1 2 3 - Scuola di Specializzazione in Ispezione degli Alimenti di

Struttura
Settore
U.O.
Responsabile
Scientifico
Subunità
Carne suina
Università
Bologna
Russo
N°6: Ajmone-Marsan, Matassino,
Pagnacco, Pilla,Stefanon, Valentini
Carne bovina e altre specie
Università
Tuscia
Valentini
N°8: Ajmone-Marsan, Di Stasio,
Greppi, Nardone,Panella, Pilla,
Roncada, Williams
Latte bovino
Università
Piacenza
AjmoneMarsan
N°5: Russo, Pariset, Bagnato, Feligini,
Caroli
Latte :
bufala,capra,asina,pecora
Università
Napoli
Ramunno
N°6: Chianese, Pilla, Rando, Carta,
Crepaldi, Feligini
Cavalli
Università
Perugia
Silvestrelli
N°1: Renieri
Tracciabilità
ConSDABI
Matassino
N°7: Ajmone-Marsan, Blasi, Bongioni,
Cianci, Di Luccia, Fontanesi, Gandini
Riproduzione, resistenza a
malattie e stress
CRSA
Williams
N°6: Poli, Lacetera, Bernabucci,
Ferretti, Piearagostini, Iannelli
Modelli di trasferimento
genetica molecolare negli
schemi di selezione
Università di
Sassari
Macciotta
N°3: Gandini, Carnier, Pieramati
Formazione per le strutture di
miglioramento
Università
Milano
Pagnacco
Componenti dei prodotti
zootecnici funzionali per la
salute umana
Università
Tuscia
Nardone
N°1: Caroli
Coordinatore: Prof. Sandro Nardone
Unità di ricerca – latte
asina, bufala, pecora e capra
Responsabile scientifico:
Prof. Luigi Ramunno
Obiettivo generale della Unità di Ricerca
Analisi della variabilità di alcuni geni che influenzano le
caratteristiche quali-quantitative del latte e verificare se tale
variabilità è associata o responsabile
di differenze
nell’espressione del carattere
MIGLIORAMENTO GENETICO
Il genotipo di un individuo è dato dal suo corredo genetico,
è ciò che è "scritto" nel DNA contenuto nel nucleo di tutte
le sue cellule.
Il fenotipo è l'insieme dei caratteri che l'individuo
manifesta: dipende dal suo genotipo, dalle interazioni fra
geni e anche da fattori esterni; dunque può variare.
CARATTERI QUALITATIVI
•Base genetica semplice
•Sono scarsamente influenzati dall’ambiente
P= G
•La popolazione non si distribuisce in modo
continuo
CARATTERE QUANTITATIVO
Base genetica complessa
Influenzati dall’ambiente
La popolazione si distribuisce in modo continuo
Il fenotipo non coincide con il genotipo: P = G + A
METODI UTILIZZATI PER IL
MIGLIORAMENTO GENETICO DEGLI ANIMALI
GENETICA QUANTITATIVA
(SELEZIONE FAMILIARE, INTRAFAMILIARE,
INDIVIDUALE)
GENETICA MOLECOLARE
APPROCCIO INDIRETTO: Marcatore anonimo associato al
carattere (MAS)
APPROCCIO DIRETTO: Gene Maggiore e Gene Candidato
Nel latte dei ruminanti sono presenti 6
principali proteine
a-lattoalbumina (a-La)
cromosoma 5
a-La
b-lattoglobulina (b-Lg)
cromosoma 11
b-Lg
k-Cn
4 caseine (as1, b, as2 e k)
b-Cn
codificate da 4 geni autosomici associati
as1-Cn
(CSN1S1, CSN2, CSN1S2 e CSN3)
as2-Cn
cromosoma 6
Importanza tecnologica delle caseine
La qualità del latte, sotto il profilo tecnologico-caseario, è
intesa come la capacità di dare un buon formaggio, con un’alta
resa alla trasformazione
Casein micelle
αs1, β, αs2 caseins
K casein
Idrofobic
center
b
b
Chymosin
k
a
a
k
Submicelles
para k casein
b
b
k =O…H-O-Ca-O- k
a
Cagliata
a
L’importanza del contenuto in
caseine nel determinare la resa
quantitativa del latte destinato alla
caseificazione è nota da tempo
IL CROMOSOMA 6
I GENI DELLE QUATTRO CASEINE SONO
LOCALIZZATI SUL CROMOSOMA 6
~12 kb
b
as1
0
~70 kb
50
~95 kb
as2
100
150
k
200
250 kb
Mappa fisica dei loci delle caseine nella
specie caprina, con relativa posizione e
orientamento dei singoli geni.
