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CAP. 1 CAP. 2 La microbiologia di supporto alla gestione: rapidità ed innovazione dott.ssa de Lellis Laura HeraTECH- Sasso Marconi (BOLOGNA) CAP. 3 CAP. 4 CAP. 5 LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE MICROBIOLOGIA «TRADIZIONALE»… o o ∆ o o o o o o o o o o o o Parametri microbiologici (per requisiti minimi) Escherichia coli Enterococchi . Parametri indicatori Batteri coliformi Clostridium perfringens Conte a 37 e 22°C Parametri supplementari Alghe Batteriofagi anti E.coli -Nematodi a vita libera Salmonella Funghi e Lieviti Pseudomonas aeruginosa e Stafilococchi Protozoi e altri elementi figurati Attinomiceti Spore di clostridi solfito-riduttori Legionella MICROBIOLOGIA «INNOVATIVA» LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE 2002 LABORATORI DISLOCATI IN PIU’ SEDIUN SETTORE MICROBIOLOGIA per LABORATORIO 2007-2008 3 LABORATORI PRINCIPALI UN SETTORE UNICO DI MICROBIOLOGIA • SALMONELLE DETERMINAZIONI ANNUE POTABILI+NATURALI+REFLUE circa 500 ACQUE POTABILI-NATURALI 60000 determinazioni ACQUE REFLUE-FANGHI 5500 determinazioni ARIA-SUPERFICI 2500 determinazioni • TOSSICITA’ DETERMINAZIONI ANNUE POTABILI+NATURALI+REFLUE circa 2200 2017 LABORATORI HERATECH LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE 1 2 3 ANALISI TOSSICITA’ ACQUE POTABILI E REFLUE CON BATTERI BOLUMINESCENTIANALIZZATORE EASYCHEMTOX AUTOMAZIONE NELLA GESTIONE DEI CAMPIONI E DEI RISULTATI ANALITICI ANALISI SALMONELLA IN PCR LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi Salmonella nelle acque METODO TRADIZIONALE APAT IRSA 7080/ RAPPORTI ISTISAN 07/5 ISSA 011A FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA CRESCITA A 37°C (24h) PASSAGGIO IN RV (24h) PRIMA SEMINA SU PIASTRA DI HEKTOEN (24h) SECONDA SEMINA SU PIASTRA DI HEK (24h) IDENTIFICAZIONE E CONFERMA METODO ALTERNATIVO PCR - RT FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA CRESCITA A 37°C (24h) REAZIONE DI PCR (3h tot) COLONIE SOSPETTE 4 giorni per campioni negativi 6-7 giorni per campioni positivi Test di conferma con terreni selettivi e test biochimici e/o sierologici con fasi a cadenza giornaliera Conferme non necessarie Elevata specificità Maggiore sensibilità 0.1 UFC LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi Salmonella nelle acque La PCR (Polymerase chain reaction) è una metodica sensibile, veloce e versatile che consente di ottenere grosse quantità di materiale genetico a partire da piccole quantità di DNA. Permette di analizzare specifiche sequenze che altrimenti costituirebbero bersagli molto rari in un genoma complesso. E’ una reazione enzimatica di amplificazione in vitro di un segmento di DNA ottenuta tramite l’enzima Taq polimerasi a partire da una coppia di primers (oligonucleotidi), sequenze di DNA a singolo filamento necessari per l’innesco della reazione. LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE REAL-TIME PCR (PCR Quantitativa) Una zona specifica di DNA viene bersagliata con due oligonucleotidi che amplificano, tramite la reazione polimerasica, la zona stessa copiandola un enorme numero di volte e rendendola visibile e manipolabile per l’analisi LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi Salmonella nelle acque Nel nostro sistema, automatizzato, la rilevazione dei frammenti amplificati avviene mediante registrazione dell’ emissione di fluorescenza durante la reazione di amplificazione, per ibridazione di sonde altamente specifiche- molecular beacons - marcate con molecole fluorescenti. Nel momento in cui si appaiano alla sequenza complementare, si aprono ed emettono il segnale di fluorescenza per allontanamento del fluoroforo dal suo inibitore (quencher): SI SEGUE ISTANTE PER ISTANTE L’INDIVIDUAZIONE DEL PATOGENO Le prove sperimentali per valutare le prestazioni della PCR Real Time utilizzando il termociclatore Stratagene Mx3005P e il kit Rapid-Pathogen Detection system evidenziano: • la maggiore sensibilità della tecnica • rapidità-esito dell’analisi di campioni di acqua con notevole anticipo rispetto alla metodica tradizionale. LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE PCR Real time per analisi Salmonella Accuratezza: elevata specificità e sensibilità con livelli di rilevazione migliori di quelli del metodo di riferimento Rapidità nell’ottenimento del risultato (una notte di arricchimento e meno di tre ore per la reazione di detection) Facilità d’uso: kit di analisi e software semplice, utilizzo di strips pratiche, adatte ad un impiego routinario in laboratorio, tutte le fasi visualizzabili a video, risultati che non necessitano di interpretazioni soggettive Migliore gestione dei campioni vista la possibilità di conservarli in frigo per una settimana Migliore tracciabilità dei dati grazie all’ archivio informatico di tutte le fasi analitiche. LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE PCR Real time per analisi Salmonella COLLABORAZIONE UNIBO Per verificare i margini di ottimizzazione del funzionamento/gestione di