1 2 3 - Scuola di Specializzazione in Ispezione degli Alimenti di
annuncio pubblicitario
Struttura Settore U.O. Responsabile Scientifico Subunità Carne suina Università Bologna Russo N°6: Ajmone-Marsan, Matassino, Pagnacco, Pilla,Stefanon, Valentini Carne bovina e altre specie Università Tuscia Valentini N°8: Ajmone-Marsan, Di Stasio, Greppi, Nardone,Panella, Pilla, Roncada, Williams Latte bovino Università Piacenza AjmoneMarsan N°5: Russo, Pariset, Bagnato, Feligini, Caroli Latte : bufala,capra,asina,pecora Università Napoli Ramunno N°6: Chianese, Pilla, Rando, Carta, Crepaldi, Feligini Cavalli Università Perugia Silvestrelli N°1: Renieri Tracciabilità ConSDABI Matassino N°7: Ajmone-Marsan, Blasi, Bongioni, Cianci, Di Luccia, Fontanesi, Gandini Riproduzione, resistenza a malattie e stress CRSA Williams N°6: Poli, Lacetera, Bernabucci, Ferretti, Piearagostini, Iannelli Modelli di trasferimento genetica molecolare negli schemi di selezione Università di Sassari Macciotta N°3: Gandini, Carnier, Pieramati Formazione per le strutture di miglioramento Università Milano Pagnacco Componenti dei prodotti zootecnici funzionali per la salute umana Università Tuscia Nardone N°1: Caroli Coordinatore: Prof. Sandro Nardone Unità di ricerca – latte asina, bufala, pecora e capra Responsabile scientifico: Prof. Luigi Ramunno Obiettivo generale della Unità di Ricerca Analisi della variabilità di alcuni geni che influenzano le caratteristiche quali-quantitative del latte e verificare se tale variabilità è associata o responsabile di differenze nell’espressione del carattere MIGLIORAMENTO GENETICO Il genotipo di un individuo è dato dal suo corredo genetico, è ciò che è "scritto" nel DNA contenuto nel nucleo di tutte le sue cellule. Il fenotipo è l'insieme dei caratteri che l'individuo manifesta: dipende dal suo genotipo, dalle interazioni fra geni e anche da fattori esterni; dunque può variare. CARATTERI QUALITATIVI •Base genetica semplice •Sono scarsamente influenzati dall’ambiente P= G •La popolazione non si distribuisce in modo continuo CARATTERE QUANTITATIVO Base genetica complessa Influenzati dall’ambiente La popolazione si distribuisce in modo continuo Il fenotipo non coincide con il genotipo: P = G + A METODI UTILIZZATI PER IL MIGLIORAMENTO GENETICO DEGLI ANIMALI GENETICA QUANTITATIVA (SELEZIONE FAMILIARE, INTRAFAMILIARE, INDIVIDUALE) GENETICA MOLECOLARE APPROCCIO INDIRETTO: Marcatore anonimo associato al carattere (MAS) APPROCCIO DIRETTO: Gene Maggiore e Gene Candidato Nel latte dei ruminanti sono presenti 6 principali proteine a-lattoalbumina (a-La) cromosoma 5 a-La b-lattoglobulina (b-Lg) cromosoma 11 b-Lg k-Cn 4 caseine (as1, b, as2 e k) b-Cn codificate da 4 geni autosomici associati as1-Cn (CSN1S1, CSN2, CSN1S2 e CSN3) as2-Cn cromosoma 6 Importanza tecnologica delle caseine La qualità del latte, sotto il profilo tecnologico-caseario, è intesa come la capacità di dare un buon formaggio, con un’alta resa alla trasformazione Casein micelle αs1, β, αs2 caseins K casein Idrofobic center b b Chymosin k a a k Submicelles para k casein b b k =O…H-O-Ca-O- k a Cagliata a L’importanza del contenuto in caseine nel determinare la resa quantitativa del latte destinato alla caseificazione è nota da tempo IL CROMOSOMA 6 I GENI DELLE QUATTRO CASEINE SONO LOCALIZZATI SUL CROMOSOMA 6 ~12 kb b as1 0 ~70 kb 50 ~95 kb as2 100 150 k 200 250 kb Mappa fisica dei loci delle caseine nella specie caprina, con relativa posizione e orientamento dei singoli geni. I geni codificanti per le 6 principali proteine del latte = region encoding signal peptide = 3’ untraslated region = coding region = 5’ untraslated region Gene codificante: ~ 16.7 kb 3’ 5’ 1 3 2 4 5 6 78 9 1011 12 13 14 15 16 ~ 9 kb 17 18 19 exons 5’ 2 1 3 4 5 6 8 7 ~ 18.5 kb 3’ exons 9 5’ 1 2 3 45 6 7 8 910 11 12 13 1415 as1 casein 16 17 b casein 3’ as2 casein 18 exons ~13 kb 3’ 5’ 1 3 2 k casein 5 exons 4 ~ 4.5 kb 5’ 3’ 1 2 3 4 6 7 exons b-lg ~ 2 kb5 3’ 5’ 1 2 3 4 exons a-lg Livello di sintesi alto 3,5 g/l per allele Livello di sintesi medio 1,1 g/l per allele - 68% Livello di sintesi basso 0,45 g/l per allele - 88% Livello di sintesi nullo 0,0 g/l per allele - 100% Differenze individuali nel contenuto di caseina as1 nel latte di capra Normale livello di sintesi di caseina as1 (9Alleli) as1 nt mutation B1 aa mutation Wild type A GAGCAG (ex 10) Glu77Gln B2 CTCCCC (ex 4) Leu16Pro B3 AGAAAA(ex 12) Arg100Lys B4 ACTGCT(ex 17) Thr195Ala C CACATC(ex 3) His8Ile H AGGAAG (ex 2) Arg1Lys (N terminal) L CGTCAT (ex 