I geni codificanti per le 6 principali proteine del latte
= region encoding signal peptide
= 3’ untraslated region
= coding region
= 5’ untraslated region
Gene codificante:
~ 16.7 kb
3’
5’
1
3
2
4 5 6 78
9 1011 12 13 14 15 16
~ 9 kb
17
18
19 exons
5’
2
1
3 4 5 6
8
7
~ 18.5 kb
3’
exons
9
5’
1
2
3 45 6
7 8
910 11 12
13
1415
as1 casein
16 17
b casein
3’
as2 casein
18 exons
~13 kb
3’
5’
1
3
2
k casein
5 exons
4
~ 4.5 kb
5’
3’
1
2
3
4
6
7
exons
b-lg
~ 2 kb5
3’
5’
1
2
3
4
exons
a-lg
Livello di sintesi alto
 3,5 g/l per allele
Livello di sintesi medio
1,1 g/l per allele
- 68%
Livello di sintesi basso
0,45 g/l per allele
- 88%
Livello di sintesi nullo
0,0 g/l per allele
- 100%
Differenze individuali nel contenuto di caseina as1 nel latte di capra
Normale livello di sintesi di caseina as1 (9Alleli)
as1
nt mutation
B1
aa mutation
Wild type
A
GAGCAG (ex 10)
Glu77Gln
B2
CTCCCC (ex 4)
Leu16Pro
B3
AGAAAA(ex 12)
Arg100Lys
B4
ACTGCT(ex 17)
Thr195Ala
C
CACATC(ex 3)
His8Ile
H
AGGAAG (ex 2)
Arg1Lys (N terminal)
L
CGTCAT (ex 11)
Arg90His
M
TCGTTG (ex 9)
Ser66Leu
Gli alleli associati ad un normale contenuto di caseina as1 nel
latte di capra si originano per singole sostituzioni nucleotidiche
mRNA identificati dallo screening di 208 cloni dell’allele CSN1S1 A
mRNA
Delezione
Regione
deleta
Frequenze
n° aa
allele
individuati
possibili
1085bp
----
----
52.50
199
1082 bp
3 bp
1a tripletta esone 11
35.00
198
1061 bp
24 bp
esone 13
5.77
191
1061 bp
24 bp
esone 16
5.29
191
903 bp
206 bp
esone 16, 17 e 1a
tripletta esone 11
1.44
153
mRNA completo
1
1
2
2
3
3
4
4
5 67 8
5 67 8
9 10 11 12 13 14 15 16
9 10 11 12 13 14 15 16
17
17
18
18
19
19
mRNA senzala prima tripletta
dell’esone 11 (CAGGln78)
mRNA senza l’esone 13
1
2
3
4
5 67 8
9 10 11 12 13 14 15 16
17
18
19
mRNA senza l’esone 16
1
2
3
4
5 67 8
9 10 11 12 13 14 15 16
17
18
19
ug a ug a
1
2
3
4
5 67 8
9 10 11 12 13 14 15 16
17
18
19
mRNA senza l’esone 16, 17 e la
prima tripletta dell’esone 11
(CAGGln78)
Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 E di capra
Livello intermedio di caseina as1 (1,1 g/l per allele -68%)
5’
3’
53
63
33
39
24 24 24 24
33 2454
42 24
42 27 24
154
45
385
exons size
Insertion 457 bp (LINE)
ctttttttttttttttttttttttcttactgaatgacttttttatttttatttttattttttatttatttttttttatttt
ttttttttaatttttaatttttatttttaaattttaaaatctttaattcttacatgcgttcccaaacatgaacccccctcc
cacctccctccccacaacatctctctgggtcatccccatgcaccagccccaagcaagctgcaccctacgtcagacatggac
tggcgattcaattcttacatgacagtatacatgttataattcccattctcccaaatcatcccaccctctccctctccctct
gagtccaaaagtctggtatacacatctgtgtctttttccctgtcttgcatacagggtcgtcattgccatcttcctaaattc
catatatatgtgttagtatactgtattggtgtttttctttctggcttacttcact
Pattern elettroforeico in SDSPAGE di campioni individuali di
latte
= region encoding signal peptide
= coding region
= 3’ untraslated region
= 5’ untraslated region
as1-Cn
CSN1S1 B4/B4
E/E
Una possibile spiegazione della ridotta sintesi associata all’allele CSN1S1 E
caprino è che il prodotto di trascrizione di tali alleli mostra un poly (T)
nella regione 3’ untraslated creando una instabilità dell’mRNA. Tale
struttura è responsabile di una rapida degradazione del messaggero.
CSNIS1 E = -262.7 kcal/mol
CSNIS1 A = -125.7 kcal/mol
Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 F
Basso livello di sintesi di casina as1
(0,45 g/l per allele, -88%)
insertion 11 bp
insertion 3 bp
Stop
5’
3’
1
2
3
4
5
6 7 8
9
10 11
12
13
14 15 16
17
18
19
C nt 23
Allele CSNIS1 F
CAAATGAAAGCTGGAAGCAGTT—GTCAAGTGAG
C nt 23
= regione codificante peptite leader
= regione codificante
= regione 3’ UT
= regione 5’ UT
as1-CnF
CSN1S1 A/A
Delezione della Citosina al 23° nt del 9° esone
F/F
mRNA trascritti dall’allele CSN1S1 F di capra
Ramunno, et al., (2005). Comparative analysis of gene sequence of goat CSN1S1 F and N alleles and characterization of CSN1S1 transcript
variants in mammary gland. Gene, 345 (2), 289-299.
Rappresentazione schematica
dell’allele CSN1S1 F di capra
CSNIS1 F mRNA
5’
53
63
del
principale
trascritto
33 24 54
33
39
24 24 24 24
42 24
42
27 24
175
45
385
18
19
9 1011
1
2
3
4
5 6 7 8
12 13 14 15 16 17
= regione codificante peptite leader
= regione codificante
= regione 3’ UT
= regione 5’ UT
3’
Pattern elettroforetico in SDSPAGE di campioni individuali di
latte
La popolazione di mRNA più trascritta (60%) si
caratterizza per lo skipping alternativo degli esoni 9, 10 e
11 ed è responsabile, di conseguenza, della sintesi di una
caseina as1 priva di 37 aa.
as1-CnF
Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 N
stop
stop
5’
3’
1
2
3
4
5
6 7 8
9
10 11
12
13
14 15 16
17
18
19
exons
CSNIS1 N allele
CAAATGAAAGCTGGAAGCAGTT—GTCAAGTGAG
C nt 23
. = regione 5’UT;
= regione codificante il peptide leader;
= regione codificante;
= regione 3’ UT
as1-CnF
L’allele
CSN1S1
N
si
caratterizza,
analogalmente all’allele CSN1S1 F, per la
delezione della Citosina al 23° nt del 9° esone.
