Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998 59 INFEZIONE DA CAPRINE HERPESVIRUS 1 E MORTALITÀ NEONATALE IN CAPRETTI MARIA TEMPESTA, ANNAMARIA PRATELLI, DOMENICO BUONAVOGLIA*, GRAZIA GRECO Dipartimento di Sanità e benessere degli animali - Sezione Malattie Infettive - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Bari Strada Provinciale per Casamassima Km. 3 - 70010 Valenzano (BA) *Istituto Malattie Infettive, Profilassi e Polizia Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Messina Viene riportato un episodio di mortalità neonatale in capretti osservato in un allevamento di 200 capre di razza maltese ubicato in Puglia. Gli animali colpiti, di circa 1 settimana d’età, prima della morte hanno presentato abbattimento, febbre, diarrea e mancata assunzione del latte. L’esame anatomo-patologico ha evidenziato grave enterite, necrosi epatica e polmonite. Dai campioni di organi di due capretti è stato possibile isolare uno stipite erpetico tipizzato come Caprine herpesvirus 1 (CpHV.1) sulla base di prove di virus-neutralizzazione con un siero monospecifico per CpHV.1 e con la polymerase chain reaction (PCR). Summary The Authors report an outbreak of neonatal mortality in a herd of 200 maltesian cross bred goats in Puglia (South Italy). Several one-week-old kids showed pirexia, depression, abdominal pain and inappetence and died. Gross lesions were evident throughout the gut, liver and lungs. A herpesvirus was isolated on cell cultures from samples of internal organs of two kids. The isolated virus was identified as Caprine herpesvirus 1 (CpHV.1) by means of virus-neutralization test using a goat monospecific to CpHV.1 serum and Polymerase Chain Reaction (PCR). INTRODUZIONE Caprine herpesvirus 1 (CpHV.1) causa nei capretti neonati infezioni sistemiche letali con lesioni più evidenti a carico dell’apparato digerente, mentre negli animali adulti provoca infezioni subcliniche con rare manifestazioni a carico dell’apparato respiratorio (polmonite) e genitale (vulvovaginiti e balanopostiti). L’infezione sperimentale, per via venosa od intranasale, può causare aborto1,2 mentre, in corso di infezione naturale, l’aborto è stato descritto solo una volta3. CpHV.1, analogamente ad altri virus erpetici, determina infezioni latenti, ma a differenza degli altri herpesvirus, si riattiva con difficoltà sia in condizioni naturali che sperimentali4,5,6,7,8,9. Le segnalazioni di episodi di malattia naturale sono molto scarsi. Nei capretti il virus è stato isolato per la prima volta nel 1974 da Saito et al. in un allevamento di capre in California10 e successivamente da Mettler et al. (1979) in Svizzera11 e da Van der Lugt e Randles (1993) in Sudafrica12. In tutti gli episodi segnalati, la malattia è stata osservata in capretti di 1-2 settimane di età i quali presentavano depressione, dolori addominali, diarrea, inappetenza e, in alcuni casi, febbre e difficoltà respiratorie. A livello anatomo-patologico erano state costantemente evidenziate aree ulcerativo-necrotiche localizzate sulla mucosa del piccolo e grosso intestino. Nella presente nota viene descritto l’isolamento di CpHV.1 da capretti di 1 settimana di età morti con patologia gastroenterica. MATERIALI E METODI CASO CLINICO L’indagine è stata condotta in un gregge di 200 capre di razza maltese situato in Puglia. Nell’allevamento da diverso tempo erano segnalati casi di aborto e numerosi episodi di mortalità neonatale. In particolare nel periodo febbraiomarzo 1998, erano morti 27 capretti di pochi giorni d’età. Due soggetti che avevano presentato ipertermia, dolori addominali, inappetenza, tendenza al decubito ed erano morti dopo 2 giorni dall’inizio della sintomatologia, sono stati sottoposti ad esame autoptico e a indagini virologiche e batteriologiche. SPECIE MINORI Riassunto 60 Infezione da Caprine herpesvirus 1 e mortalità neonatale in capretti Il quadro anatomo-patologico era caratterizzato da grave