11) Arg90His M TCGTTG (ex 9) Ser66Leu Gli alleli associati ad un normale contenuto di caseina as1 nel latte di capra si originano per singole sostituzioni nucleotidiche mRNA identificati dallo screening di 208 cloni dell’allele CSN1S1 A mRNA Delezione Regione deleta Frequenze n° aa allele individuati possibili 1085bp ---- ---- 52.50 199 1082 bp 3 bp 1a tripletta esone 11 35.00 198 1061 bp 24 bp esone 13 5.77 191 1061 bp 24 bp esone 16 5.29 191 903 bp 206 bp esone 16, 17 e 1a tripletta esone 11 1.44 153 mRNA completo 1 1 2 2 3 3 4 4 5 67 8 5 67 8 9 10 11 12 13 14 15 16 9 10 11 12 13 14 15 16 17 17 18 18 19 19 mRNA senzala prima tripletta dell’esone 11 (CAGGln78) mRNA senza l’esone 13 1 2 3 4 5 67 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 mRNA senza l’esone 16 1 2 3 4 5 67 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ug a ug a 1 2 3 4 5 67 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 mRNA senza l’esone 16, 17 e la prima tripletta dell’esone 11 (CAGGln78) Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 E di capra Livello intermedio di caseina as1 (1,1 g/l per allele -68%) 5’ 3’ 53 63 33 39 24 24 24 24 33 2454 42 24 42 27 24 154 45 385 exons size Insertion 457 bp (LINE) ctttttttttttttttttttttttcttactgaatgacttttttatttttatttttattttttatttatttttttttatttt ttttttttaatttttaatttttatttttaaattttaaaatctttaattcttacatgcgttcccaaacatgaacccccctcc cacctccctccccacaacatctctctgggtcatccccatgcaccagccccaagcaagctgcaccctacgtcagacatggac tggcgattcaattcttacatgacagtatacatgttataattcccattctcccaaatcatcccaccctctccctctccctct gagtccaaaagtctggtatacacatctgtgtctttttccctgtcttgcatacagggtcgtcattgccatcttcctaaattc catatatatgtgttagtatactgtattggtgtttttctttctggcttacttcact Pattern elettroforeico in SDSPAGE di campioni individuali di latte = region encoding signal peptide = coding region = 3’ untraslated region = 5’ untraslated region as1-Cn CSN1S1 B4/B4 E/E Una possibile spiegazione della ridotta sintesi associata all’allele CSN1S1 E caprino è che il prodotto di trascrizione di tali alleli mostra un poly (T) nella regione 3’ untraslated creando una instabilità dell’mRNA. Tale struttura è responsabile di una rapida degradazione del messaggero. CSNIS1 E = -262.7 kcal/mol CSNIS1 A = -125.7 kcal/mol Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 F Basso livello di sintesi di casina as1 (0,45 g/l per allele, -88%) insertion 11 bp insertion 3 bp Stop 5’ 3’ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 C nt 23 Allele CSNIS1 F CAAATGAAAGCTGGAAGCAGTT—GTCAAGTGAG C nt 23 = regione codificante peptite leader = regione codificante = regione 3’ UT = regione 5’ UT as1-CnF CSN1S1 A/A Delezione della Citosina al 23° nt del 9° esone F/F mRNA trascritti dall’allele CSN1S1 F di capra Ramunno, et al., (2005). Comparative analysis of gene sequence of goat CSN1S1 F and N alleles and characterization of CSN1S1 transcript variants in mammary gland. Gene, 345 (2), 289-299. Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 F di capra CSNIS1 F mRNA 5’ 53 63 del principale trascritto 33 24 54 33 39 24 24 24 24 42 24 42 27 24 175 45 385 18 19 9 1011 1 2 3 4 5 6 7 8 12 13 14 15 16 17 = regione codificante peptite leader = regione codificante = regione 3’ UT = regione 5’ UT 3’ Pattern elettroforetico in SDSPAGE di campioni individuali di latte La popolazione di mRNA più trascritta (60%) si caratterizza per lo skipping alternativo degli esoni 9, 10 e 11 ed è responsabile, di conseguenza, della sintesi di una caseina as1 priva di 37 aa. as1-CnF Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 N stop stop 5’ 3’ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 exons CSNIS1 N allele CAAATGAAAGCTGGAAGCAGTT—GTCAAGTGAG C nt 23 . = regione 5’UT; = regione codificante il peptide leader; = regione codificante; = regione 3’ UT as1-CnF L’allele CSN1S1 N si caratterizza, analogalmente all’allele CSN1S1 F, per la delezione della Citosina al 23° nt del 9° esone. CSN1S1 ~0.9 g/l FF 0.0 g/l NN L’analisi per mezzo di RealTime PCR mostra che la quantità di mRNA trascritta dall’allele CSN1S1 N è circa il 33% di quella trascritta dall’allele CSN1S1 F F allele N allele Confronto mRNAs CSN1S1 F e N Il confronto dei trascritti prodotti dagli alleli N e F mostra una notevole variabilità di splicing alternativi cDNA detected Deleted sequence(s 974 bp Exons 9, 10, 11 1052 bp Exon 9 Estimated percentage Estimated percentage FF NN 60% 21.2% 12% 20.6% 12% 24.5% PTC 6% 6% 12.7% 8% - 17562 – 17579 19512 17721 - 4.7% PTC Estimated MW (Da) 18574 - 18591 21626 – 21641 21498 – 21513 1049 bp Exon 