allegato

Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998
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INFEZIONE DA CAPRINE HERPESVIRUS 1
E MORTALITÀ NEONATALE IN CAPRETTI
MARIA TEMPESTA, ANNAMARIA PRATELLI, DOMENICO BUONAVOGLIA*, GRAZIA GRECO
Dipartimento di Sanità e benessere degli animali - Sezione Malattie Infettive - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Bari
Strada Provinciale per Casamassima Km. 3 - 70010 Valenzano (BA)
*Istituto Malattie Infettive, Profilassi e Polizia Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Messina
Viene riportato un episodio di mortalità neonatale in capretti osservato in un allevamento di 200 capre di razza maltese ubicato in Puglia.
Gli animali colpiti, di circa 1 settimana d’età, prima della morte hanno presentato abbattimento, febbre, diarrea e mancata
assunzione del latte. L’esame anatomo-patologico ha evidenziato grave enterite, necrosi epatica e polmonite.
Dai campioni di organi di due capretti è stato possibile isolare uno stipite erpetico tipizzato come Caprine herpesvirus 1
(CpHV.1) sulla base di prove di virus-neutralizzazione con un siero monospecifico per CpHV.1 e con la polymerase chain reaction (PCR).
Summary
The Authors report an outbreak of neonatal mortality in a herd of 200 maltesian cross bred goats in Puglia (South Italy).
Several one-week-old kids showed pirexia, depression, abdominal pain and inappetence and died. Gross lesions were evident
throughout the gut, liver and lungs. A herpesvirus was isolated on cell cultures from samples of internal organs of two kids.
The isolated virus was identified as Caprine herpesvirus 1 (CpHV.1) by means of virus-neutralization test using a goat
monospecific to CpHV.1 serum and Polymerase Chain Reaction (PCR).
INTRODUZIONE
Caprine herpesvirus 1 (CpHV.1) causa nei capretti neonati infezioni sistemiche letali con lesioni più evidenti a
carico dell’apparato digerente, mentre negli animali adulti
provoca infezioni subcliniche con rare manifestazioni a
carico dell’apparato respiratorio (polmonite) e genitale
(vulvovaginiti e balanopostiti).
L’infezione sperimentale, per via venosa od intranasale,
può causare aborto1,2 mentre, in corso di infezione naturale, l’aborto è stato descritto solo una volta3.
CpHV.1, analogamente ad altri virus erpetici, determina
infezioni latenti, ma a differenza degli altri herpesvirus, si
riattiva con difficoltà sia in condizioni naturali che sperimentali4,5,6,7,8,9.
Le segnalazioni di episodi di malattia naturale sono molto
scarsi. Nei capretti il virus è stato isolato per la prima volta
nel 1974 da Saito et al. in un allevamento di capre in
California10 e successivamente da Mettler et al. (1979) in
Svizzera11 e da Van der Lugt e Randles (1993) in Sudafrica12.
In tutti gli episodi segnalati, la malattia è stata osservata
in capretti di 1-2 settimane di età i quali presentavano
depressione, dolori addominali, diarrea, inappetenza e, in
alcuni casi, febbre e difficoltà respiratorie. A livello anatomo-patologico erano state costantemente evidenziate aree
ulcerativo-necrotiche localizzate sulla mucosa del piccolo
e grosso intestino.
Nella presente nota viene descritto l’isolamento di
CpHV.1 da capretti di 1 settimana di età morti con patologia gastroenterica.
MATERIALI E METODI
CASO CLINICO
L’indagine è stata condotta in un gregge di 200 capre di
razza maltese situato in Puglia. Nell’allevamento da diverso tempo erano segnalati casi di aborto e numerosi episodi
di mortalità neonatale. In particolare nel periodo febbraiomarzo 1998, erano morti 27 capretti di pochi giorni d’età.
Due soggetti che avevano presentato ipertermia, dolori
addominali, inappetenza, tendenza al decubito ed erano
morti dopo 2 giorni dall’inizio della sintomatologia, sono
stati sottoposti ad esame autoptico e a indagini virologiche
e batteriologiche.
SPECIE MINORI
Riassunto
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Infezione da Caprine herpesvirus 1 e mortalità neonatale in capretti
Il quadro anatomo-patologico era caratterizzato da
grave flogosi a carico del tratto intestinale (Fig. 1), con
particolare interessamento del cieco, e dalla presenza di
focolai necrotici sulla superficie epatica. Era inoltre presente glomerulonefrite emorragica (Fig. 2) e una grave
forma di polmonite (Fig. 3).