CSN1S1
~0.9 g/l
FF
0.0 g/l
NN
L’analisi per mezzo di RealTime PCR mostra che la quantità di
mRNA trascritta dall’allele CSN1S1 N è circa il 33% di quella
trascritta dall’allele CSN1S1 F
F allele
N allele
Confronto mRNAs CSN1S1 F e N
Il confronto dei trascritti prodotti dagli alleli N e F mostra una
notevole variabilità di splicing alternativi
cDNA
detected
Deleted sequence(s
974 bp
Exons 9, 10, 11
1052 bp
Exon 9
Estimated
percentage
Estimated
percentage
FF
NN
60%
21.2%
12%
20.6%
12%
24.5%
PTC
6%
6%
12.7%
8%
-
17562 – 17579
19512
17721
-
4.7%
PTC
Estimated
MW (Da)
18574 - 18591
21626 – 21641
21498 – 21513
1049 bp
Exon 9, 1st triplet of exon 11
1084 bp
23rd nt of exon 9 (C)
1081 bp
23rd nt of exon 9 (C); 1st codon of exon 11
950 bp
1000 bp
950 bp
901 bp
Exons 9, 10, 11 and 16
23rd nt exon 9 (C), 5 nt of exon 9, exon 10, 11
Exons 9, 10, 11 and 13
23rd nt of exon 9 (C), exons 16 and 17
989 bp
23rd nt of exon 9 (C), exons 16, 17 and 1st triplet of exon 11
977 bp
23rd nt of exon 9 (C), 5 nt of exon 9,
exons 10, 11 e 16
-
3.2%
18499
1079 bp
1025 bp
23rd nt of exon 9 (C), 5 nt of exon 9
1st triplet of exon 11, exons 9 and 16
2%
-
3.1%
2%
22547 – 22562
20501
1028 bp
Exons 9 and 13
1%
-
20772
884 bp
Exons 9, 10, 11, 12, 13 and 16
1%
-
14985
Per l’allele F si osserva una maggiore percentuale di trascritti
caratterizzati dall’outsplicing degli esoni 9, 10 e11
Omologia tra la sequenza del promotore e primo esone degli alleli CSN1S1 A, F e N di capra
YY1
…gttcaaaaaactaagttcacagcatactgccccatcacttcatggaaaatagagggggagggggagaaggtggaagtagtgttagattttattttcttggactcaaaatcactgcagacattgattatagccatgaa
t
c
c
...--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------a
c
t
...--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC
attaaatgatgcttcctccttgaaaagaaagttttgacaaacctagacagcatattaaaaagcagtgacatcactttactgataagggtctttatagtcaaagctacggtttttccagtagccatgtacagaagtgagaattg
t
a
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g
c
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------c
t
YY1
tactatgaagaaggatgagtgtcaaaggactgatattttcaaattgtggtggatgcactcctttgcgtgcgtgctgtcatttcagtcatgtcctactctttgcaacccagtggaccgtcatctgccaagttcctctgtccatgg
ca
t
g
a
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g
tg
c
a
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1
YY1/RC
gattcttcaggcaagaacaatggagtgggttgccatttcctccaccaggggatcttcccaacccagatattgaacctgcaactctaatgtttcctgcatgggcaggcaggttctttaccactagtgccacctggaaagtcc
c
c
g
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g
a
x
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AP-1
GATA
agatacacttctgggaaagacaaaagtcgagtattacaatgcagctaggatttttgttctcagctccttgaataaattagagtgaatagaaaactctagtatcttgttgaaattgatatgaaacagacagtaaggaagataat
g
t
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AP-1 a
c
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC
PMF
atctaaagaaaacttcaatatgggaaattatagtcttttctatcttcaaagtggagagcctgaacagttttgaaatttcttttaatacaaaataatgttcctgtcatacaactgtgaatacactgaaaatatcactatagatatttta
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1
aagtatataatatgattcctttcttataaacaaggagttgcaatcaacaagtttttaaagccctcacttgtatagatattttatttagcacataatattttgtacaatgccattaatatattgtacaatgtacaatgccagttaattctag
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC
YY1
YY1
AP-1
OCT-1
gagtacaattaagaattggagggataggaatttttttcttttacttgtttactttaaaagatggaaaatcagagttatggtttattttttgcaatatttaaaaattgtaattcttgaataattattaattttaattaaataatctgtaatgaga
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC
attctcctaccaatgcaggagacctgagtttgatccctggatagggaaaataccctgcagaaggaaatggcaacccactccaatattattatttgggaaatcccatggacagaggagactggcaggctaaagtccatgg
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC
ggtcacaaagaactggacacaacttagtgactaaacaacaacaatttacaccagaatgaatgaactagtcaccgcaactagtacacccaaaataaacaaaaattagcttggtgatataattaaaatgccaccaaagtttat
c g
g
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g
t a
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1
YY1
YY1/RC
YY1/RC
YY1/RC OCT-1
acgataattatattttctttttgcaagaaaaagattagaccacatatactgtaagttatttcacaaggtaaataattaaaataaatattatggattaactcagttttaagaggtgaaataaataatgaattcttctcatggtcttgtacg
c
g
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------t
a
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ttaataaaaattgaaaatttttgaagaccctgttttgtcccaaggatttcctttacaggtattgaatttttcaaaagttacaaaggaaattttattgatataaatgcatgttctcataataaccataaatctagggttttaatgggtttttt
c
a
g
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g
t
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------a
YY1
AP-1
MILK BOX
PR/CR
MPBF
ttttttttggatgttaatttagaacaatgccattccatttcctatataatgaatcacttctttgttgtaaactctcctcagaatttcttgggagaggaactgaacagaacatcgatttcctacgtgagagaattcttagaatttaaataa
c
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------t
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------SV40 core enhancer OCT-1 YY1
TATA box
PMF
acctattggttaaactgaaaccacaaaattagcattttactaatcagtaggtttaaatagctcggaagcaaaagtctgccatcaccttgatcatcaacccagcttgctgcttcttcccagtcttgggttcaaggt CSN1S1A
g
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CSN1S1N
a
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CSN1S1F
Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 01
Livello di sintesi nullo di caseina as1
