. Sono stati selezionati marker STR informativi che
mostrano un’elevata eterogeneità, in modo tale da determinare facilmente il numero di copie. Un campione diploide
normale presenta il normale complemento di due di ciascuno dei cromosomi somatici, pertanto i due alleli di un
STR specifico per un cromosoma vengono determinati dalla tecnica QF-PCR come due picchi in rapporto 1:1.
L’osservazione di un allele STR in più come profilo a tre picchi in rapporto 1:1:1 o come profilo a due picchi in
rapporto 2:1 o 1:2 è indicativo della presenza di una sequenza aggiuntiva che a sua volta rappresenta un
cromosoma aggiuntivo, come nel caso di una trisomia.
I prodotti di amplificazione ottenuti con la tecnica QF-PCR vengono analizzati in modo quantitativo con un
analizzatore genetico mediante elettroforesi capillare per determinare il numero di copie dei marker STR analizzati.
Avvertenze e precauzioni
1.
Il DNA normale di controllo fornito all’interno dei kit è stato analizzato a parte ed è risultato negativo al
virus dell’epatite B (HBV), al virus dell’epatite C (HCV) e al virus dell’immunodeficienza umana (HIV) 1 e
2.
2.
Si consiglia di manipolare con cautela il materiale di origine umana. Tutti i campioni devono essere
considerati potenzialmente infettivi. Nessun metodo di analisi può offrire la certezza assoluta dell’assenza
dei virus HBV, HCV, HIV o di altri agenti infettivi.
3.
La manipolazione dei campioni e dei componenti del test, il loro utilizzo, la conservazione e lo smaltimento
devono avvenire in conformità con le procedure definite dalle linee guida o dai regolamenti nazionali
appropriati in materia di sicurezza e rischio biologico.
4.
In osservanza delle buone pratiche di laboratorio correnti, i laboratori devono analizzare in ciascun test i
propri campioni di controllo qualità interno di tipo noto, in modo da poter valutare la validità della
procedura.
5.
Se la scatola del kit è danneggiata, anche il contenuto potrebbe essere danneggiato; non utilizzare il kit
e contattare l’assistenza clienti.
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Simboli usati sulle etichette
I simboli usati su tutte le etichette e le confezioni sono conformi alla norma armonizzata
ISO 15223
Produttore
Numero di test
Vedere le Istruzioni per l'uso
X°C
Conservare al di sotto della temperatura indicata
Utilizzare prima della data indicata
Codice catalogo
Numero di lotto o partita
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
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Materiali forniti
Conservare tutti i componenti a temperature inferiori a -20 °C.
Il kit Elucigene QST*R-21 Euplex IVD contiene:
450226 1 x 100µl Miscela di reazione (TA)
404485 1 x 50µl DNA di controllo DNA (DC)
Sufficiente per 10 test.
Preparazione e conservazione del kit
All'apertura del kit si consiglia di dispensare la miscela di reazione in provette per PCR da 0.2ml in volumi di 10µl
e congelare a -20°C. Assicurarsi che il contenuto delle provette sia accuratamente scongelato e mescolato prima
che sia dispensato.
Il DNA di controllo deve essere congelato a -20°C.
Materiali necessari ma non forniti
Generali
Materiali di consumo di laboratorio: guanti, tubi per microcentrifuga con tappo a vite, provette per PCR da 0.2ml o
piastre di microtitolazione raccomandati dal produttore del termociclatore impiegato, puntali per pipette.
Apparecchiature di laboratorio: pipette di precisione (2 set: 1 per la post-amplificazione e 1 per la manipolazione
post-amplificazione, preferibilmente pipette a spostamento positivo), indumenti di protezione, vortex,
microcentrifuga, centrifuga con piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.
Estrazione del DNA
Preparazione del DNA: matrice InstaGene (Bio-Rad Laboratories, n. cat. 732-6030), acqua deionizzata sterile.
Amplificazione mediante PCR
Termociclatore adatto per piastre di microtitolazione a 96 pozzetti o provette da 0.2ml con accuratezza di
temperatura di +/-1°C tra 33°C e 100°C e uniformità di temperatura statica di +/-1°C. QST*R-21 Euplex è stato
convalidato e ha mostrato di soddisfare la specifica sulle seguenti piattaforme di termociclatore:




Life Technologies GeneAmp 9700 (funzionamento in modalità standard)
Life Technologies Veriti Dx (funzionamento in modalità standard)
Life Technologies Veriti Dx (funzionamento in modalità di simulazione 9700)
Life Technologies Proflex (funzionamento in modalità standard)
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Elettroforesi capillare
Elettroforesi capillare: size standard GeneScan 500 LIZ (ABI, n. cat. 4322682), polimero POP-7 (ABI, n. cat.
4352759), standard per la matrice DS-33 (set di coloranti G5) (ABI n. cst. 4345833), tampone per analizzatore
genetico 10x (ABI, n. cat. 402824) e formammide Hi-Di (ABI, n. cat. 4311320).
Analizzatori genetici Applied Biosystems ABI 3130 e 3500 (con software GeneMapper), array di capillari di 36 cm
(array di capillari di 50 cm per l’analizzatore genetico 3500), piastre ottiche a 96 pozzetti, setti per 96 pozzetti,
cassette per 96 pozzetti.
Analisi dei dati
È richiesto uno dei seguenti pacchetti software per l’analisi dei dati: GeneMapper 3.7 (Applied Biosystems Inc.) o
versione successiva o GeneMarker 1.65 (SoftGenetics LLC) o versione successiva.
Documentazione aggiuntiva Elucigene QST*R
Queste Istruzioni per l'uso includono una sezione di base sull'interpretazione dei risultati ottenuti in aggiunta a una
guida al software di analisi con i pacchetti GeneMapper e GeneMarker. Una documentazione aggiuntiva, Guide
to interpretation (Guida all’interpretazione) con esempi e un glossario sono disponibili sul sito web di Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/.
Prelievo e conservazione dei campioni
I campioni da utilizzare sono i villi coriali (VC) o il liquido amniotico (LA). È stato segnalato che talvolta i dispositivi
di prelievo dei campioni influiscono in modo negativo sull’integrità di determinati analiti e che potrebbero interferire
con alcune tecnologie metodologiche. Si raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che il dispositivo scelto
venga utilizzato secondo le istruzioni del produttore e che i dispositivi di prelievo dei campioni e i metodi alternativi
di preparazione del DNA siano compatibili con questo test.
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Estrazione del DNA
I kit Elucigene QST*R sono convalidati per il metodo di estrazione del DNA con matrice InstaGene e possono
essere eseguiti in un’unica provetta, eliminando la necessità di trasferire i campioni da una provetta all’altra.
Risultati ugualmente affidabili si osservano con altri metodi di estrazione, come i kit Qiagen QIAamp.
Il metodo di estrazione del DNA InstaGene è descritto di seguito:
Metodo di estrazione Instagene
Liquido amniotico (LA)
Occorre utilizzare circa 1-2 ml di liquido amniotico.
Villi coriali (VC)
I campioni VC devono essere puliti con cura per rimuovere ogni residuo di decidua materna. È importante che
vengano analizzate cellule prelevate da aree diverse del campione e che siano rappresentate anche le cellule del
mesenchima, la parte interna del villo. Per l’analisi QST*R si consiglia di utilizzare una piccola aliquota della
sospensione di cellule preparata per l’allestimento della coltura cellulare convenzionale. Questo accorgimento
garantisce che il risultato QST*R sia ottenuto dalla stessa popolazione di cellule utilizzate per l’analisi del cariotipo.
1. Risospendere la matrice InstaGene su un agitatore magnetico impostandolo a velocità media per almeno 5
minuti.
2. Centrifugare il campione (LA o VC) a 12.000 g per 1 minuto per far depositare il pellet cellulare.
3. Togliere i campioni dalla centrifuga ed esaminare il pellet visivamente per rilevare l’eventuale colorazione dovuta
alla presenza di sangue. Se si osserva una colorazione dovuta alla presenza di sangue, annotarne la percentuale.
4. Rimuovere il surnatante dal pellet ed eliminarlo, avendo cura di non toccare il pellet durante l’operazione. Tenere
da parte circa 10-20 µl di surnatante da utilizzare per risospendere il pellet.
5. Mescolare con cura il campione con il vortex.
6. Se si osserva una colorazione dovuta alla presenza di sangue superiore al 50%, passare al punto 7. Se si
osserva una colorazione dovuta alla presenza di sangue inferiore al 50%, passare al punto 8.
7. Aggiungere 200 µl di acqua deionizzata sterile al pellet cellulare. Mescolare con cura con il vortex. Centrifugare a 12.000 g per
1 minuto, rimuovere il surnatante lasciandone da parte 10-20 µl da utilizzare per risospendere il pellet.
Nota: Questa ulteriore fase di lavaggio agevola la lisi degli eritrociti e rimuove il gruppo eme che potrebbe inibire la
PCR.
8. Aggiungere ai campioni 200 µl di matrice InstaGene, preparata come indicato al punto 1, utilizzando un puntale
per pipetta a foro largo, ad esempio per pipette da 1.000 µl.
Nota: Per ottimizzare il protocollo di estrazione, il volume aggiunto di matrice InstaGene (resina Chelex-100) può
essere variato usando 100 µl di matrice InstaGene per piccoli pellet cellulari di LA (appena visibili) oppure 300 µl
per pellet grandi (che ricoprono la base della provetta), campioni VC e tissutali. Annotare la quantità di matrice
InstaGene aggiunta a ciascun campione.
9. Mescolare accuratamente i campioni con il vortex e incubarli a 100 °C per 8 minuti in un blocco riscaldante o in
un bagnomaria.
10. Mescolare di nuovo accuratamente con il vortex ad alta velocità per 10 secondi.
11. Centrifugare i campioni a 12.000 g per 3 minuti. Il surnatante contiene il DNA estratto.
12. Procedere alla preparazione della PCR o conservare il DNA estratto a -20 °C fino al momento dell’uso.
Concentrazione del DNA
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Prima di usare i risultati a scopo diagnostico, si raccomanda di valutare accuratamente con il test Elucigene QST*R
i metodi e i tipi di campioni alternativi per l’estrazione del DNA.
In condizioni ottimali per la PCR e utilizzando le impostazioni consigliate per l'iniezione dei campioni* indicate nel
modulo di analisi per le colonne capillari (pag.11), si ottengono sempre risultati accettabili con quantitativi di DNA
di input compresi tra 1.25ng to 10ng.
*Nota: È possibile modificare le impostazioni di iniezione dei campioni in funzione della quantità di ampliconi prodotti
durante la reazione di PCR, che può variare a seconda della quantità di DNA genomico di input aggiunto. Riducendo
il tempo di iniezione è possibile applicare una minore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. Aumentando
invece il tempo o la tensione di iniezione è possibile applicare una maggiore quantità di ampliconi alla colonna di
analisi. È possibile reiniettare più volte i campioni amplificati per rianalizzarli.
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Protocollo del test
Procedura di amplificazione
Nota: Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, le operazioni descritte ai punti 3 - 5 devono essere
condotte in un’area priva di DNA. Queste operazioni devono essere eseguite anche per evitare la
contaminazione con il prodotto di PCR.
1.
Programmare il termociclatore per un ciclo di un unico passaggio a 95 °C per 15 minuti per attivare la
DNA polimerasi seguito da un programma ciclico di amplificazione di 30 secondi a 95 °C (denaturazione),
1 minuto e 30 secondi a 59 °C (annealing) e 1 minuto e 30 secondi a 72 °C (estensione) per 26 cicli.
Questo ciclo deve essere collegato ad un file di ritardo di 30 minuti a 72 °C (estensione) sul ciclo finale.
Finale
Attivazione
enzimatica
Programma ciclico
95o C
95o C
15 min.
30 s
Estensione
72o C
72o C
1 min e 30 s
30 min.
59o C
Temperatura
ambiente
1 min e 30 s
26 cicli
2.
Ciascun ciclo di PCR deve includere un controllo negativo (acqua). Può essere opportuno includere
anche altri controlli, ad esempio un controllo positivo normale (DNA di controllo fornito con il kit) e un
controllo positivo per la trisomia (DNA non fornito).
3.
Scongelare un numero di provette contenenti la miscela di reazione QST*R-21 Euplex precedentemente
suddivisa in aliquote, che sia sufficiente per il numero di campioni e controlli da analizzare (vedere la nota