9, 1st triplet of exon 11 1084 bp 23rd nt of exon 9 (C) 1081 bp 23rd nt of exon 9 (C); 1st codon of exon 11 950 bp 1000 bp 950 bp 901 bp Exons 9, 10, 11 and 16 23rd nt exon 9 (C), 5 nt of exon 9, exon 10, 11 Exons 9, 10, 11 and 13 23rd nt of exon 9 (C), exons 16 and 17 989 bp 23rd nt of exon 9 (C), exons 16, 17 and 1st triplet of exon 11 977 bp 23rd nt of exon 9 (C), 5 nt of exon 9, exons 10, 11 e 16 - 3.2% 18499 1079 bp 1025 bp 23rd nt of exon 9 (C), 5 nt of exon 9 1st triplet of exon 11, exons 9 and 16 2% - 3.1% 2% 22547 – 22562 20501 1028 bp Exons 9 and 13 1% - 20772 884 bp Exons 9, 10, 11, 12, 13 and 16 1% - 14985 Per l’allele F si osserva una maggiore percentuale di trascritti caratterizzati dall’outsplicing degli esoni 9, 10 e11 Omologia tra la sequenza del promotore e primo esone degli alleli CSN1S1 A, F e N di capra YY1 …gttcaaaaaactaagttcacagcatactgccccatcacttcatggaaaatagagggggagggggagaaggtggaagtagtgttagattttattttcttggactcaaaatcactgcagacattgattatagccatgaa t c c ...--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------a c t ...--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC attaaatgatgcttcctccttgaaaagaaagttttgacaaacctagacagcatattaaaaagcagtgacatcactttactgataagggtctttatagtcaaagctacggtttttccagtagccatgtacagaagtgagaattg t a ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g c -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------c t YY1 tactatgaagaaggatgagtgtcaaaggactgatattttcaaattgtggtggatgcactcctttgcgtgcgtgctgtcatttcagtcatgtcctactctttgcaacccagtggaccgtcatctgccaagttcctctgtccatgg ca t g a -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g tg c a -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1 YY1/RC gattcttcaggcaagaacaatggagtgggttgccatttcctccaccaggggatcttcccaacccagatattgaacctgcaactctaatgtttcctgcatgggcaggcaggttctttaccactagtgccacctggaaagtcc c c g -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g a x -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AP-1 GATA agatacacttctgggaaagacaaaagtcgagtattacaatgcagctaggatttttgttctcagctccttgaataaattagagtgaatagaaaactctagtatcttgttgaaattgatatgaaacagacagtaaggaagataat g t -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AP-1 a c -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC PMF atctaaagaaaacttcaatatgggaaattatagtcttttctatcttcaaagtggagagcctgaacagttttgaaatttcttttaatacaaaataatgttcctgtcatacaactgtgaatacactgaaaatatcactatagatatttta ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1 aagtatataatatgattcctttcttataaacaaggagttgcaatcaacaagtttttaaagccctcacttgtatagatattttatttagcacataatattttgtacaatgccattaatatattgtacaatgtacaatgccagttaattctag ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC YY1 YY1 AP-1 OCT-1 gagtacaattaagaattggagggataggaatttttttcttttacttgtttactttaaaagatggaaaatcagagttatggtttattttttgcaatatttaaaaattgtaattcttgaataattattaattttaattaaataatctgtaatgaga ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC attctcctaccaatgcaggagacctgagtttgatccctggatagggaaaataccctgcagaaggaaatggcaacccactccaatattattatttgggaaatcccatggacagaggagactggcaggctaaagtccatgg ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1/RC ggtcacaaagaactggacacaacttagtgactaaacaacaacaatttacaccagaatgaatgaactagtcaccgcaactagtacacccaaaataaacaaaaattagcttggtgatataattaaaatgccaccaaagtttat c g g --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g t a --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------YY1 YY1 YY1/RC YY1/RC YY1/RC OCT-1 acgataattatattttctttttgcaagaaaaagattagaccacatatactgtaagttatttcacaaggtaaataattaaaataaatattatggattaactcagttttaagaggtgaaataaataatgaattcttctcatggtcttgtacg c g --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------t a --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ttaataaaaattgaaaatttttgaagaccctgttttgtcccaaggatttcctttacaggtattgaatttttcaaaagttacaaaggaaattttattgatataaatgcatgttctcataataaccataaatctagggttttaatgggtttttt c a g --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------g t --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------a YY1 AP-1 MILK BOX PR/CR MPBF ttttttttggatgttaatttagaacaatgccattccatttcctatataatgaatcacttctttgttgtaaactctcctcagaatttcttgggagaggaactgaacagaacatcgatttcctacgtgagagaattcttagaatttaaataa c --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------t --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------SV40 core enhancer OCT-1 YY1 TATA box PMF acctattggttaaactgaaaccacaaaattagcattttactaatcagtaggtttaaatagctcggaagcaaaagtctgccatcaccttgatcatcaacccagcttgctgcttcttcccagtcttgggttcaaggt CSN1S1A g --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CSN1S1N a --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CSN1S1F Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 01 Livello di sintesi nullo di caseina as1 ~ 9.0 kb ~ 8.5 kb 5’ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3’ 13 14 15 16 17 18 19 exons = regione codificante il peptide leader = regione codificante = regione 3’ UT = regione 5’ UT Pattern elettroforetico in SDS-PAGE di campioni individuali di latte L’allele 01 si caratterizza per la delezione di un tratto di DNA di circa 8,5 kb includente gli ultimi 7 esoni del gene as1 B4/B4 01/01 Effetto sul diametro delle micelle È stato osservato un significativo effetto effetto sul diametro delle micelle Maggiore resa in formaggio Alto livello di caseina as1 nel latte Migliori proprietà coaugulanti Ridotto livello di caseina as1 nel latte Peggiori proprietà coaugulanti Alto (7,0 g/l): 21,9 % Minore resa in formaggio Basso (0,9 g/l): 18,3 % Medio (1,1,0 g/l): 19,1 % Latte con basso contenuto caseina as1 Latte con alto contenuto caseina as1 Formaggio con gusto più tipicamente caprino Formaggio con gusto meno tipicamente caprino Valori medi e confronto statistico delle caratteristiche fisico-chimiche e tecnologiche di latte individuale ai genotipi as1-CnAA, as1-CnEE, as1-CnFF Rappresentazione schematica del gene CSN2 Comosoma 6 ~12 kb CSN1S1 0 ~70 kb CSN3 CSN1S2 CSN2 50 ~95 kb 100 150 200 250 kb CSN2 Gene ~ 9.0 kb 3’ 9 8 323 42 . = regione 5’UT; 7 492 6 5 4 3 42 24 27 27 2 1 63 48 5’ exon size (bp) = regione codificante il peptide leader; = regione codificante; = regione 3’ UT Livello di sintesi alto 5 g/l per allele Livello di sintesi apparentemente nullo 0,0 g/l per allele - 100% Polimorfismo della caseina b Pattern elettroforetico in SDS-PAGE di campioni individuali di latte a-La b-Lg k-Cn b-Cn as1-Cn as2-Cn b caseina contenuto 10,0 g/l 5,0 g/l 0,0 g/l Differenze individuali nel contenuto di caseina b nel latte di capra Normale livello di sintesi b nt mutazione A aa mutazione Wild type A1 CT (ex 9) 3’ UTR C GCAGTA (ex 7) Ala177Val D Sconosciuta Val207Asn E TCTTAT (ex 7) Ser166Tyr Gli alleli associati ad un normale contenuto di caseina b le latte di capra si originano per singole sostituzioni nucleotidiche Alleli “nullo” L’evento molecolare che caratteriza allele b-Cn 01 è la transizione CT al nucleotide 373 del 7° esone che determina uno stop codon prematuro, mentre quello che caratteriza l’allele b-Cn 0 è la delezione del 16 nucleotide del 7° esone che determina uno stop codon prematuro ~ 9 kb 5’ 3’ 1 2 3 4 5 6 7 8 Rappresentazione schematica del gene della caseina b 1 9 Premature stop CSN2 01 allele stop 5’ 3’ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PTC La presenza di uno stop codon prematuro può essere responsabile dell’apparente assenza di caseina b nel latte Dall’analisi dei trascritti del gene CSN2 di capra si evince che il livello di sintesi dell mRNA dell allele b-Cn 01 è 100 volte più basso di quello normale Dot blot 1 2 0.1 0.2 0.4 0.8 mg of total RNA 1: CSN2 01/01; 2: CSN2 A/A Rando et al., 1996. Two mutations might be responsible for the absence of b-casein in goat milk. In Proceeding International Conference on Animal Genetics, Animal Genetics 27, (Suppl.2), 31. Persuy et al., 1999. A single nucleotide deletion resulting in a premature stop codon is associated with marked reduction of transcripts from a goat b-casein null allele. Anim. Genet. 30, 444-451. Resa in formaggio: -20% Assenza di caseina b Tempo di coagulazione: triplo CROMOSOMA 6 ~12 kb CSN1S1 0 ~70 kb CSN3 CSN1S2 CSN2 50 ~95 kb 100 150 200 250 kb CSN1S2 gene ~ 18.5 kb 1 2 3 45 6 7 8 91011 12 13 1415 16 17 18 exons 5’ 3’ Rappresentazione schematica del gene CSN1S2 di capra . = regione 5’UT; = regione codificante il peptide leader; = regione codificante; = regione 3’ UT Livello di sintesi alto 2,5 g/l per allele Livello di sintesi medio 1,5 g/l per allele -40% Livello di sintesi apparentemente nullo ~0,0 g/l per allele - 100% Polimorfismo al locus CSN1S2 di capra A tutt’oggi sono stati identificati almeno 7 alleli associati a 3 differenti livelli di sintesi di caseina as2 nel latte di capra - CSN1S2 A, B, C, E e F - CSN1S2 D - CSN1S2 0 ~2.5 g/l per allele (-40)~1.5 g/l allele 0.0 g/l per allele a-La + b-Lg as1-CnF k-Cn as2-Cn D b-Cn as1-Cn as2-Cn _ 1 2 3 Pattern elettroforetici in SDS-PAGE di campioni individuali di latt e Lane 1: CSN1S2 A/A; Lane 2: CSN1S2 D/A; Lane 3: CSN1S2 0/0 Normale livello di sintesi di caseina 1 2 3 45 6 7 8 91011 12 13 1415 16 17 18 5’ as2 esoni 3’ Gli alleli CSN1S2A, B, C, E e F differiscono