bacini depurativi al fine della rimozione dei macronutrienti e dei patogeni ANALISI di parametri di processo (macronutrienti: azoto e fosforo - microbiologici: E.coli e Salmonella) nei bacini di finissaggio nello stato di fatto e nell’impianto pilota appositamente costruito per simulare variazioni di battente idraulico e di tempi di ritenzione idraulici. SALMONELLA - ANALISI IN PCR possibilità di aumentare l’efficienza e la garanzia di rimozione di questo patogeno Il piano di monitoraggio proposto rappresenta un primo screening e il primo step dell’indagine per definire una base dati solida rappresentativa delle condizione di diffusione della Salmonella nel periodo primaverile-estivo. LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi tossicità Per stabilire la tossicità di prodotti e sottoprodotti delle attività umane - sostanza note, miscele (rifiuti- fanghi) o acque di scarico - per un determinato ECOSISTEMA si utilizzano Nessuna metodologia chimica è in grado di stabilire quale sia la frazione realmente biodisponibile e quindi in grado di interagire con il biota Test su bioindicatori allevati in laboratorio Daphnia magna-crostaceo cladocero Riproduzione: • partenogenetica (condizioni ottimali) • anfigonica o sessuale (condizioni limitanti) Buon indicatore: breve ciclo vitale e buona capacità riproduttiva Esposizione degli organismi a diverse concentrazioni del campione in esame per una durata di 24/48 ore • Viene utilizzato per diverse tipologie di matrici, sostanze chimiche note (mg/L), acque di scarico e superficiali (%), rifiuti (% o mg/L) e fanghi (mg/L) • Endpoint: morte /immobilizzazione del crostaceo LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi tossicità ANALISI TOSSICITA’ CON DAFNIA MAGNA ALLEVAMENTO ANALISI TOSSICITA’ CON VIBRIO FISCHERIMETODO AUTOMATICO ANALISI TOSSICITA’ CON DAFNIA MAGNA EFIPPI COMMERCIALI ANALISI TOSSICITA’ CON VIBRIO FISCHERIMETODO MANUALE LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi tossicità con Vibrio fischeri • La bioluminescenza emessa dai batteri marini gram negativi della specie Vibrio fischeri (ceppo NRRL-B-11177) viene utilizzata per un saggio a 5-15 e 30 minuti • Secondo la UNI EN ISO 11348-3:2009 il risultato dell’analisi con Vibrio fischeri è una concentrazione di effetto (EC50-EC20) • La diminuzione di luminescenza viene ritenuta proporzionale alla tossicità del campione LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi tossicità con Vibrio fischeri Gli effetti ottenuti possono essere: NON TOSSICO -bioluminescenza invariata o diminuzione minore del 10% nel campione tal quale TOSSICO misurabile - diminuzione di bioluminescenza contenuta tra 10 e 90 % nelle diverse diluizioni del campione estremamente TOSSICO -bioluminescenza assente nel campione • Se il campione tal quale dà un'inibizione <10 % allora l’EC50 non è calcolabile, il campione è non tossico, e il risultato analitico è “EC 50 > 100% o non calcolabile”. • Se l’inibizione è compresa tra 10 e 90% è invece possibile calcolare un valore finito di EC 50, che sarà il risultato da fornire al gestore. LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi tossicità con Vibrio fischeri LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Analisi tossicità con Vibrio fischeri LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Automazione nella gestione campioni e risultati La procedura ha permesso di velocizzare e rendere più sicura la gestione dei campioni e più rapida la fase di inserimento dei risultati analitici • Fase di preparazione: In questa fase è prevista la stampa delle etichette, da apporre sulle relative piastre. Sono riportate tutte le informazioni delle analisi del Piani di lavoro di MICROBIOLOGIA. • Fase di inserimento risultati: E’ prevista una maschera, a più schede, per la gestione dei risultati, con acquisizione tramite lettura dei barcode LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Algae Online Analyser • • Il laboratorio HERAtech ha individuato l’impianto pilota Algae Online Analyser, in grado di monitorare e quantificare in continuo la biomassa algale e cianobatterica tramite la fluorimetria in vivo in acque grezze, di processo e potabili. Il principio si basa sull’analisi dello spettro di fluorescenza emesso dai pigmenti dopo averli sottoposti ad eccitazione per mezzo di una luce di lunghezza d’onda compresa tra 400 e 650 nm Viene determinata la clorofilla e l’attività fotosintetica; è in grado di discriminare simultaneamente fino a 5 classi algali (Clorofite, Cianobatteri, Crisofite e Criptofite) utilizzando sei LED a diverse frequenza. LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE Algae Online Analyser • • • • • • Limitata manutenzione (pistone interno per pulizia della camera) Semplice operatività Possibilità analisi campioni in sequenza Possibilità uso off line Nessuna preparazione del campione o di reattivi Supporto al metodo tradizionale che comporta tempo ed elevata specializzazione per il riconoscimento al microscopio Grazie per l’attenzione