flogosi a carico del tratto intestinale (Fig. 1), con particolare interessamento del cieco, e dalla presenza di focolai necrotici sulla superficie epatica. Era inoltre presente glomerulonefrite emorragica (Fig. 2) e una grave forma di polmonite (Fig. 3). Campioni di cervello, timo, polmoni, fegato, reni, intestino tenue e cieco, vescica, cuore e milza di ciascun soggetto sono stati utilizzati per gli esami batteriologici e virologici. FIGURA 1 - Infezione da CpHV.1: enterite. Esami batteriologici I campioni sono stati sottoposti ad esami batteriologici per la ricerca di batteri aerobi ed anaerobi, Mycoplasma spp. e Chlamydia spp. Esami virologici Cellule: sono state utilizzate cellule in linea continua di rene bovino Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) sviluppate in terreno minimo essenziale di Dulbecco (D-MEM) addizionato del 10% di siero fetale bovino. Campioni: due grammi di ciascun campione sono stati omogenati al 20% in terreno D-MEM e centrifugati a 2000 × g per 30 minuti a +4°C. Il surnatante di ciascun campione è stato inoculato su monostrati di cellule MDBK sviluppate in piastre a 24 pozzetti utilizzando due pozzetti per ciascun campione. Le piastre sono state poste ad incubare a 37°C per 7 giorni in termostato a CO2 osservandole ogni giorno per valutare l’eventuale comparsa di effetto citopatico (ECP). Trascorso tale periodo, in assenza di ECP, le cellule sono state sottoposte a 3 cicli di congelamento e scongelamento e con il criolisato è stato effettuato un passaggio successivo. Monostrati cellulari inoculati con i campioni in esame sono stati colorati con ematossilinaeosina per evidenziare eventuali inclusioni cellulari. Identificazione del virus isolato L’identificazione del virus isolato è stata effettuata con prove di virus-neutralizzazione e con la Polymerase Chain Reaction (PCR). Le prove di virus-neutralizzazione sono state eseguite solo sugli stipiti isolati dai campioni dei polmoni dei due capretti in quanto, in base alle caratteristiche dell’ECP, da tutti gli organi era stato isolato lo stesso virus. La PCR è stata invece eseguita sugli omogenati di tutti gli organi. Virusneutralizzazione FIGURA 2 - Infezione da CpHV.1: glomerulonefrite. Nella prova sono stati utilizzati un siero di capra monospecifico per CpHV.1, gli stipiti virali isolati dai polmoni e lo stipite BA.1 di CpHV.19. Diluizioni logaritmiche in base 10 di ciascun virus, da 1:2 a 1:2 ×10-7, sono state mescolate con un egual volume del siero di capra positivo per CpHV.1 in piastre a 96 pozzetti, utilizzando 2 pozzetti per ciascuna miscela. La prova è stata ripetuta anche con un siero di capra privo di anticorpi per CpHV.1. Le piastre sono state incubate per 60’ a temperatura ambiente e successivamente, in ogni pozzetto, sono state aggiunte 20.000 cellule MDBK in 100 µl. La lettura della prova è stata eseguita dopo 4 giorni di incubazione ed i risultati sono stati espressi come unità logaritmiche di virus neutralizzato. PCR FIGURA 3 - Infezione da CpHV.1: polmonite. Sugli omogenati degli organi dei capretti è stata eseguita la PCR secondo quanto descritto in precedenza13. Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998 FIGURA 4 - Monostrato di cellule MDBK infettate con CpHV.1: caratteristico ECP. SPECIE MINORI In breve, il DNA virale è stato estratto utilizzando il QIAamp Blood Kit (Qiagen GmbH, Germany) ed è stato amplificato utilizzando due primers corrispondenti alle sequenze pubblicate 759-779 e 1172-1154 del gene che codifica per la glicoproteina G (gC)14 rispettivamente 5’AGGGCGCCGGTGGATGCTCTG-3’ (CAP III) e 5’GGCGGGCGGTGCGTCGTGA-3’ (CAP IV). La coppia di primers dà origine ad un prodotto di amplificazione di 414 basi appaiate (bp). La PCR è stata effettuata in un volume finale di 25 µl contenenti 5 µl di DNA, 2,5 µl di tampone PCR 10x (Perkin Elmer Cetus, USA), 1,5 µM di MgCl2, 2,5 µl di glicerolo, 200 µM di ciascun primer, 1,25 mM di ciascuno