~ 9.0 kb
~ 8.5 kb
5’
1
2
3
4
5 6 7 8
9
10 11
12
3’
13
14 15 16
17
18
19
exons
= regione codificante il peptide leader
= regione codificante
= regione 3’ UT
= regione 5’ UT
Pattern elettroforetico in SDS-PAGE
di campioni individuali di latte
L’allele 01 si caratterizza per
la delezione di un tratto di
DNA di circa 8,5 kb includente
gli ultimi 7 esoni del gene
as1
B4/B4
01/01
Effetto sul diametro delle micelle
È stato osservato un significativo effetto effetto sul diametro delle
micelle
Maggiore resa
in formaggio
Alto livello di
caseina as1
nel latte
Migliori proprietà
coaugulanti
Ridotto
livello di
caseina as1
nel latte
Peggiori proprietà
coaugulanti
Alto (7,0 g/l):
21,9 %
Minore resa
in formaggio
Basso (0,9 g/l):
18,3 %
Medio (1,1,0 g/l):
19,1 %
Latte con
basso
contenuto
caseina as1
Latte con
alto
contenuto
caseina as1
Formaggio con gusto più
tipicamente caprino
Formaggio con gusto meno
tipicamente caprino
Valori medi e confronto statistico delle caratteristiche fisico-chimiche e
tecnologiche di latte individuale ai genotipi as1-CnAA, as1-CnEE, as1-CnFF
Rappresentazione schematica del gene CSN2
Comosoma 6
~12 kb
CSN1S1
0
~70 kb
CSN3
CSN1S2
CSN2
50
~95 kb
100
150
200
250 kb
CSN2 Gene
~ 9.0 kb
3’
9
8
323
42
. = regione 5’UT;
7
492
6
5 4
3
42 24 27 27
2
1
63
48
5’
exon size (bp)
= regione codificante il peptide leader;
= regione codificante;
= regione 3’ UT
Livello di sintesi alto
 5 g/l per allele
Livello di sintesi
apparentemente nullo
0,0 g/l per allele
- 100%
Polimorfismo della caseina b
Pattern elettroforetico in SDS-PAGE di campioni individuali di latte
a-La 
b-Lg 
k-Cn 
b-Cn 
as1-Cn 
as2-Cn 
b caseina contenuto
10,0 g/l
5,0 g/l
0,0 g/l
Differenze individuali nel contenuto di caseina b nel latte di capra
Normale livello di sintesi
b
nt mutazione
A
aa mutazione
Wild type
A1
CT (ex 9)
3’ UTR
C
GCAGTA (ex 7)
Ala177Val
D
Sconosciuta
Val207Asn
E
TCTTAT (ex 7)
Ser166Tyr
Gli alleli associati ad un normale contenuto di caseina b le latte di
capra si originano per singole sostituzioni nucleotidiche
Alleli “nullo”
L’evento molecolare che caratteriza allele b-Cn 01 è la transizione CT
al nucleotide 373 del 7° esone che determina uno stop codon prematuro,
mentre quello che caratteriza l’allele b-Cn 0 è la delezione del 16
nucleotide del 7° esone che determina uno stop codon prematuro
~ 9 kb
5’
3’
1
2
3
4
5
6
7
8
Rappresentazione schematica del gene della caseina b
1
9
Premature stop
CSN2 01 allele
stop
5’
3’
1
2
3
4
5
6
7
8
9
PTC
La presenza di uno stop codon prematuro
può essere responsabile dell’apparente
assenza di caseina b nel latte
Dall’analisi dei trascritti del gene CSN2 di capra si evince che il
livello di sintesi dell mRNA dell allele b-Cn 01 è 100 volte più
basso di quello normale
Dot blot
1
2
0.1
0.2
0.4
0.8
mg of total RNA
1: CSN2 01/01; 2: CSN2 A/A
Rando et al., 1996. Two mutations might be responsible for the absence of b-casein in goat milk. In Proceeding International Conference on
Animal Genetics, Animal Genetics 27, (Suppl.2), 31.
Persuy et al., 1999. A single nucleotide deletion resulting in a premature stop codon is associated with marked reduction of transcripts from a goat
b-casein null allele. Anim. Genet. 30, 444-451.
Resa in formaggio:
-20%
Assenza di
caseina b
Tempo di coagulazione:
triplo
CROMOSOMA 6
~12 kb
CSN1S1
0
~70 kb
CSN3
CSN1S2
CSN2
50
~95 kb
100
150
200
250 kb
CSN1S2 gene
~ 18.5 kb
1
2
3 45 6 7 8 91011 12 13 1415 16 17
18
exons
5’
3’
Rappresentazione schematica del gene CSN1S2 di capra
. = regione 5’UT;
= regione codificante il peptide leader;
= regione codificante;
= regione 3’ UT
Livello di sintesi alto
 2,5 g/l per allele
Livello di sintesi medio
1,5 g/l per allele
-40%
Livello di sintesi
apparentemente nullo
~0,0 g/l per allele
- 100%
Polimorfismo al locus CSN1S2 di capra
A tutt’oggi sono stati identificati almeno 7 alleli associati a 3 differenti
livelli di sintesi di caseina as2 nel latte di capra
- CSN1S2 A, B, C, E e F
- CSN1S2 D
- CSN1S2 0
~2.5 g/l per allele
(-40)~1.5 g/l allele
0.0 g/l per allele
a-La 
+
b-Lg 
as1-CnF
k-Cn 
as2-Cn D
b-Cn 
as1-Cn 
as2-Cn 
_
1
2
3
Pattern elettroforetici in SDS-PAGE di campioni individuali di latt e
Lane 1: CSN1S2 A/A; Lane 2: CSN1S2 D/A; Lane 3: CSN1S2 0/0
Normale livello di sintesi di caseina
1
2
3 45 6 7 8 91011 12 13 1415 16 17
18
5’
as2
esoni
3’
Gli alleli CSN1S2A, B, C, E e F differiscono per singole mutazioni
puntiformi e, conseguentemente, per singole sostituzioni
aminoacidiche a livello proteico
CSN1S2
allele
Nucleotide
substitutions
Amino acid
substitutions
A B
G A 10th nt of 9th exon
Glu64 Lys
A C
A T 5th nt of 16th exon
Lys167 Ile
A F
G C 13th nt of 3th exon
Val7 Ile
C E
C G 83th nt of 16th exon
Pro193 Arg
Rappresentazione schematica del gene CSN1S2 di capra e
delle differenti forme di mRNA prodotte da un individuo con
genotipo CSN1S2 AA
1
2
3 45 6 7 8 91011 12 13 1415 16 17
18
5’
exons
3’
Correctly spliced mRNA (91.6%)
6
1
2
3 45
7 8 91011 12 13 1415 16 17
18
5’
exons
3’
mRNA lacking the 27 nucleotides of the exon 6 (8.4%)
= 5’ untraslated region;
= coding region;
= region encoding signal peptide;
= 3’ untraslated region
Ramunno et al., (2001). Characterization of two new alleles at the goat CSN1S2 locus. Animal Genetics, 32 (5), 264-8.