per singole mutazioni puntiformi e, conseguentemente, per singole sostituzioni aminoacidiche a livello proteico CSN1S2 allele Nucleotide substitutions Amino acid substitutions A B G A 10th nt of 9th exon Glu64 Lys A C A T 5th nt of 16th exon Lys167 Ile A F G C 13th nt of 3th exon Val7 Ile C E C G 83th nt of 16th exon Pro193 Arg Rappresentazione schematica del gene CSN1S2 di capra e delle differenti forme di mRNA prodotte da un individuo con genotipo CSN1S2 AA 1 2 3 45 6 7 8 91011 12 13 1415 16 17 18 5’ exons 3’ Correctly spliced mRNA (91.6%) 6 1 2 3 45 7 8 91011 12 13 1415 16 17 18 5’ exons 3’ mRNA lacking the 27 nucleotides of the exon 6 (8.4%) = 5’ untraslated region; = coding region; = region encoding signal peptide; = 3’ untraslated region Ramunno et al., (2001). Characterization of two new alleles at the goat CSN1S2 locus. Animal Genetics, 32 (5), 264-8. Allele CSN1S2 D L’analisi in SDS-PAGE di campioni individuali di latte ha evidenziato che la banda relativa alla variante as2-Cn D mostra una chiara riduzione di intensità se comparata con quella di altre varianti a tale locus (circa il 40%) Pattern elettroforetico in SDS-PAGE di un campione individuale di latte di una capra con genotipo CSN1S2 AD as2-Cn D as2-Cn A Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S2 D Livello intermedio di sintesi di caseina as2 5’ 3’ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 N84 E I N Q F Y Q K gacacatagagaagattcaatactggagtaaatattggtaattttctttctctctag AAT GAA ATC AAT CAG TTT TAT CAG AAG gacacatagagaagattcaatactggagtaaatattggtaattttctttctctctag AAT GAA ATC AAT CAG TTT TAT CAG AAG CSN1S2 A CSN1S2 D F P94 Q Y L Q Y P Y Q G P104 I V L N P W D TTC CCC CAG TAT CTC CAG TAT CCG TAT CAA GGT CCA ATT GTT TTG AAC CCA TAG GAT TTC CCC CAG TAT CTC CAG TAT CCG TAT CAA GGT CCA ATT GTT TTG AAC CCA TGG GAT Q V K114 R N A G P F T P T V124 CAG GTT AAG AGA AAT GCT GGC CCC TTT ACT CCC ACC GTG gtgagtgctgcttttttatatgttgtttcttgtttttt CAG GTT AAG AGA AAT GCT GGC CCC TTT A----------------------------------------------------------------tttttttttttctttctgtttttggtgaaggatgagttcaagataaagatttgtaaaatgtctagagataaaatgtcccaacg --------------------------------------------------------------- atgtctagagataaaatgtcccaacg . = regione 5’UT; = regione codificante il peptide leader; = regione codificante; as2-Cn D as2-Cn A = regione 3’ UT L’allele CSN1S2 D si caratterizza per una delezione di 106-bp che coinvolge gli ultimi 11 bp dell’esone 11 ed i primi 95 bp del successivo introne Rappresentazione schematica del gene CSN1S2 di capra e delle differenti forme di mRNA prodotte da un individuo con genotipo CSN1S2 DD 11 1 2 3 45 6 7 8 910 12 13 1415 16 17 18 5’ exons 3’ mRNA lacking exon 11 (82.1%) 6 1 2 3 45 11 7 8 910 12 13 1415 16 17 18 5’ exons 3’ mRNA lacking exons 6 and 11 (13.4%) 6 1 2 3 45 7 8 11 910 12 13 1415 16 17 18 5’ exons 3’ mRNA lacking exons 6, 8 and 11 (4.5%) = 5’ untraslated region; = coding region; = region encoding signal peptide; = 3’ untraslated region Ramunno et al., (2001). Characterization of two new alleles at the goat CSN1S2 locus. Animal Genetics, 32 (5), 264-8. L’allele CSN1S20 è un allele nullo essendo associato all’apparente assenza di caseina as2 ne latte Pattern elettroforetici in SDS-PAGE di campioni individuali di latte di tre capre con genotipo: CSN1S2 AA (line1), CSN1S2 A0 (line2) e CSN1S2 00 (line3) as2-Cn contenuto di caseina as2 ~5.0 g/l ~2.5 g/l 0.0 g/l La mutazione che caratterizza l’allele CSN1S2 0 La transizione di GA al nucleotide 80 dell’esone 11° è responsabile della conversione del codone TGG (codificante per un triptofano in posizione 110) nel codone di terminazione TAG La mutazione è responsabile della scomparsa del sito di restrizione dell’endonucleasi NcoI L’analisi per mezzo di Dot blot ha evidenziato che il livello di mRNA trascritto dall’allele CSN1S2 0 è circa 1/10 del valore normale Dot blot 1 2 0.1 0.2 0.4 0.8 mg of total RNA 1: CSN1S2 0/0; 2: CSN1S2 A/A Ramunno et al., (2001). An allele associated with a non dectable amount of as2 casein in goat milk. Animal Genetics, 32 (1), 19-26. Rappresentazione schematica del gene CSN1S2 di capra e delle differenti forme di mRNA prodotte da un individuo con genotipo CSN1S2 00 stop stop Correctly spliced mRNA (67.7%) (PTC) stop mRNA lacking exon 11 (13.3%) 11 stop stop mRNA lacking exon 6 (10.2%) (PTC) 6 stop mRNA lacking first 81 nt of the exon 11 (7.1%) 81 nt stop mRNA lacking exons 6,7,8,9,10,11 (1.0%) 6 7 8 910 11 stop mRNA lacking exons 3,4,5,6,7,8,9,10,11 (0.7%) 3 4 5 6 7 8 