dei quattro oligonucleotidi trifosfati, 2,5 U di Amplitaq GOLD Polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA). La PCR è stata condotta in un DNA Thermal Cycler per 35 cicli costituiti da: denaturazione a 94°C per 1’, allineamento a 65°C per 1,30’’ ed estensione a 72°C per 1’. I cicli sono stati preceduti da un ciclo iniziale di denaturazione 96°C per 10’. Dieci µl di amplificato sono stati posti su gel di agarosio al 2% e sottoposti ad elettroforesi a 50V per 90’. Le bande di amplificazione sono state visualizzate su transilluminatore a UV dopo colorazione con etidio bromuro. Nella prova è stato incluso il DNA di CpHV.1 come controllo positivo ed un DNA estraneo come controllo negativo. 61 RISULTATI Esami batteriologici Nei campioni di intestino è stato evidenziato Clostridium perfringens, mentre in tutti gli altri organi gli esami batteriologici non hanno permesso di isolare germi patogeni. Le prove hanno fornito esito negativo per Mycoplasma spp. e per Chlamydia spp. FIGURA 5 - Monostrato di cellule MDBK infettate con CpHV.1: tipici inclusi nucleari tipo A di Cowdry. Esami virologici Nei monostrati di cellule MDBK inoculati con le sospensioni di intestino tenue ed intestino cieco, vescica, rene, cervello, cuore e polmone, 48 ore dopo l’inoculazione, è comparso un ECP caratterizzato da cellule arrotondate, sincizi e successiva lisi cellulare (Fig. 4). Nei monostrati cellulari inoculati con le sospensioni di fegato, timo e milza, l’ECP è comparso al secondo passaggio. Nelle cellule colorate con ematossilina/eosina sono stati evidenziati inclusi intranucleari tipo A di Cowdry (Fig. 5). I virus isolati sono stati identificati come CpHV.1 in base ai risultati delle prove di virus-neutralizzazione in quanto il siero monospecifico anti CpHV.1 è stato in grado di ridurre il titolo infettante sia degli isolati che del ceppo BA.1, di 5 unità logaritmiche. La PCR ha prodotto bande di amplificazione, delle dimensioni di 414 bp, in tutti gli omogenati d’organo esaminati e nel campione di DNA di controllo mentre non ha amplificato il DNA estraneo (controllo negativo) (Fig. 6). FIGURA 6 - Elettoforesi di prodotti amplificati con la PCR: A - marker DNA pBR322 xAvaII/EcoRI; B - stipite BA.1 di CpHV.1; C/D - omogenati di polmone dei due capretti; E - controllo negativo. 62 Infezione da Caprine herpesvirus 1 e mortalità neonatale in capretti DISCUSSIONE Diverse indagini sierologiche condotte in Italia, hanno evidenziato una significativa diffusione dell’infezione da CpHV.1 negli allevamenti15,16,17,18. A fronte della elevata presenza di anticorpi, in Italia non sono tuttavia segnalati casi clinici di malattia riconducibili ad infezione da CpHV.1 sia nelle capre che nei capretti. Questo dato trova conferma anche in altri Paesi, e, in generale, le segnalazioni di patologia, soprattutto nei capretti, sono molto scarse 3,10,11,12. È probabile che questa apparente discrepanza sia esclusivamente imputabile ad errate diagnosi in quanto, le numerose patologie neonatali (micoplasmosi, clamidiosi, clostridiosi, colibacillosi, ecc.), sono caratterizzate da quadri clinici molto simili a quelli che si possono osservare in corso di infezione da CpHV.1. L’episodio di mortalità neonatale dei capretti descritto nella presente nota apporta, quindi, un ulteriore contributo alla conoscenza degli aspetti diagnostici dell’infezione da CpHV.1 e può fornire ai veterinari importanti elementi aggiuntivi per la diagnosi differenziale delle patologie neonatali dei capretti. Parole chiave BIbliografia 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Caprine herpesvirus 1, capretto, mortalità. Key words 13. 14. Caprine herpesvirus 1, kid, mortality. 15. Abbreviazioni 16. CpHV.1: Caprine herpesvirus 1. MDBK: Madin Darby Bovine Kidney. D-MEM: Dulbecco Minimum Essential Medium. ECP: Effetto citopatico. PCR: Polymerase Chain Reaction. 17. 18. 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