Allele CSN1S2 D
L’analisi in SDS-PAGE di campioni individuali di latte ha evidenziato che
la banda relativa alla variante as2-Cn D mostra una chiara riduzione di
intensità se comparata con quella di altre varianti a tale locus (circa il
40%)
Pattern elettroforetico in SDS-PAGE
di un campione individuale di latte di
una capra con genotipo CSN1S2 AD
as2-Cn D
as2-Cn A
Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S2 D
Livello intermedio di sintesi di caseina as2
5’
3’
1
2
3
4 5 6
7
8
9 10
11 12
13
14 15
16
17
18
N84 E
I
N
Q
F Y Q
K
gacacatagagaagattcaatactggagtaaatattggtaattttctttctctctag AAT GAA ATC AAT CAG TTT TAT CAG AAG
gacacatagagaagattcaatactggagtaaatattggtaattttctttctctctag AAT GAA ATC AAT CAG TTT TAT CAG AAG
CSN1S2 A
CSN1S2 D
F
P94 Q Y
L Q Y
P Y Q
G P104 I
V L N
P W
D
TTC CCC CAG TAT CTC CAG TAT CCG TAT CAA GGT CCA ATT GTT TTG AAC CCA TAG GAT
TTC CCC CAG TAT CTC CAG TAT CCG TAT CAA GGT CCA ATT GTT TTG AAC CCA TGG GAT
Q
V K114 R
N A G
P
F T
P T
V124
CAG GTT AAG AGA AAT GCT GGC CCC TTT ACT CCC ACC GTG gtgagtgctgcttttttatatgttgtttcttgtttttt
CAG GTT AAG AGA AAT GCT GGC CCC TTT A----------------------------------------------------------------tttttttttttctttctgtttttggtgaaggatgagttcaagataaagatttgtaaaatgtctagagataaaatgtcccaacg
--------------------------------------------------------------- atgtctagagataaaatgtcccaacg
. = regione 5’UT;
= regione codificante il peptide leader;
= regione codificante;
as2-Cn D
as2-Cn A
= regione 3’ UT
L’allele CSN1S2 D si caratterizza per una delezione
di 106-bp che coinvolge gli ultimi 11 bp dell’esone
11 ed i primi 95 bp del successivo introne
Rappresentazione schematica del gene CSN1S2 di capra e delle differenti
forme di mRNA prodotte da un individuo con genotipo CSN1S2 DD
11
1
2
3 45 6 7 8 910
12 13 1415 16 17
18
5’
exons
3’
mRNA lacking exon 11 (82.1%)
6
1
2
3 45
11
7 8 910
12 13 1415 16 17
18
5’
exons
3’
mRNA lacking exons 6 and 11 (13.4%)
6
1
2
3 45
7
8
11
910
12 13 1415 16 17
18
5’
exons
3’
mRNA lacking exons 6, 8 and 11 (4.5%)
= 5’ untraslated region;
= coding region;
= region encoding signal peptide;
= 3’ untraslated region
Ramunno et al., (2001). Characterization of two new alleles at the goat CSN1S2 locus. Animal Genetics, 32 (5), 264-8.
L’allele CSN1S20 è un allele nullo essendo associato all’apparente
assenza di caseina as2 ne latte
Pattern elettroforetici in SDS-PAGE di campioni individuali di latte di tre capre
con genotipo: CSN1S2 AA (line1), CSN1S2 A0 (line2) e CSN1S2 00 (line3)
as2-Cn 
contenuto di caseina as2
~5.0 g/l
~2.5 g/l
0.0 g/l
La mutazione che caratterizza l’allele CSN1S2 0
La transizione di GA al nucleotide 80 dell’esone 11° è
responsabile della conversione del codone TGG (codificante per
un triptofano in posizione 110) nel codone di terminazione TAG
La mutazione è responsabile della scomparsa del sito di
restrizione dell’endonucleasi NcoI
L’analisi per mezzo di Dot blot ha evidenziato che il livello di mRNA
trascritto dall’allele CSN1S2 0 è circa 1/10 del valore normale
Dot blot
1
2
0.1
0.2
0.4
0.8
mg of total RNA
1: CSN1S2 0/0; 2: CSN1S2 A/A
Ramunno et al., (2001). An allele associated with a non dectable amount of as2 casein in goat milk. Animal Genetics, 32 (1), 19-26.