910 11 1213 = 5’ untraslated region; = coding region; = region encoding signal peptide; = 3’ untraslated region Principali caratteristiche del latte di donna a) Assenza di b lattoglobulina b) Basso contenuto caseinico e, in particolare, assenza di caseina as2 e tracce di casena as1 a-La Patter elettroforetico in SDS-PAGE di un campione individuale di latte di donna k-Cn b-Cn as1-Cn Caratteristiche del latte prodotto da capre con genotipo CSN1S2 0/0 Latte di capra senza caseina as2 Simile la latte di donna a-La b-Lg as1-Cn F k-Cn b-Cn as1-Cn as2-Cn 1 2 3 1: capra CSN1S2 A/A; 2: capra CSN1S2 0/0; 3: donna 55% αs1 Caseine 90% αs2 % pazienti allergici vs le singole 15% b 50% k 45% b-lg proteine 50% Lt 0% α-la Maggiore allergene PCR-RFLP Alleli A, B, N e F AS-PCR Allele 01 PCR Allele E ~700 bp ~200 bp M X/X 01/X 01/01 AA BB NN FF AB NA FA NB FB FN X/X X/E E/E ALLELI as1-Cn Razza M = Marker N° Alto 3,5 g/l Medio 1,1 g/l Basso 0,45 g/l Nullo 0,0 g/l Camosciata 0,624 0,171 0,140 0,062 32 Saanen 0,202 0,265 0,546 0,046 32 Nicastrese 0,626 0,019 0,343 0,009 102 Aspromontana 0,678 - 0,320 0,025 39 Maltese 0,750 - 0,375 - 8 Frequenze alleliche al locus as1-Cn nelle razze Nicastrese e Aspromontana: passato e presente 0,9 0,8 Contenuto alto caseina as1 Frequenze alleliche 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Ieri (anni 90) Oggi (2010) . .. Nicastrese Aspromontana 0,777 0,626 0,797 0,678 AS-PCR 01/01 Razza 01/X X/X M = Marker ALLELI b-Cn N° alto nullo Camosciata 1,00 0,00 57 Saanen 0,977 0,023 45 Nicastrese 0,969 0,031 102 Aspromontana 0,888 0,112 40 Maltese 1,00 0,00 6 Frequenze alleliche al locus b-Cn nelle razze Nicastrese e Aspromontana: passato e presente CSN1S2 PCR-RFLP Alleli D e 0 M Razza 0/0 0/D D/X X/X ALLELI as2-Cn N° alto medio nullo Camosciata 1,00 - - 55 Saanen 1,00 - - 39 Nicastrese 0,976 - 0,024 101 Aspromontana 0,925 - 0,075 40 Grigia 1,00 - - 19 Maltese 1,00 - - 7 Bianca 1,00 - - 9 Capestrina 1,00 - - 3 Frequenze alleliche al locus as1-Cn nella razza Camosciata: passato e presente Alto contenuto Rappresentazione schematica del gene CSN3 ~12 kb CSN1S1 0 ~70 kb 100 2432 5’ CSN3 CSN1S2 CSN2 50 ~95 kb 150 6800 1 2 65 62 2100 3 33 200 Cromosoma 6 250 kb intron size bp 1800 4 523 5 172 3’ exons size bp Gli alleli CSN3 A e B differiscono per una singola mutazione puntiforme AC al nt 415 del 4° esone responsabile della sostituzione aminoacidica AspAla La mutazione è responsabile della scomparsa del sito di restrizione dell’endonucleasi HinfI k-caseina bovina Le più comuni varianti genetiche della caseina k (A e B) hanno un’influenza diversa sul processo di produzione del formaggio Il latte contenente la k-caseina B coagula generalmente in tempi minori (Figura 2) e presenta una maggiore consistenza del coagulo (Figura 3). Resa in formaggio grana: BB vs AA → +10% Differenze individuali nel contenuto di caseina k nel latte di vacca Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 G di vacca Livello intermedio di caseina as1 insertion 371 N/N N/G G/E G M = Marker 5’ 3’ 53 63 33 39 24 24 24 24 . = regione 5’UT; 33 2454 42 24 42 27 24 154 45 385 exons size = regione codificante il peptide leader; = regione codificante; = regione 3’ UT Un evento mutazionale simile a quello che caratterizza l’allele CSN1S1 E di capra è stato ossservato anche per la specie bovina (allele CSN1S1 G) Rappresentazione schematica dell’allele CSN1S1 G di vacca 5’ 3’ 53 63 33 39 24 24 24 24 33 2454 42 24 42 27 24 154 45 exons size αs1 caseina bovina Identificati due livelli di sintesi di caseina αs1 Livello di sintesi normale ALLELE N 5,0 g/l per allele Livello di sintesi basso ALLELE G 2,2 g/l per allele - 56 % Genotipo Caratteristiche tecnologiche as1-Cn N normale ( 10 g/l) Elevata velocità di coagulazione e ridotta consistenza della cagliata as1-Cn G basso ( 4 g/l) Bassa velocità di coagulazione e notevole consistenza della cagliata Polimorfismo della lattoferrina caprina La lattoferrina (Lf) è una sieroproteina del peso di circa 80 Kda e con due siti di legame Fe3+ La concentrazione di lattoferrina varia da specie a specie Lattoferrina -- La lattoferrina costituisce il principale componente antimicrobico del colostro e svolge un ruolo determinante nel proteggere il neonato dalle malattie infettive Differenze individuali nell’attività antibatterica della lattoferrina nel latte di capra Saanen So Coreana Sono state individuate capre che producono latte contenente lattoferrina con maggiore attività antibatterica Sono stati individuati 82 siti