in Materiali forniti) e centrifugarle a 12.000 g per 10 secondi.
4.
Utilizzando puntali per pipette diversi, aggiungere 2,5 µl di DNA da analizzare alla provetta del campione
contenente 10 µl di miscela di reazione QST*R-21 Euplex e miscelare aspirando e rilasciando con la
pipetta. Ripetere l’operazione per tutti i campioni da analizzare.
5.
Nella provetta per PCR che verrà utilizzata per il controllo negativo non aggiungere DNA, ma aggiungere
2,5 µl di acqua distillata sterile.
Nota: È necessario prestare attenzione a non contaminare la reazione di PCR con la resina InstaGene.
6.
Centrifugare brevemente le provette fino a quando tutto il liquido si sarà depositato sul fondo di ciascuna
provetta.
7.
Posizionare tutte le provette nel blocco del termociclatore in modo che siano ben ferme. Avviare il
programma di attivazione a 95° C seguito dal programma di amplificazione (vedere il punto 1).
8.
Al termine del programma di amplificazione, i campioni possono essere conservati a temperatura
ambiente per tutta la notte oppure a 2° C - 8° C per un massimo di 7 giorni prima dell’analisi con
elettroforesi capillare.
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Elettroforesi capillare
Si raccomanda a ciascun utilizzatore di assicurarsi che l’apparecchiatura selezionata sia usata secondo le istruzioni
della ditta produttrice e che sia compatibile con questo test. In questo contesto, i parametri chiave sono il polimero
e l’array di capillari. Risultati ottimali si possono ottenere utilizzando le seguenti condizioni per l’elettroforesi
capillare sull’analizzatore genetico ABI3130 o ABI3500.
1.
Combinare 6,85 µl di size standard con 250 µl di formammide Hi-Di e miscelare con cura (miscela
sufficiente per 16 pozzetti). Dispensare 15 µl di miscela nel numero di pozzetti necessario su una piastra
ottica a 96 pozzetti.
2.
Aggiungere 3 µl di prodotto di PCR del campione di analisi alla miscela di size standard (preparata come
indicato al punto 1) precedentemente dispensata nella piastra e miscelare con la pipetta. Sigillare la
piastra.
3.
Denaturare il prodotto di PCR dispensato nella piastra ottica in un termociclatore utilizzando i seguenti
parametri: 94 °C per 3 minuti e a seguire 4 °C per 30 secondi.
4.
Centrifugare la piastra a 1.000 g per 10 secondi per rimuovere eventuali bolle nei pozzetti e caricarla
sull’analizzatore genetico.
*Nota: È essenziale che i pozzetti non utilizzati (cioè i pozzetti in cui è caricato il campione di DNA)
siano sempre caricati con formammide Hi-Di per garantire che i capillari non si asciughino.
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Analisi dei dati post-PCR
ABI3130 GENETIC ANALYZER (ANALIZZATORE GENETICO)
Creare una scheda campione utilizzando il software di raccolta dati 3130 con le seguenti impostazioni:
• Nome campione: deve essere lo stesso nome o numero specifico del campione.
• Responsabile analisi: selezionare il responsabile predefinito del laboratorio.
• Protocollo di analisi: QSTR (contiene il modulo di analisi QST*R 3130 – vedere sotto)*.
*Nota: È necessario creare un modulo di analisi elencando le impostazioni dello strumento e successivamente
assegnare questo modulo a un protocollo di analisi in cui sia stato selezionato il set di coloranti G5. Per ulteriori
informazioni sulla creazione dei moduli di analisi, consultare il manuale d’uso dello strumento in dotazione.
3130 RUN MODULE (MODULO DI ANALISI)
PER IL POLIMERO POP7
Modulo per capillare da 36 cm: QSTR
#
Nome del parametro
Valore
Intervallo
1.
2.
3.
4.
5.
6
7
8.
9
10
11
12
Temperatura forno
Poly_fill_Vol.
Stabilità corrente
PreRun_Voltage
Pre_Run_Time
Injection_Voltage
Injection_Time
Voltage_Number_of_Steps
Voltage_Step_Interval
Data_Delay_Time
Run_Voltage
Run_Time
60
6500
5.0
15.0.
180
3.0
15
20
15
60
15,0
1200
int 18…65 gradi C
6500…38000 fasi
int 0…2000 uAmp
0 …15 kvolt
1…1000 s
1 …15 kvolt
1…600 s
1…100 nk
1…60 s
1…3600 s
0 …15 kvolt
300…14000 s.
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ABI3500 GENETIC ANALYZER (ANALIZZATORE GENETICO)
È necessario creare un protocollo dello strumento per QSTR che può essere usato successivamente per
ciascuna analisi QSTR. Creare il protocollo dello strumento per QSTR mediante la libreria dei protocolli
dello strumento 3500.
Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci:
• Run Module (Modulo di analisi): FragmentAnalysis50_POP7
• Immettere le impostazioni illustrate nell’immagine qui sotto:
Per analizzare i campioni, creare una piastra del campione facendo clic su "Create Plate from Template" (Crea
piastra da modello) nel "Dashboard", assicurarsi che sia stato assegnato il protocollo dello strumento corretto per
QSTR (vedere sopra).
Analisi e interpretazione dei risultati
È consigliabile che ogni laboratorio sviluppi le proprie procedure e i propri criteri di interpretazione e refertazione
dei risultati. Le linee guida di miglior pratica per la QF-PCR sono state documentate dalla Association for Clinical
Genetic Science del Regno Unito e sono disponibili sul sito:
www.acgs.uk.com
I prodotti di PCR vengono osservati in un sistema marcato con 5 coloranti utilizzando il set di filtri G5. Il set di filtri
G5 permette di rilevare i frammenti marcati con 6-FAM (blu), VIC (verde), NED (giallo) e PET (rosso) più il marker
size standard marcato con LIZ (arancione) su un elettroferogramma con il programma GeneMapper o GeneMarker.
Una guida all'interpretazione è disponibile sul sito web di Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/.
Nota importante: Le diverse combinazioni di strumenti, polimeri e size standard possono causare lievi variazioni
nell’assegnazione delle dimensioni. Durante la convalida del kit, l’utente deve verificare che le impostazioni del
file bin predefinite consentano un’etichettatura accurata dei picchi e, se necessario, deve regolarle. In caso di
difficoltà, contattare l’assistenza tecnica. ([email protected]).
Linee guida generali per QST*R-21 Euplex
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1.
Il controllo negativo non deve mostrare picchi alti e stretti nell’intervallo di valori compreso tra 100 bp e 510
bp.
2.
Il controllo positivo deve mostrare i risultati attesi e tutti i picchi devono soddisfare i criteri riportati di seguito.
3.
Per l’analisi dei campioni di DNA si deve osservare almeno 1 picco per ogni marker analizzato. L’intervallo
accettabile per i picchi dei marker analizzati con l’analizzatore genetico 3130 è compreso tra 50 e 6000
unità di fluorescenza relativa (rfu), mentre per i marker analizzati con gli analizzatori genetici 3500 è
compreso tra 175 e 32000 rfu. Le altezze dei picchi che non rientrano in questo intervallo non devono
essere analizzate.
4.
Gli elettroferogrammi di scarsa qualità dovuta ad eccessivo spargimento (bleedthrough) tra i coloranti
(fenomeno noto anche col termine di "pull-up") o "spikes elettroforetici" (picchi alti e stretti presenti in più di un
colorante) non devono essere interpretati. I prodotti di PCR devono essere reiniettati e rianalizzati.
5.
L’analisi viene eseguita valutando il rapporto tra i picchi (A1/A2), dove A1 è l’area del picco del frammento più
corto e A2 è l’area del picco del frammento più lungo. Il rapporto che ne deriva è indicativo del numero di copie
dei loci. Per le disomie cromosomiche, i marker eterozigoti devono mostrare due picchi con altezze simili.
Un’analisi completa dello stato del numero di copie dei cromosomi viene eseguita dal confronto tra i rapporti
dell’area dei picchi.
6.
I marker eterozigoti diallelici (cioè due alleli) devono rientrare in un intervallo di rapporti compreso tra 0,8 e
1,4. Tuttavia, per due alleli le cui dimensioni si discostano di più di 24 bp, è accettabile un rapporto non
superiore a 1,5. Qualunque valore che cade all’interno di questo intervallo viene considerato rientrante nel
rapporto 1:1. Se il bilanciamento dei rapporti non rientra in questo intervallo, la causa potrebbe essere
attribuita a vari fattori, tra cui:








Trisomia cromosomica completa
Trisomia cromosomica parziale (incluse le duplicazioni submicroscopiche)
Mosaicismo
Secondo genotipo contaminante (ad es., materno, gemello, esterno)
Stutter che causano "skewing" (deviazioni significative del rapporto 1:1);
Amplificazione preferenziale di un allele che causa "skewing"
Polimorfismo in corrispondenza dei siti di legame dei primer
Mutazioni somatiche nelle regioni microsatelliti.
La Guide to Interpretation (Guida all’interpretazione) contiene degli esempi di profili tipici per molti di questi casi.
I marker omozigoti risultano non informativi perché non può essere determinato un rapporto.
7.
Per poter interpretare un risultato come anomalo (ossia, presenza di una trisomia), è necessario individuare
almeno due marker informativi coerenti con il genotipo a tre alleli mentre tutti gli altri marker possono risultare
non informativi. Non è consigliabile interpretare un risultato come anomalo basandosi sulle informazioni
ottenute da un unico marker.
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La trisomia è determinata dalle seguenti condizioni:
7.1. Due picchi di altezza diversa. Tale condizione è dovuta al fatto che uno dei picchi rappresenta due alleli presenti in
uno o in entrambi i genitori. In tal caso, il rapporto tra i due picchi verrà classificato come 2:1 o 1:2 tale che A1/A2
fornirà un risultato nella regione compresa tra 1,8 e 2,4 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area
più grande rispetto al picco che rappresenta l’allele più lungo, oppure A1/A2 fornirà un risultato nella regione
compresa tra 0,45 e 0,65 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più piccola rispetto al picco
che rappresenta l’allele più lungo.
7.2. Presenza di tre picchi di altezza comparabile. Il rapporto dei picchi verrà classificato come 1:1:1 e i rispettivi valori
rientrano nell'intervallo 0,8 – 1,4 (sebbene, per gli alleli che si discostano tra loro di più di 24 bp, si considera
accettabile un rapporto con valore fino a 1,5). Se ciò non si verifica, la causa potrebbe essere attribuita ad uno dei
fattori menzionati al punto 6.
8.
Per interpretare un risultato come normale, è necessario individuare almeno due marker informativi coerenti
con un genotipo a due alleli mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Un risultato normale
indica il normale complemento di due per i cromosomi analizzati.
9.
I rapporti dell’area dei picchi che rientrano negli intervalli normale e anomalo vengono classificati come
inconcludenti. I risultati inconcludenti possono essere risolti utilizzando i kit per singoli cromosomi.
10. Se per un singolo cromosoma si ottengono entrambi i profili allelici normale e anomalo, prima di trarre
qualunque conclusione si consiglia di approfondire le ricerche con test di controllo per identificare il motivo
della discrepanza fra i risultati.
11. In rari casi, gli intervalli delle dimensioni alleliche per i marker possono sovrapporsi. Se si sospetta tale
circostanza, un’analisi con i kit per singoli cromosomi può essere risolutiva.
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Caratteristiche dell’esecuzione del test
CONVALIDA INTERNA
Trenta (30) campioni di DNA estratti dal liquido amniotico o da campioni di villi coriali e dello stato diploidia noto
del cromosomo 21 sono stati analizzati utilizzando Elucigene QST*R-21 Euplex. I risultati sono stati analizzati
seguendo i metodi consigliati. Tutti e trenta i campioni si sono amplificati in modo soddisfacente al primo tentativa,
25 di questi sono stati definiti come normali e 5 hanno indicato la presenza di una trisomia 21. Tutti i risultati hanno
mostrato una concordanza del 100% con i risultati precedentemente ottenuti con altri metodi già stabiliti.
Guida all'analisi di GeneMapper (v3.7 e superiore)
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Nota - I seguenti screenshot GeneMapper sono riferiti a GeneMapper v5.0
Importazione e analisi di file QST*R
1.
Aprire il file del programma GeneMapper
2.
Fare clic su
per aggiungere file di dati a un nuovo progetto. Navigare dove sono salvati i file
di dati raw .fsa, evidenziare i file di dati appropriati e fare clic su ‘Add to List>>’. (Aggiungi a
lista>>)
3.
La cartella di analisi apparirà ora nella finestra ‘Samples to Add' (Campioni da aggiungere)
Facendo doppio clic sull'icona della cartella di analisi in questa finestra apparirà ogni file .fsa da
importare. I campioni vengono poi aggiunti facendo clic su
in basso nello schermo. I
file di dati verranno ora visualizzati nello schermo principale di GeneMapper (figura 2)
Figura 2: Campioni pronti da aggiungere al progetto
Importazione delle impostazioni di analisi di QST*R GeneMapper in GeneMapper Manager
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È necessario importare le impostazioni QST*R per GeneMapper. Questo processo viene controllato tramite
l’interfaccia "GeneMapper Manager". Le impostazioni QST*R GeneMapper sono disponibili sul sito web di
Elucigene: http://www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/.
1.
Aprire il programma ‘GeneMapper Manager’ facendo clic sull'icona
2.
Selezionare la scheda ‘Analysis Methods’ (Metodiche di analisi), quindi fare clic sul pulsante di
.
importazione
3.
Cercare i file delle impostazioni dell’analisi QST*R necessari (3130 o 3500) e importarli.
4.
Ripetere il processo selezionando la scheda corretta e importando i rispettivi file per:

• Table Settings (Impostazioni tabelle)

• Plot Settings (Impostazioni grafico)

• Size Standards (Size standard)
Nota - Cluster Plot Settings (Impostazioni grafico cluster), Matrices (Matrici), SNP Sets (Set SNP) e
Report Settings (Impostazioni rapporti) non richiedono l’importazione di file.
Importazione delle impostazioni dei pannelli QST*R-21 Euplex in Panel Manager (Gestione
pannelli)
È necessario importare le impostazioni del file bin e dei pannelli QST*R-21 Euplex per GeneMapper. Questo
processo viene controllato tramite l’interfaccia "Panel Manager" (Gestione pannelli).
Il pannello GeneMapper specifico per QST*R-21 Euplex e le impostazioni del file bin sono disponibili sul sito web
di Elucigene: http://www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/.
1.
Aprire il programma Panel Manager facendo clic sull’icona
2.
Fare clic su "Panel Manager" (Gestione pannelli) nella finestra di navigazione sinistra. La voce appare
ora evidenziata in celeste.
3.
Selezionare ‘File/Import Panels’ (File/Importa pannelli). Cercare il file dei pannelli GeneMapper e
importarlo.
‘QSTR-21 Euplex GeneMapper Panel File.txt’ (Figura 3).
4.
Il file dei pannelli verrà ora visualizzato nella finestra di navigazione sinistra. Fare clic sul file dei pannelli
per accertarsi che sia evidenziato in celeste.
5.
Selezionare "File/Import Bin Set" (File/Importa set bin). Cercare il file bin GeneMapper e importarlo.
‘QSTR-21 Euplex GeneMapper Bin File.txt’ (Figura 4).
6.
Fare clic su “Apply” (Applica) e poi su “OK”.
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.
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Figura 3: Importazione del file dei pannelli GeneMapper QST*R-21 Euplex
Figura 4: Importazione del file bin GeneMapper QST*R-21 Euplex
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Modifica del file dei parametri di analisi
Potrebbe essere necessario modificare la voce predefinita "Analysis Ranges"(Intervalli di analisi) nelle
impostazioni di analisi QST*R in previsione delle variazioni a livello locale delle condizioni di analisi. L’intervallo
minimo di analisi dipenderà dal capillare e dal polimero utilizzati durante l’acquisizione dei dati.
Per visualizzare le attuali impostazioni di analisi:
1.
Aprire il programma ‘GeneMapper Manager’ facendo clic sull'icona
2.
Selezionare la scheda "Analysis Methods"(Metodiche di analisi). Il file QST*R importato sarà elencato
.
come "QSTR Analysis v02" (Analisi v02 QSTR).
3.
Fare clic su "QSTR Analysis v02" (Analisi v02 QSTR). La riga appare ora evidenziata.
4.
Fare clic sul pulsante "Open" (Apri) e selezionare la scheda "Peak Detector" (Rivelatore picco) (Figura 5).
Per impostazione predefinita, gli intervalli di analisi sono impostati in modo da iniziare a 2.000 e finire a 18.000.
Figura 5: Intervalli di analisi.
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Per individuare il corretto intervallo di analisi per il proprio laboratorio:
1.
Nella finestra principale di GeneMapper, fare doppio clic sulla cartella di analisi importata per visualizzare
un elenco dei file FSA in essa contenuti.
2.
Selezionare un file FSA.
3.
Facendo clic sulla scheda “Raw data” (Dati grezzi) viene visualizzato un elettroferogramma dei dati
grezzi.
4.
Utilizzando come guida il primo picco del size standard (ad es., 75 bp di GS500LIZ), selezionare un punto
di dati di circa 100 punti più largo (Figura 6). In questo modo si determina il punto più basso nell’intervallo
analizzabile.
5.
Assicurarsi che il massimo intervallo dell'analisi comprende il più grande picco del size standard (ad es.
500bp di GS500LIZ o 600bp di GS600LIZv2).
6.
Inserire i nuovi valori nel file di analisi QST*R (per accedervi procedere come indicato sopra).
Figura 6: Individuazione dell’intervallo minimo utilizzando i dati grezzi dei campioni
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Analisi dei file importati QST*R-21 Euplex
1.
Nella finestra principale di GeneMapper selezionare "QST*R Table settings v02" (Impostazioni tabella
QST*R v02) (Figura 7).
Figura 7: Impostazioni impostazione tabella QST*R
2.
In ‘Analysis Method’ (Metodica di analisi) selezionare ‘QSTR Analysis v02’. Riempire ciascuna colonna
premendo ‘Ctrl+D’. Ripetere questo processo selezionando ‘QSTR 21 Euplex’ nel titolo ‘Panel’
(Pannello) e ‘QSTR’ nel titolo ‘Size Standard’. Ricordarsi ogni volta di riempire premendo ‘Ctrl+D’ per
garantire che ogni impostazione venga applicata all'intera lista di campioni.
3.
Fare clic su
per avviare l’analisi dei campioni. Assegnare un nome al progetto quando viene richiesto.
Esame dei dati QST*R-21 Euplex
1.
Selezionare il campione da analizzare (evidenziare la riga del campione).
2.
Fare clic su
3.
Selezionare "QST*R Plot settings" (Impostazioni del grafico QST*R) (Figura 8).
per ‘Display Plots’ (Visualizzare i grafici)
Figura 8: Impostazioni del grafico QST*R, menu a discesa.
4.
Nella finestra del grafico viene visualizzato il profilo del campione con i dati tabellari (Figura 9).
GeneMapper assegna automaticamente le etichette a non più di due picchi per ciascun marker. Se per
un marker sono presenti tre alleli, il terzo picco non etichettato dovrà essere etichettato manualmente
(vedere: Modifica manuale dei profili
Nota - Gli intervalli dell’entità di ciascun marker si basano sui dati precedentemente osservati. Gli alleli rari
potrebbero cadere al di fuori di un dato intervallo dell’entità del marker e potrebbe essere necessario regolare di
conseguenza il set bin.
5.
Si consiglia di attivare l’opzione"Single click editing" (Modifica con singolo clic) nella finestra del grafico.
A tal fine selezionare "Alleles/set click editing" (Alleli/imposta modifica con clic) e assicurarsi che questa
opzione sia selezionata.
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Figura 9: Finestra dei grafici dei campioni in cui sono visualizzati i dati dei tracciati etichettati e la relativa tabella
dei genotipi
Modifica manuale dei profili
AVVERTENZA!
GeneMapper assegnerà le etichette solo a non più di due picchi per marker. Pertanto, potrebbe essere necessario
modificare i profili manualmente, ossia quando occorre assegnare le etichette ai terzi picchi (se presenti) o quando
occorre rimuovere le etichette dai picchi "stutter".
Per aggiungere l’etichetta a un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul picco non etichettato. Viene
visualizzata l’opzione che consente di aggiungere un commento ad un allele. Fare clic su "OK". Il picco viene ora
etichettato con le informazioni relative alle dimensioni, espresse in paia di basi, e all’area del picco. Il picco appena
etichettato verrà incorporato automaticamente nella tabella.
Per rimuovere l’etichetta da un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull’etichetta del picco. Viene
visualizzata l’opzione che consente di eliminare il commento relativo ad un allele. Fare clic su "OK". L’etichetta del
picco viene ora rimossa. I dati eliminati relativi al picco verranno automaticamente rimossi dalla tabella.
Copia dei dati tabellari
1.
Evidenziare tutte le righe con la tabella in basso nella finestra dei grafici.
2.
Copiare le righe selezionate premendo i tasti "CTRL+C".
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Modello di rapporto QST*R-21 Euplex
Il modello di rapporto associato a QST*R-21 Euplex può essere utilizzato per determinare i rapporti dei picchi per
un marker e assistere nell'analisi dei dati. Il modello di rapporto specifico per QST*R-21 è disponibile sul sito web:
http://www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/.
1.
Aprire il file Modello di rapporto QST*R-21 Euplex (QSTR-21 Euplex Report Template.xlsm).
2.
Se il modello di rapporto visualizza un avvertimento che indica che i macro sono stati disattivati, fare clic
su ‘Enable Content’ (Attivare contenuto) per attivare i macro (Figure 10).
Figura 10: Attivazione della funzione dei macro nel modello di rapporto QST*R-21 Euplex
3.
Se viene visualizzato un avvertimento di protezione (come illustrato in Figura 11), fare clic su ‘Yes’ (Si)
per procedere.
Figura 11: Consenso all'accesso di sicurezza
4.
Incollare i dati copiati dalla tabella di dati GeneMapper (vedere sopra, ‘Copying Data Table’ - Copiatura
tabella dati) usando ‘Ctrl+V’ nella cella in alto a sinistra nell'area con contorno (vedere Figura 12).
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Figura 12: Importazione di dati grezzi GeneMapper nel modello di rapporto QST*R-21 Euplex.
5.
I rapporti calcolati per ciascun marker saranno ora visualizzati nella tabella di dati a sinistra. La tabella di