Rappresentazione schematica del gene CSN1S2 di capra e
delle differenti forme di mRNA prodotte da un individuo con
genotipo CSN1S2 00
stop
stop
Correctly spliced mRNA (67.7%) (PTC)
stop
mRNA lacking exon 11 (13.3%)
11
stop
stop
mRNA lacking exon 6 (10.2%) (PTC)
6
stop
mRNA lacking first 81 nt of the exon 11 (7.1%)
81 nt
stop
mRNA lacking exons 6,7,8,9,10,11 (1.0%)
6 7 8 910 11
stop
mRNA lacking exons 3,4,5,6,7,8,9,10,11 (0.7%)
3 4 5 6 7 8 910 11 1213
= 5’ untraslated region;
= coding region;
= region encoding signal peptide;
= 3’ untraslated region
Principali caratteristiche del latte di donna
a) Assenza di b lattoglobulina
b) Basso contenuto caseinico e, in
particolare, assenza di caseina as2 e tracce
di casena as1
a-La 
Patter elettroforetico in
SDS-PAGE di un
campione individuale di
latte di donna
k-Cn 
b-Cn 
as1-Cn 
Caratteristiche del latte prodotto da capre con genotipo
CSN1S2 0/0
Latte di capra senza caseina as2
Simile la latte di donna
a-La 
b-Lg 
as1-Cn F
k-Cn 
b-Cn 
as1-Cn 
as2-Cn 
1
2
3
1: capra CSN1S2 A/A; 2: capra CSN1S2 0/0;
3: donna
55% αs1
Caseine
90% αs2
% pazienti
allergici
vs
le singole
15% b
50% k
45% b-lg
proteine
50% Lt
0% α-la
Maggiore allergene
PCR-RFLP Alleli A, B, N e F
AS-PCR Allele 01
PCR Allele E
~700 bp
~200 bp
M
X/X 01/X 01/01
AA BB NN
FF
AB
NA FA
NB
FB
FN
X/X X/E E/E
ALLELI as1-Cn
Razza
M = Marker
N°
Alto
 3,5 g/l
Medio
 1,1 g/l
Basso
 0,45 g/l
Nullo
 0,0 g/l
Camosciata
0,624
0,171
0,140
0,062
32
Saanen
0,202
0,265
0,546
0,046
32
Nicastrese
0,626
0,019
0,343
0,009
102
Aspromontana
0,678
-
0,320
0,025
39
Maltese
0,750
-
0,375
-
8
Frequenze alleliche al locus as1-Cn
nelle razze Nicastrese e Aspromontana:
passato e presente
0,9
0,8
Contenuto alto caseina as1
Frequenze alleliche
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Ieri (anni 90)
Oggi (2010)
.
..
Nicastrese
Aspromontana
0,777
0,626
0,797
0,678
AS-PCR
01/01
Razza
01/X
X/X
M = Marker
ALLELI b-Cn
N°
alto
nullo
Camosciata
1,00
0,00
57
Saanen
0,977
0,023
45
Nicastrese
0,969
0,031
102
Aspromontana
0,888
0,112
40
Maltese
1,00
0,00
6
Frequenze alleliche al locus b-Cn
nelle razze Nicastrese e Aspromontana:
passato e presente
CSN1S2
PCR-RFLP Alleli D e 0
M
Razza
0/0
0/D D/X X/X
ALLELI as2-Cn
N°
alto
medio
nullo
Camosciata
1,00
-
-
55
Saanen
1,00
-
-
39
Nicastrese
0,976
-
0,024
101
Aspromontana
0,925
-
0,075
40
Grigia
1,00
-
-
19
Maltese
1,00
-
-
7
Bianca
1,00
-
-
9
Capestrina
1,00
-
-
3
Frequenze alleliche al locus as1-Cn
nella razza Camosciata:
passato e presente
Alto
contenuto
Rappresentazione schematica del gene CSN3
~12 kb
CSN1S1
0
~70 kb
100
2432
5’
CSN3
CSN1S2
CSN2
50
~95 kb
150
6800
1
2
65
62
2100
3
33
200
Cromosoma 6
250 kb
intron size bp
1800
4
523
5
172
3’
exons size bp
Gli alleli CSN3 A e B differiscono per una singola mutazione
puntiforme AC al nt 415 del 4° esone responsabile della
sostituzione aminoacidica AspAla
La mutazione è responsabile della scomparsa del sito di restrizione
dell’endonucleasi HinfI
k-caseina bovina
Le più comuni varianti genetiche della caseina k (A e B) hanno
un’influenza diversa sul processo di produzione del formaggio
Il latte contenente la k-caseina B coagula generalmente in tempi minori
(Figura 2) e presenta una maggiore consistenza del coagulo (Figura 3).
Resa in formaggio grana:
BB vs AA → +10%
Differenze individuali nel contenuto
di caseina k nel latte di vacca
Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 G di vacca
Livello intermedio di caseina as1
insertion
371
N/N N/G G/E G
M = Marker
5’
3’
53
63
33
39
24 24 24 24
. = regione 5’UT;
33 2454
42 24
42 27 24
154
45
385
exons size
= regione codificante il peptide leader;
= regione codificante;
= regione 3’ UT
Un evento mutazionale simile a quello che caratterizza l’allele
CSN1S1 E di capra è stato ossservato anche per la specie bovina
(allele CSN1S1 G)
Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 G di vacca
5’
3’
53
63
33
39
24 24 24 24
33 2454
42 24
42 27 24
154
45
exons size
αs1 caseina bovina
Identificati due livelli di sintesi
di caseina αs1
Livello di sintesi normale
ALLELE N
 5,0 g/l per allele
Livello di sintesi basso
ALLELE G
 2,2 g/l per allele
- 56 %
Genotipo
Caratteristiche tecnologiche
as1-Cn N normale ( 10 g/l)
Elevata velocità di coagulazione e ridotta
consistenza della cagliata
as1-Cn G basso ( 4 g/l)
Bassa velocità di coagulazione e notevole
consistenza della cagliata
Polimorfismo della lattoferrina caprina
La lattoferrina (Lf) è una sieroproteina del peso di circa 80 Kda e
con due siti di legame Fe3+
La concentrazione di lattoferrina varia da specie a specie
Lattoferrina --
La lattoferrina costituisce il principale componente antimicrobico del colostro e
svolge un ruolo determinante nel proteggere il neonato dalle malattie infettive
Differenze individuali nell’attività antibatterica della
lattoferrina nel latte di capra
Saanen
So
Coreana
Sono state individuate capre che
producono latte contenente lattoferrina
con maggiore attività antibatterica
Sono stati individuati 82 siti polimorfici al locus
della lattoferrina di capra
E’ stato individuato un microsatellite polimorfo
(ripetizione tandem CTGn, con n=6 o n=9) tra i
nt 3543-3560 del 13° introne
Nicastrese
Siriana
Un latte contenente “naturalmente” lattoferrina con maggiore attività
antibatterica potrebbe essere impiegato per l’alimentazione infantile grazie al
suo effetto protettivo sull’intestino del neonato
Acil CoA:diacilglicerol aciltransferasi 1 (DGAT1)
Il DGAT1 è un enzima microsomiale che svolge un ruolo centrale nel metabolismo dei
glicolipidi a livello cellulare e catalizza l'ultimo step nella sintesi del triacilglicerolo
utilizzando come substrato il diacilglicerolo (DAG) e l'acil CoA dell'acido grasso.