Campioni di cervello, timo, polmoni, fegato, reni, intestino tenue e cieco, vescica, cuore e milza di ciascun soggetto sono stati utilizzati per gli esami batteriologici e
virologici.
FIGURA 1 - Infezione da CpHV.1: enterite.
Esami batteriologici
I campioni sono stati sottoposti ad esami batteriologici
per la ricerca di batteri aerobi ed anaerobi, Mycoplasma
spp. e Chlamydia spp.
Esami virologici
Cellule: sono state utilizzate cellule in linea continua di
rene bovino Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) sviluppate in terreno minimo essenziale di Dulbecco (D-MEM)
addizionato del 10% di siero fetale bovino.
Campioni: due grammi di ciascun campione sono stati
omogenati al 20% in terreno D-MEM e centrifugati a
2000 × g per 30 minuti a +4°C. Il surnatante di ciascun
campione è stato inoculato su monostrati di cellule
MDBK sviluppate in piastre a 24 pozzetti utilizzando due
pozzetti per ciascun campione. Le piastre sono state poste
ad incubare a 37°C per 7 giorni in termostato a CO2 osservandole ogni giorno per valutare l’eventuale comparsa di
effetto citopatico (ECP). Trascorso tale periodo, in assenza
di ECP, le cellule sono state sottoposte a 3 cicli di congelamento e scongelamento e con il criolisato è stato effettuato
un passaggio successivo. Monostrati cellulari inoculati con
i campioni in esame sono stati colorati con ematossilinaeosina per evidenziare eventuali inclusioni cellulari.
Identificazione del virus isolato
L’identificazione del virus isolato è stata effettuata con
prove di virus-neutralizzazione e con la Polymerase Chain
Reaction (PCR).
Le prove di virus-neutralizzazione sono state eseguite
solo sugli stipiti isolati dai campioni dei polmoni dei due
capretti in quanto, in base alle caratteristiche dell’ECP, da
tutti gli organi era stato isolato lo stesso virus. La PCR è
stata invece eseguita sugli omogenati di tutti gli organi.
Virusneutralizzazione
FIGURA 2 - Infezione da CpHV.1: glomerulonefrite.
Nella prova sono stati utilizzati un siero di capra monospecifico per CpHV.1, gli stipiti virali isolati dai polmoni e
lo stipite BA.1 di CpHV.19. Diluizioni logaritmiche in base
10 di ciascun virus, da 1:2 a 1:2 ×10-7, sono state mescolate
con un egual volume del siero di capra positivo per
CpHV.1 in piastre a 96 pozzetti, utilizzando 2 pozzetti per
ciascuna miscela. La prova è stata ripetuta anche con un
siero di capra privo di anticorpi per CpHV.1. Le piastre
sono state incubate per 60’ a temperatura ambiente e successivamente, in ogni pozzetto, sono state aggiunte 20.000
cellule MDBK in 100 µl. La lettura della prova è stata eseguita dopo 4 giorni di incubazione ed i risultati sono stati
espressi come unità logaritmiche di virus neutralizzato.
PCR
FIGURA 3 - Infezione da CpHV.1: polmonite.
Sugli omogenati degli organi dei capretti è stata eseguita
la PCR secondo quanto descritto in precedenza13.
Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998
FIGURA 4 - Monostrato di cellule MDBK infettate con CpHV.1: caratteristico ECP.
SPECIE MINORI
In breve, il DNA virale è stato estratto utilizzando il
QIAamp Blood Kit (Qiagen GmbH, Germany) ed è stato
amplificato utilizzando due primers corrispondenti alle
sequenze pubblicate 759-779 e 1172-1154 del gene che
codifica per la glicoproteina G (gC)14 rispettivamente 5’AGGGCGCCGGTGGATGCTCTG-3’ (CAP III) e 5’GGCGGGCGGTGCGTCGTGA-3’ (CAP IV). La coppia di primers dà origine ad un prodotto di amplificazione
di 414 basi appaiate (bp).