polimorfici al locus della lattoferrina di capra E’ stato individuato un microsatellite polimorfo (ripetizione tandem CTGn, con n=6 o n=9) tra i nt 3543-3560 del 13° introne Nicastrese Siriana Un latte contenente “naturalmente” lattoferrina con maggiore attività antibatterica potrebbe essere impiegato per l’alimentazione infantile grazie al suo effetto protettivo sull’intestino del neonato Acil CoA:diacilglicerol aciltransferasi 1 (DGAT1) Il DGAT1 è un enzima microsomiale che svolge un ruolo centrale nel metabolismo dei glicolipidi a livello cellulare e catalizza l'ultimo step nella sintesi del triacilglicerolo utilizzando come substrato il diacilglicerolo (DAG) e l'acil CoA dell'acido grasso. Nel bovino è stata evidenziata una doppia sostituzione nucleotidica al 15° e 16° nt dell’8° esone: AAGC responsabile del cambiamento aa Lisina232Alanina È stato dimostrato che l’allele K232A è responsabile di una minore percentuale di grasso nel latte Stearoyl CoA denaturasi (SCD) Lo Stearoyl-CoA desaturase (SCD) è un enzima chiave nella biosintesi degli acidi grassi monoinsaturi (MUFA) e gioca un ruolo centrale nella regolazione del metabolismo degli acidi grassi catalizzando l’inserzione di un doppio legame tra gli atomi di carbonio 9 e 10 in una serie di acidi grassi saturi. In particolare, tale enzima è implicato nelle variazioni di acido linoleico coniugato (CLA) ACIDI GRASSI SATURI ACIDI GRASSI MONOINSATURI Nella specie bovina il gene codificante per la SCD è stato indicato come gene candidato per il cambiamento del rapporto acidi grassi saturi/insaturi ed è stato individuata un SNP non conservativo T→C al 231° nt dell’esone 5 VALINAALANINA T C L’allele C è stato associato a più alti contenuti di acidi grassi monoinsaturi nelle carcasse ed è positivamente correlato a indici più alti di desaturazione nel latte Incremento produzione latte Incremento tasso ematico ossitocina Livelli più elevati di mungibilità (< tempo di mungitura) Lollivier et al. 2002. Oxytocin and milk removal: two important sources of variation in milk production and milk quality during and between milkings. Reproduction Nutrition Development, 42:173–186 DraII PCR-RFLP G170→T . M= Marker 1000 bp; 1= OXT G/G; 2= OXT G/T; 3= OXT T/T C-966→ Genotyping T C/C=116; C/T=78; T/T=14 TOT: 208 C= 0,745; T=0,255 A-790→ G A/A=113; A/G=79; G/G=13 TOT: 205 A=0,744; G=0,256 G170→T Ex 2 G/G=115; G/T=78; T/T=12 TOT: 205 G=0,751; T=0,249 CowID Date Milk (mL) Time min Flusso (mL/sec) OXT prom 2 OXT prom 1 OXT ex2 Calving date lactation 109 04/06/08 8305 7,2 19,2 GA CT GT 03/06/2008 6 109 05/06/08 3033 6,9 7,3 GA CT GT 03/06/2008 6 109 06/06/08 8807 8,1 18,1 GA CT GT 03/06/2008 6 Animali controllati 200 date of birth 17/06/1998 17/06/1998 17/06/1998 Quantità di latte Tot. osservazioni: 41980 Velocità di Eiezione del latte Tot. osservazioni: 41980 y = mese + giorno + OP + stagione + OXT+ B(OXT) + e y = produzione di latte giornaliera, mese = effetto fisso del mese di produzione (12) giorno = effetto fisso giorno di lattazione OP = effetto fisso ordine di parto (7) stagione = effetto fisso stagione di parto (4) OX = effetto fisso del genotipo al gene OXT B = effetto casuale della bufala (169) e = errore Associazione con i C.F: ns Prof. N. Macciotta Uniss Numero di osservazioni 41980 Genotipo (ex 2) Media (kg) Se GG 8.70ab 0.22 TG 8.26a 0.28 TT 10.19b 0.70 TT vs TG = + 1,93 Kg (p=0,03) y = mese + giorno + OP + stagione + OXT+ B(OXT) + e y = % proteina mese = effetto fisso del mese di produzione (12) giorno = effetto fisso giorno di lattazione OP = effetto fisso ordine di parto (7) stagione = effetto fisso stagione di parto (4) OX = effetto fisso del genotipo al gene OXT B = effetto casuale della bufala (170) e = errore Prof. N. Macciotta Uniss Numero di Osservazioni: 4219 Genotipo (ex 2) Media Se TT 4.60a 0.02 TG 4.71b 0.02 GG 4.69ab 0.04 TG vs TT = + 0,11% (p=0,03) Il conto della Massaia Calcolo del PKM Mozzarella (Kg) = Latte (Kg) x 3,5 x (% Proteine) + 1,23 x (% Grasso) – 0,88 100 PKM giornaliero/animale con i valori medi produttivi dei controlli funzionali del campione 8,34 (Kg latte) x 3,5 x (4,67 %P) + 1,23 x (8,53 % G) – 0,88 = 2,16 Kg Mozzarella 100 In 270 giorni di lattazione si hanno: 583,2 Kg PKM giornaliero/animale Kg latte genotipo TT al locus OXT 10,19 (Kg latte) x 3,5 x (4,60 %P) + 1,23 x (9,34 % G) – 0,88 = 2,72 Kg Mozzarella 100 In 270 giorni di lattazione si hanno: 734,4 Kg Incremento produttivo del 25,9 % Geni candidati per il grasso • ACACA • DGAT1 • SCD y = mese + OP + DIM + stagione + azienda + ACACA+ B + e y = Kg latte mese = effetto fisso del mese di produzione (12) OP = effetto fisso ordine di parto (7) DIM= effetto fisso stadio di lattazione (10) stagione = effetto fisso stagione di parto (4) Azienda = effetto fisso azienda (2) ACACA= effetto fisso del genotipo al gene ACACA B = effetto casuale della bufala (170) e = errore Prof. N. Macciotta Uniss Individuazione T C nt 34 1 SNP Ex 1 Numero di osservazioni : 3858 Genotipo Media Se TT 9.62a 0.66 TC 6.32b 1.04 CC 6.59ab 1.02 TT vs TC= + 3,30Kg (p=0,04) Il conto della Massaia Calcolo del PKM Mozzarella (Kg) = Latte (Kg) x 3,5 x (% Proteine) + 1,23 x (% Grasso) – 0,88 100 PKM giornaliero/animale con i valori medi produttivi dei controlli funzionali del campione 8,34 (Kg latte) x 3,5 x (4,67 %P) + 1,23 x (8,53 % G) – 0,88 = 2,16 Kg Mozzarella 100 In 270 giorni di lattazione si hanno: 583,2 Kg PKM giornaliero/animale Kg latte genotipo TT al locus ACACA 9,62 (Kg latte) x 3,5 x (4,60 % P) + 1,23 x (8,36 % G) – 0,88 = 2,45 Kg Mozzarella 100 In 270 giorni di lattazione si hanno: 661,5 Kg Incremento produttivo del 13,4 % y = mese + giorno + OP + stagione + SCD+ B(SCD) + e No. osservazioni Contr. Gior. 43510 Genotipo Media Se AA 8.42ab 0.24 AC 9.18a 0.34 CC 7.15b 0.78 AC vs CC = + 2.02 Kg; (p=0,05) No. osservazioni Contr.Funz. 5473 Super dominanza Genotipo Media Se AA 8.46ab 0.17 AC 8.67a 0.20 CC 7.46b 0.46 AC vs CC = + 1.21Kg (p=0,03) Il conto della Massaia Calcolo del PKM Mozzarella (Kg) = Latte (Kg) x 3,5 x (% Proteine) + 1,23 x (% Grasso) – 0,88 100 PKM giornaliero/animale con i valori medi produttivi dei controlli funzionali del campione 8,34 (Kg latte) x 3,5 x (4,67 %P) + 1,23 x (8,53 % G) – 0,88 = 2,16 Kg Mozzarella 100 In 270 giorni di lattazione si hanno: 583,2 Kg PKM giornaliero/animale Kg latte genotipo AC al locus SCD Da 8,67 a 9,18 (Kg latte) x 3,5 x (4,60 %P) + 1,23 x (8,78 % G) – 0,88 = da 2,25 a 2,38 Kg Mozzarella 100 In 270 giorni di lattazione si hanno: 607,5 a 642,6 Kg Incremento produttivo dal 4,2 % al 10,2 % GENI CANDIDATI CHE CONTROLLANO LA PRODUZIONE DI CARNE LEPTINA Ormone proteico di 167 aminoacidi Secreto soprattutto dagli adipociti Regola il metabolismo energetico Ingestione alimentare Ripartizione dei nutrienti fra i diversi tessuti Deposizione del grasso Il gene codificante è stato proposto come candidato per la produzione quanti-qualitativa di carne Anche nell’uomo, mutazioni del gene Lep sono associate ad obesità • Casi di mancanza congenita di leptina • Casi in cui si verifica una mutazione sul gene che codifica per il recettore della leptina(delezione G a livello del codone 133) GENE MAGGIORE ??? IL GENE LEP NEI BOVINI Mappato sul chr 4 costituito da 3 esoni 1 2 3 3’ 5’ Esone 2: Esone 3: AT Tyr/Phe nt 305 C T Arg/Cys CT Val/Ala nt 252 nt 140 La sostituzione Arg(C) Cys(T) induce un’alterazione della struttura della proteina perdita dei siti di legame col recettore perdita di funzionalità aumento di mRNA Allele T associato a carcasse più grasse FREQUENZE ALLELICHE Più grasso Razza n. LepC LepT Blonde d’Aquitaine 60 0.717 0.283 Blu Belga 17 0.882 0.118 Piemontese 79 0.755 0.245 Frisona I. 52 0.529 0.471 Valdostana p.r. 42 0.619 0.381 - E’ una proteina della superfamiglia dei fattori di trasformazione-crescita ß (TGF-ß), regolatori della crescita e della differenziazione delle cellule muscolari; La miostatina reprime attivamente la crescita muscolare e un suo mancato funzionamento determina una perdita di controllo della crescita muscolare Gene della miostatina GDF8 (~ 6700 bp ) I ex 373 nt 1838 nt II ex 374 nt 2033 nt III ex 381 nt 2 Sono state individuate finora 6 diverse mutazioni che inattivano la proteina in varie razze 3° ex del gene GDF8 mappa sul Cromosoma 2 Primi soggetti individuati nel 1993 127 nt G T Sostituzione Glu 291/stop codon 3° ex del gene GDF8 Bianca Blu Belga 74° nt Stop codon 11 bp prematuro Piemontese 191° nt G A Tyr/Cys FENOTIPO Intermedio Normale PESO VIVO Kg 645,066,1 700,069,3 CARCASSA Kg 414,146,6 445,525,9 63,92,6 RESA % 64,21,6 CARATTERE IPERTROFIA NORM. INTER. 9 7 cm 125,33,8 124,13,4 IPERT. 4 116,65,8 124,63,3 LARILEI cm 133,34,0 128,86,6 cm 36,52,9 39,51,3 LARDOR cm 26,6,2,1 27,32,9 ALGAR ALCROCE 25,63,5 41,31,3 Medie stimate dell’area delle fibre (mm2) nei diversi muscoli e nei due genotipi. Genotipo Tipo di muscolo Totale LD PM Eterozigote ST(sem tend) 3759,00 2606,00 1707,00 2691,00 Omozigote nor. 3845,00 3292,00 2658,00 3265,00 Totale 3802,00 2949,00 2182,00 Normale Psoas major Intermedio