Nel bovino è stata evidenziata una doppia sostituzione nucleotidica al 15° e 16° nt dell’8°
esone: AAGC responsabile del cambiamento aa Lisina232Alanina
È stato dimostrato che l’allele K232A è responsabile di una
minore percentuale di grasso nel latte
Stearoyl CoA denaturasi (SCD)
Lo Stearoyl-CoA desaturase (SCD) è un enzima chiave nella biosintesi degli acidi grassi
monoinsaturi (MUFA) e gioca un ruolo centrale nella regolazione del metabolismo degli
acidi grassi catalizzando l’inserzione di un doppio legame tra gli atomi di carbonio 9 e 10 in
una serie di acidi grassi saturi. In particolare, tale enzima è implicato nelle variazioni di
acido linoleico coniugato (CLA)
ACIDI GRASSI SATURI
ACIDI GRASSI
MONOINSATURI
Nella specie bovina il gene codificante per la SCD è stato indicato come gene candidato per
il cambiamento del rapporto acidi grassi saturi/insaturi ed è stato individuata un SNP
non conservativo T→C al 231° nt dell’esone 5
VALINAALANINA
T
C
L’allele C è stato associato a più alti contenuti di acidi grassi monoinsaturi nelle carcasse ed
è positivamente correlato a indici più alti di desaturazione nel latte
Incremento produzione latte
Incremento
tasso
ematico
ossitocina
Livelli più elevati di mungibilità
(< tempo di mungitura)
Lollivier et al. 2002. Oxytocin and milk removal: two important sources of variation in milk production and milk
quality during and between milkings. Reproduction Nutrition Development, 42:173–186
DraII PCR-RFLP G170→T .
M= Marker 1000 bp;
1= OXT G/G; 2= OXT
G/T; 3= OXT T/T
C-966→
Genotyping
T
C/C=116; C/T=78; T/T=14
TOT: 208
C= 0,745; T=0,255
A-790→ G
A/A=113; A/G=79; G/G=13
TOT: 205
A=0,744; G=0,256
G170→T
Ex 2
G/G=115; G/T=78; T/T=12
TOT: 205
G=0,751; T=0,249
CowID
Date Milk (mL) Time min Flusso (mL/sec) OXT prom 2 OXT prom 1 OXT ex2 Calving date lactation
109 04/06/08
8305
7,2
19,2
GA
CT
GT
03/06/2008
6
109 05/06/08
3033
6,9
7,3
GA
CT
GT
03/06/2008
6
109 06/06/08
8807
8,1
18,1
GA
CT
GT
03/06/2008
6
Animali
controllati
200
date of birth
17/06/1998
17/06/1998
17/06/1998
Quantità
di latte
Tot. osservazioni:
41980
Velocità di
Eiezione
del latte
Tot. osservazioni:
41980
y = mese + giorno + OP + stagione + OXT+ B(OXT) + e
y = produzione di latte giornaliera,
mese = effetto fisso del mese di produzione (12)
giorno = effetto fisso giorno di lattazione
OP = effetto fisso ordine di parto (7)
stagione = effetto fisso stagione di parto (4)
OX = effetto fisso del genotipo al gene OXT
B = effetto casuale della bufala (169)
e = errore
Associazione con i C.F: ns
Prof. N. Macciotta
Uniss
Numero di osservazioni 41980
Genotipo (ex 2)
Media (kg)
Se
GG
8.70ab
0.22
TG
8.26a
0.28
TT
10.19b
0.70
TT vs TG = + 1,93 Kg
(p=0,03)
y = mese + giorno + OP + stagione + OXT+ B(OXT) + e
y = % proteina
mese = effetto fisso del mese di produzione (12)
giorno = effetto fisso giorno di lattazione
OP = effetto fisso ordine di parto (7)
stagione = effetto fisso stagione di parto (4)
OX = effetto fisso del genotipo al gene OXT
B = effetto casuale della bufala (170)
e = errore
Prof. N. Macciotta
Uniss
Numero di Osservazioni: 4219
Genotipo (ex 2)
Media
Se
TT
4.60a
0.02
TG
4.71b
0.02
GG
4.69ab
0.04
TG vs TT = + 0,11% (p=0,03)
Il conto della Massaia
Calcolo del PKM
Mozzarella (Kg) = Latte (Kg) x 3,5 x (% Proteine) +
1,23 x (% Grasso) – 0,88
100
PKM giornaliero/animale con i valori medi produttivi dei controlli funzionali del campione
8,34 (Kg latte) x 3,5 x (4,67 %P) + 1,23 x (8,53 % G) – 0,88 = 2,16 Kg Mozzarella
100
In 270 giorni di lattazione si hanno: 583,2 Kg
PKM giornaliero/animale Kg latte genotipo TT al locus OXT
10,19 (Kg latte) x 3,5 x (4,60 %P) + 1,23 x (9,34 % G) – 0,88 = 2,72 Kg Mozzarella
100
In 270 giorni di lattazione si hanno: 734,4 Kg
Incremento produttivo del 25,9 %
Geni candidati per il grasso
• ACACA
• DGAT1
• SCD
y = mese + OP + DIM + stagione + azienda + ACACA+ B + e
y = Kg latte
mese = effetto fisso del mese di produzione (12)
OP = effetto fisso ordine di parto (7)
DIM= effetto fisso stadio di lattazione (10)
stagione = effetto fisso stagione di parto (4)
Azienda = effetto fisso azienda (2)
ACACA= effetto fisso del genotipo al gene ACACA
B = effetto casuale della bufala (170)