dati può essere stampata o salvata come nuovo file per ciascun campione specifico.
6.
Per analizzare i campioni successivi è importante che tutti i dati siano completamente cancellati dal
modello di rapporto. A tale scopo, fare clic sul tasto ‘CLEAR DATA’ (Cancella dati) ubicato sotto la
tabella dei dati grezzi all'interno del modello di rapporto QST*R-21 Euplex. A questo punto è possibile
importare nuovi dati di campione seguendo la procedura descritta sopra.
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Valutazione del rapporto
1.
La trisomia è determinata dalle seguenti condizioni:
a
Due picchi di altezza diversa. Tale condizione è dovuta al fatto che uno dei picchi
rappresenta due alleli comuni a entrambi i genitori. In questo caso il rapporto tra i due picchi
sarà classificato come 2:1 o 1:2. Dove A1/A2 fornirà un risultato nella regione compresa tra 1,8 e
2,4 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più grande rispetto al picco che
rappresenta l’allele più lungo, oppure dove A1/A2 fornirà un risultato nella regione compresa tra
0,45 e 0,65 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più piccola rispetto al picco
che rappresenta l’allele più lungo.
In entrambi i casi, nella colonna "Warning" (Avvertimento) verrà visualizzata la scritta "Ratio" (Rapporto).
b
Presenza di tre picchi di altezza comparabile. Il rapporto dei picchi verrà classificato come 1:1:1
e i rispettivi valori rientreranno nell'intervallo 0,8 – 1,4 (sebbene, per gli alleli che si discostano tra
loro di più di 24 bp, si considera accettabile un rapporto con valore fino a 1,5).
In questo caso, nella colonna "Warning" (Avvertimento) verrà visualizzata la scritta "3 Alleles" (3 alleli).
2.
Per poter interpretare un risultato come anomalo (ossia, presenza di una trisomia), è necessario
individuare almeno due marker informativi coerenti con il genotipo a tre alleli mentre tutti gli altri marker
possono risultare non informativi. Non è consigliabile interpretare un risultato come anomalo basandosi
sulle informazioni ottenute da un unico marker.
3.
Per interpretare un risultato come normale, è necessario individuare almeno due marker informativi
coerenti con un genotipo diallelico mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Un
risultato normale indica il normale complemento di due per i cromosomi analizzati.
4.
I rapporti dell’area dei picchi che rientrano negli intervalli normale e anomalo vengono classificati come
inconcludenti. I risultati inconcludenti possono essere risolti utilizzando i kit per singoli cromosomi.
5.
In assenza di qualunque dato sui picchi relativo a un marker, nella colonna Warning (Avvertimento)
verrà visualizzata la scritta "Absent" (Assente). Questo avvertimento verrà visualizzato regolarmente in
assenza dei marker del cromosoma Y.
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Guida all'analisi GeneMarker
Nota - I seguenti screenshot sono stati presi da GeneMarker v2.6.3.
Aggiunta di file dei campioni a GeneMarker
Aprire il file del programma GeneMarker e selezionare "Open Data" (Apri dati) quando richiesto. Viene visualizzata
la finestra Open Data Files (Apri file di dati).
Fare clic sul pulsante "Add" (Aggiungi). Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (Apri). Cercare la directory
contenente i file di dati grezzi.
1.
Selezionare tutti i file premendo i tasti CTRL+A o utilizzare i tasti CTRL e/o MAIUSC per selezionare
singoli campioni.
2.
Fare clic sul pulsante "Open" (Apri) nella finestra di dialogo Open (Apri).
I file selezionati verranno visualizzati nel campo Data File List (Elenco file di dati) (Figura 13).
Figura 13: Campioni aggiunti all’elenco dei file di dati
Fare clic sul pulsante “OK” nella finestra Open Data Files (Apri file di dati) e i campioni saranno caricati in
GeneMarker. Il software apre quindi automaticamente la finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi) (Figura
14).
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Figura 14: Finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi)
Importazione delle impostazioni dei pannelli QST*R-21 Euplex per GeneMarker
È necessario importare le impostazioni dei pannelli QST*R per GeneMapper. Questo processo viene controllato
tramite l’interfaccia "Panel Editor" (Editor pannelli).
Le impostazioni dei pannelli QST*R-21 Euplex di GeneMarker sono disponibili sul sito web di Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/.
1.
Aprire "Panel Editor" (Editor pannelli) dal menu a discesa "Tools" (Strumenti).
Figura 15: Selezione di Panel Editor (Editor pannelli)
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2.
Selezionare "Import Panels" (Importa pannelli) dal menu a discesa "File".
Figura 16: Importazione dei pannelli
3.
Cercare, ad esempio, il pannello QSTR-21 Euplex.xml e importarlo.
4.
• Ripetere il processo come indicato per gli altri rispettivi file dei pannelli.
Elaborazione dei dati
Dopo il caricamento in GeneMarker, i file di dati grezzi sono pronti per essere elaborati. La fase di elaborazione
include l’applicazione di un size standard, l’applicazione di filtri ai picchi che generano interferenze e, volendo, il
confronto con un pannello di alleli noto.
GeneMarker combina tutte queste fasi in un unico, semplice strumento denominato "Run Wizard" (Procedura
guidata di analisi) (Figura 17). Per accedere alla procedura guidata di analisi basta fare clic sull’icona "Run Project"
(Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale.
Run Wizard (procedura guidata di analisi) – Creazione di un modello di analisi
Per poter analizzare i dati QST*R-21 Euplex, è necessario creare un modello di analisi al primo utilizzo del software.
Tale operazione viene eseguita tramite la Run Wizard (Procedura guidata di analisi).
1.
Per accedere alla Run Wizard (Procedura guidata di analisi) basta fare clic sull’icona "Run Project"
(Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale.
2.
Assegnare un nome al modello, ad es. QSTR-21 Euplex.
3.
Selezionare il Panel (pannello), il Size Standard, lo Standard Colour (colore dello standard) e il Analysis
Type (tipo di analisi) nei rispettivi campi come illustrato nella Figura 17.
4.
Fare clic su "Save" (Salva) per memorizzare il modello da utilizzare nelle analisi successive.
5.
Fare clic su "Next" (Avanti) per continuare.
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Figura 17: Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Finestra Template Selection (selezione del modello)
Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Data Process (Elaborazione dati)
La finestra Data Process (Elaborazione dati) della Run Wizard (Procedura guidata di analisi) consente di
selezionare i parametri dei filtri da applicare ai picchi.
1.
Selezionare le impostazioni di analisi appropriate nella finestra Data Process (Elaborazione dati) come
illustrato nella figura 18.
2.
Fare clic su "Next" (Avanti) per continuare.
Nota - L’impostazione dell’intervallo di analisi nella finestra di analisi dei dati grezzi varia in base al polimero
utilizzato durante la raccolta dei dati. L’operatore deve selezionare un valore di partenza del punto di dati che
includa il picco del size standard di 75 bp.
Figura 18: Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Finestra Data Process (Elaborazione dati)
Nota: Per 3500 dati, aumentare l’intensità minima a 150.
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Run Wizard (procedura guidata di analisi) – Additional Settings (Altre impostazioni)
Quando si esegue l’analisi QST*R, non sono richieste altre impostazioni (figura 19).
1.
Fare clic su "OK" per continuare.
Figura 19: Run Wizard (procedura guidata di analisi) – Additional Settings (Altre impostazioni)
Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
Dopo aver fatto clic su "OK" nella finestra Run Wizard Additional Settings (Procedura guidata di analisi - Altre
impostazioni), viene visualizzata la finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) (Figura 20). I dati grezzi
vengono elaborati e calibrati, vengono applicati i parametri dei filtri, quindi viene applicato il pannello QST*R
selezionato.
1.
Al termine dell’analisi, fare clic su "OK" nella finestra Data Processing (Elaborazione dei dati).
Figura 20: Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
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Finestra di analisi principale
La finestra di analisi principale (Figura 21) di GeneMarker presenta un formato facile da usare. Questo formato
include:

elenco dei file dei campioni - visualizzato a sinistra nella finestra;

immagine gel sintetica - visualizzata nella parte superiore della finestra;

elettroferogrammi dei dati - sotto l’immagine gel;

tabella dei rapporti - visualizzata sul lato destro della finestra.
In questa finestra è importante verificare che tutti i picchi appropriati in ciascun profilo siano stati assegnati
correttamente.
1.
Fare doppio clic su ciascun campione in sequenza nell’elenco dei file dei campioni sul lato sinistro della
schermata. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi picco in questione e scegliere tra le
opzioni nella finestra di dialogo, ad esempio modificare o eliminare alleli, confermare o meno come
pertinente.
2.
Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa "Applications"
(Applicazioni) nella parte superiore della schermata. Selezionare "Trisomy Analysis" (Analisi trisomia).
Verrà visualizzata la finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) (Figura 22).
Figura 21: Finestra di analisi principale
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Figura 22: Finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia)
Trisomy Analysis Settings (impostazioni per l’analisi della trisomia)
Nella finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) sono disponibili due schede:
1.
Scheda Analysis (Analisi)
2.
Scheda Statistics Plot (Grafico statistico)
Scheda Analysis (Analisi)
La scheda Analysis (Analisi) fornisce le opzioni di impostazione soglia per l’analisi della trisomia. Assicurarsi che
nella finestra di analisi sia selezionato "BPG" e che siano visualizzate le seguenti impostazioni:

Peak Height (Altezza picco) 50: altezza minima di 50 per l’assegnazione dei picchi (150 se si usano 3500
dati.)

Height Ratio (Rapporto altezze) 30%: massima percentuale del picco principale che il secondo picco deve
raggiungere affinché possano essere identificati due alleli.

Quantification by Peak Area (Quantificazione per Area picco).

Casella di controllo Shorter Length/Longer Length (Lunghezza maggiore/minore) selezionata.

Valori soglia del Trisomy Ratio (rapporto della trisomia) compresi tra 0,80 e 1,40.

Casella di controllo Apply Linear Correction (Applica correzione lineare) deselezionata.

Fare clic su "OK".
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Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia)
La finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia) (Figura 23) permette all’operatore di esaminare i dati dei campioni
QST*R e di visualizzare il rapporto dei picchi per ciascun marker, nonché di accedere al rapporto GeneMarker.
Nella finestra vengono visualizzate numerose funzioni che assistono l’operatore nell’analisi dei dati. Esse sono:

Elenco dei campioni.

Elettroferogramma.

Grafico dei rapporti.