La PCR è stata effettuata in un volume finale di 25 µl
contenenti 5 µl di DNA, 2,5 µl di tampone PCR 10x
(Perkin Elmer Cetus, USA), 1,5 µM di MgCl2, 2,5 µl di glicerolo, 200 µM di ciascun primer, 1,25 mM di ciascuno
dei quattro oligonucleotidi trifosfati, 2,5 U di Amplitaq
GOLD Polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA). La PCR è
stata condotta in un DNA Thermal Cycler per 35 cicli
costituiti da: denaturazione a 94°C per 1’, allineamento a
65°C per 1,30’’ ed estensione a 72°C per 1’. I cicli sono
stati preceduti da un ciclo iniziale di denaturazione 96°C
per 10’.
Dieci µl di amplificato sono stati posti su gel di agarosio
al 2% e sottoposti ad elettroforesi a 50V per 90’. Le bande
di amplificazione sono state visualizzate su transilluminatore a UV dopo colorazione con etidio bromuro.
Nella prova è stato incluso il DNA di CpHV.1 come
controllo positivo ed un DNA estraneo come controllo
negativo.
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RISULTATI
Esami batteriologici
Nei campioni di intestino è stato evidenziato
Clostridium perfringens, mentre in tutti gli altri organi gli
esami batteriologici non hanno permesso di isolare germi
patogeni.
Le prove hanno fornito esito negativo per Mycoplasma
spp. e per Chlamydia spp.
FIGURA 5 - Monostrato di cellule MDBK infettate con CpHV.1: tipici
inclusi nucleari tipo A di Cowdry.
Esami virologici
Nei monostrati di cellule MDBK inoculati con le
sospensioni di intestino tenue ed intestino cieco, vescica,
rene, cervello, cuore e polmone, 48 ore dopo l’inoculazione, è comparso un ECP caratterizzato da cellule arrotondate, sincizi e successiva lisi cellulare (Fig. 4). Nei monostrati cellulari inoculati con le sospensioni di fegato, timo e
milza, l’ECP è comparso al secondo passaggio. Nelle cellule colorate con ematossilina/eosina sono stati evidenziati
inclusi intranucleari tipo A di Cowdry (Fig. 5).
I virus isolati sono stati identificati come CpHV.1 in
base ai risultati delle prove di virus-neutralizzazione in
quanto il siero monospecifico anti CpHV.1 è stato in
grado di ridurre il titolo infettante sia degli isolati che del
ceppo BA.1, di 5 unità logaritmiche.
La PCR ha prodotto bande di amplificazione, delle
dimensioni di 414 bp, in tutti gli omogenati d’organo
esaminati e nel campione di DNA di controllo mentre
non ha amplificato il DNA estraneo (controllo negativo)
(Fig. 6).
FIGURA 6 - Elettoforesi di prodotti amplificati con la PCR: A - marker DNA pBR322 xAvaII/EcoRI; B - stipite BA.1 di CpHV.1; C/D - omogenati
di polmone dei due capretti; E - controllo negativo.
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Infezione da Caprine herpesvirus 1 e mortalità neonatale in capretti
DISCUSSIONE
Diverse indagini sierologiche condotte in Italia, hanno
evidenziato una significativa diffusione dell’infezione da
CpHV.1 negli allevamenti15,16,17,18.
A fronte della elevata presenza di anticorpi, in Italia non
sono tuttavia segnalati casi clinici di malattia riconducibili
ad infezione da CpHV.1 sia nelle capre che nei capretti.
Questo dato trova conferma anche in altri Paesi, e, in
generale, le segnalazioni di patologia, soprattutto nei
capretti, sono molto scarse 3,10,11,12.
È probabile che questa apparente discrepanza sia esclusivamente imputabile ad errate diagnosi in quanto, le
numerose patologie neonatali (micoplasmosi, clamidiosi,
clostridiosi, colibacillosi, ecc.), sono caratterizzate da quadri clinici molto simili a quelli che si possono osservare in
corso di infezione da CpHV.1.
L’episodio di mortalità neonatale dei capretti descritto
nella presente nota apporta, quindi, un ulteriore contributo alla conoscenza degli aspetti diagnostici dell’infezione
da CpHV.1 e può fornire ai veterinari importanti elementi
aggiuntivi per la diagnosi differenziale delle patologie neonatali dei capretti.
Parole chiave
BIbliografia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Caprine herpesvirus 1, capretto, mortalità.
Key words
13.
14.
Caprine herpesvirus 1, kid, mortality.
15.
Abbreviazioni
16.
CpHV.1: Caprine herpesvirus 1. MDBK: Madin Darby
Bovine Kidney. D-MEM: Dulbecco Minimum Essential
Medium. ECP: Effetto citopatico. PCR: Polymerase Chain
Reaction.
17.
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