e = errore
Prof. N. Macciotta
Uniss
Individuazione
T  C nt 34
1 SNP Ex 1
Numero di osservazioni : 3858
Genotipo
Media
Se
TT
9.62a
0.66
TC
6.32b
1.04
CC
6.59ab
1.02
TT vs TC= + 3,30Kg (p=0,04)
Il conto della Massaia
Calcolo del PKM
Mozzarella (Kg) = Latte (Kg) x 3,5 x (% Proteine) + 1,23 x (% Grasso) – 0,88
100
PKM giornaliero/animale con i valori medi produttivi dei controlli funzionali del campione
8,34 (Kg latte) x 3,5 x (4,67 %P) + 1,23 x (8,53 % G) – 0,88 = 2,16 Kg Mozzarella
100
In 270 giorni di lattazione si hanno: 583,2 Kg
PKM giornaliero/animale Kg latte genotipo TT al locus ACACA
9,62 (Kg latte) x 3,5 x (4,60 % P) + 1,23 x (8,36 % G) – 0,88 = 2,45 Kg Mozzarella
100
In 270 giorni di lattazione si hanno: 661,5 Kg
Incremento produttivo del 13,4 %
y = mese + giorno + OP + stagione + SCD+ B(SCD) + e
No. osservazioni Contr. Gior. 43510
Genotipo
Media
Se
AA
8.42ab
0.24
AC
9.18a
0.34
CC
7.15b
0.78
AC vs CC = + 2.02 Kg; (p=0,05)
No. osservazioni Contr.Funz. 5473
Super
dominanza
Genotipo
Media
Se
AA
8.46ab
0.17
AC
8.67a
0.20
CC
7.46b
0.46
AC vs CC = + 1.21Kg (p=0,03)
Il conto della Massaia
Calcolo del PKM
Mozzarella (Kg) = Latte (Kg) x 3,5 x (% Proteine) + 1,23 x (% Grasso) – 0,88
100
PKM giornaliero/animale con i valori medi produttivi dei controlli funzionali del campione
8,34 (Kg latte) x 3,5 x (4,67 %P) + 1,23 x (8,53 % G) – 0,88 = 2,16 Kg Mozzarella
100
In 270 giorni di lattazione si hanno: 583,2 Kg
PKM giornaliero/animale Kg latte genotipo AC al locus SCD
Da 8,67 a 9,18 (Kg latte) x 3,5 x (4,60 %P) + 1,23 x (8,78 % G) – 0,88 = da 2,25 a 2,38 Kg Mozzarella
100
In 270 giorni di lattazione si hanno: 607,5 a 642,6 Kg
Incremento produttivo dal 4,2 % al 10,2 %
GENI CANDIDATI CHE
CONTROLLANO LA PRODUZIONE
DI CARNE
LEPTINA
 Ormone proteico di 167 aminoacidi
 Secreto soprattutto dagli adipociti

Regola il
metabolismo
energetico
Ingestione alimentare
Ripartizione dei nutrienti fra i
diversi tessuti
Deposizione del grasso
Il gene codificante è stato proposto come candidato per la
produzione quanti-qualitativa di carne
Anche nell’uomo, mutazioni del gene Lep
sono associate ad obesità
• Casi di mancanza congenita di
leptina
• Casi in cui si verifica una
mutazione sul gene che
codifica per il recettore della
leptina(delezione G a livello
del codone 133)
GENE MAGGIORE ???
IL GENE LEP NEI BOVINI
Mappato sul chr 4
costituito da 3 esoni
1
2
3
3’
5’
Esone 2:
Esone 3:
AT
Tyr/Phe
nt 305 C  T
Arg/Cys
CT
Val/Ala
nt 252
nt 140
La sostituzione Arg(C)  Cys(T) induce
un’alterazione della struttura della proteina
 perdita dei siti di legame col recettore
 perdita di funzionalità
 aumento di mRNA
Allele T associato a carcasse più grasse
FREQUENZE ALLELICHE
Più grasso
Razza
n.
LepC
LepT
Blonde d’Aquitaine
60
0.717
0.283
Blu Belga
17
0.882
0.118
Piemontese
79
0.755
0.245
Frisona I.
52
0.529
0.471
Valdostana p.r.
42
0.619
0.381
- E’ una proteina della superfamiglia dei fattori di
trasformazione-crescita ß (TGF-ß), regolatori della
crescita e della differenziazione delle cellule muscolari;
La miostatina reprime attivamente la crescita muscolare
e un suo mancato funzionamento determina una
perdita di controllo della crescita muscolare
Gene della miostatina
GDF8 (~ 6700 bp )
I ex
373 nt
1838 nt
II ex
374 nt
2033
nt
III ex
381 nt
2
Sono state individuate finora 6 diverse mutazioni che
inattivano la proteina in varie razze
3° ex
del gene GDF8 mappa sul
Cromosoma 2
Primi soggetti individuati nel 1993
127 nt
G
T
Sostituzione
Glu 291/stop codon
3° ex
del gene GDF8
Bianca Blu Belga
74° nt
Stop codon
11 bp
prematuro
Piemontese
191° nt G
A
Tyr/Cys
FENOTIPO
Intermedio
Normale
PESO VIVO Kg 645,066,1 700,069,3
CARCASSA Kg 414,146,6 445,525,9
63,92,6
RESA % 64,21,6
CARATTERE
IPERTROFIA
NORM.
INTER.
9
7
cm 125,33,8 124,13,4
IPERT.
4
116,65,8
124,63,3
LARILEI
cm 133,34,0 128,86,6
cm 36,52,9 39,51,3
LARDOR
cm 26,6,2,1
27,32,9
ALGAR
ALCROCE
25,63,5
41,31,3
Medie stimate dell’area delle fibre (mm2) nei diversi muscoli e nei due genotipi.
Genotipo
Tipo di muscolo
Totale
LD
PM
Eterozigote
ST(sem
tend)
3759,00
2606,00
1707,00
2691,00
Omozigote nor.
3845,00
3292,00
2658,00
3265,00
Totale
3802,00
2949,00
2182,00
Normale
Psoas major
Intermedio