Tabella dei rapporti.
Figura 23: Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia)
Per informazioni più dettagliate sulle funzioni di analisi della trisomia e sul loro utilizzo, consultare il GeneMarker
Manual (Manuale GeneMarker).
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Rapporto GeneMarker
GeneMarker include un modello di rapporto compatibile con i kit Elucigene QST*R. Per accedere al rapporto fare
clic sull’icona "Print" (Stampa) che si trova in alto a sinistra nella barra degli strumenti della finestra Trisomy
Analysis (Analisi trisomia).
Verrà visualizzata la finestra delle Trisomy Print Settings (impostazioni di stampa della trisomia) (Figura 24).
Finestra delle Trisomy Print Settings (impostazioni di stampa della trisomia)
Nella finestra delle impostazioni di stampa della trisomia sono elencate le opzioni per l’inclusione e la
visualizzazione dei dati dei campioni nel rapporto GeneMarker.
Selezionare le opzioni come illustrato nella Figura 24. Assicurarsi che le impostazioni relative alla casella "Custom
Size Range" (Mostra intervallo dimensioni personalizzate) siano comprese tra 98 bp (Start [Inizio]) e 510 bp (End
[Fine]).
Figura 24: Finestra delle Trisomy Print Settings (impostazioni di stampa della trisomia)
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Elucigene® QST*R-21 Euplex Istruzioni per l'uso del test
Anteprima del rapporto GeneMarker
Fare clic su "Preview" (Anteprima) per visualizzare il rapporto GeneMarker (Figura 25). Da questa finestra
l’operatore può controllare e stampare tutti i dati relativi al picco del campione attraverso tutti i marker, ottenendo
un semplice rapporto del campione di una o due pagine.
Figura 25: Rapporto GeneMarker
Il rapporto GeneMarker include le seguenti funzioni:

Titolo del rapporto: contiene informazioni sull’analisi, sul progetto, sul campione e sui parametri.

Casella delle firme: data e spazio per le iniziali dei revisori del rapporto.

Elettroferogramma: simile a quello della finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia); in esso vengono
visualizzati tutti i coloranti del tracciato del campione.

Tabella dei rapporti: vengono visualizzati i valori relativi ai picchi e ai marker selezionati per il campione
corrente. I riferimenti alla trisomia sono evidenziati in grigio. La tabella contiene anche una colonna di
controllo per le iniziali dei revisori.

Grafico dei rapporti corretto: contiene i punti del grafico dell’intero set di dati per tutti i marker presenti nel
colorante. Le forme dei simboli rappresentano i diversi marker e possono essere decifrate dalla riga
"Symbol" (Simbolo) nella "Report Table" (Tabella dei rapporti). I simboli con sfondo giallo rappresentano
i punti di dati relativi al campione corrente. I simboli con contorno rosso rappresentano i riferimenti alla
trisomia.
Nota: Il grafico dei rapporti corretto appare in una seconda pagina per ogni campione solo quando nella finestra
delle impostazioni di Trisomy Print Report Settings (stampa del rapporto della trisomia) è selezionato nella casella
Ratio Plot (Grafico dei rapporti).
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APPENDICE 1: Etichette del colorante
I marker sono contrassegnati come segue:
Vedere l’Appendice 2 per ulteriori dettagli sui marker STR inclusi gli intervalli delle dimensioni.
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APPENDICE 2: - Tabella della posizione del marker, eterozigosità osservata, intervallo delle
dimensioni alleliche
Nota: Il colorante NED utilizzato nei kit viene identificato a livello spettrale come colorante giallo.
Convenzionalmente per chiarezza viene visualizzato in nero.
Le eterozigosità osservate* si basano sul numero di alleli osservati con il pannello di convalida di
Elucigene Diagnostics. Questi numeri potrebbero quindi differire dai dati pubblicati e potrebbero anche
variare in base alla popolazione analizzata.
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APPENDICE 3: Profilo GeneMapper
Profilo normale GeneMapper per un individuo di sesso maschile che mostra le relative posizioni dei
marker rilevati da QST*R-21 Euplex
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Limiti della procedura
Questo test è concepito per l’individuazione di specifiche trisomie cromosomiche e aneuploidie dei cromosomi
sessuali come riportato nelle Instructions for Use (Istruzioni per l’uso). Non è in grado di individuare i
riarrangiamenti strutturali che coinvolgono i cromosomi analizzati né le anomalie in ogni altro cromosoma. Il
mosaicismo potrebbe non essere individuato nei cromosomi analizzati. Un risultato QST*R-21 Euplex può essere
applicato direttamente solo al tessuto analizzato e potrebbe non rappresentare il cariotipo fetale. La
contaminazione da parte di cellule materne (Maternal cell contamination, MCC) e il mosaicismo confinato alla
placenta (Confined placental mosaicism, CPM) potrebbero dar luogo a discrepanze tra i risultati QST*R-21 Euplex
e i risultati del cariotipo.
Nota - Le eterozigosità dei marker utilizzati sono derivate da un set casuale di campioni inviati per le analisi
routinarie ottenuti da una popolazione in prevalenza caucasica dell’Europa settentrionale. Tutti i calcoli in cui
vengono utilizzate queste eterozigosità si applicano strettamente alla popolazione da cui sono stati prelevati i
campioni. Si può condurre un piccolo studio in cui si utilizzano i campioni derivati dalla popolazione locale come
parte di uno studio di convalida per stabilire le eterozigosità nella popolazione da analizzare. Si ritiene che le
variazioni nella popolazione non alterino in modo significativo il grado di informazione complessivo del test.
Dichiarazione di non responsabilità
I risultati di questo test diagnostico devono essere interpretati congiuntamente agli altri dati clinici e di laboratorio
a disposizione del medico.
Questi reagenti Elucigene vengono forniti per l’esecuzione di test diagnostici in vitro.
Ulteriori dettagli sui prodotti Elucigene QST*R sono disponibili sul sito:
http://www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/.
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paralogous sequence quantification. Journal of Medical Genetics 2004 41: 908-915.
ELUCIGENE e QST*R sono marchi commerciali di Delta Diagnostics (UK) Ltd.
GENEMARKER è un marchio commerciale di SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, GENESCAN, VIC, PET,
NED, LIZ, POP-7 e HI-DI sono marchi commerciali di Life Technologies Corporation.
Nota per l’acquirente: Licenza limitata
Questo prodotto è venduto conformemente a un contratto stipulato con Life Technologies Corporation. L'acquisto
del prodotto trasmette all'acquirente il diritto non trasferibile di utilizzare esclusivamente la quantità acquistata del
prodotto e i suoi componenti per uso diagnostico in vitro, unicamente per l'indicazione descritta nelle istruzioni per
l'uso accompagnatorie. Per informazioni relative all'ottenimento di diritti aggiuntivi per utilizzare il prodotto o i suoi
componenti, contattare [email protected].
Copyright  2015 Delta Diagnostics (UK) Ltd.
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