CAP. 1
CAP. 2
La microbiologia di supporto alla gestione: rapidità
ed innovazione
dott.ssa de Lellis Laura
HeraTECH- Sasso Marconi (BOLOGNA)
CAP. 3
CAP. 4
CAP. 5
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
MICROBIOLOGIA
«TRADIZIONALE»…
o
o
∆
o
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o
o
Parametri microbiologici
(per requisiti minimi)
Escherichia coli
Enterococchi
.
Parametri
indicatori
Batteri coliformi
Clostridium perfringens
Conte a 37 e 22°C
Parametri supplementari
Alghe
Batteriofagi anti E.coli -Nematodi a vita libera
Salmonella
Funghi e Lieviti
Pseudomonas aeruginosa e Stafilococchi
Protozoi e altri elementi figurati
Attinomiceti
Spore di clostridi solfito-riduttori
Legionella
MICROBIOLOGIA
«INNOVATIVA»
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
2002
LABORATORI DISLOCATI IN PIU’ SEDIUN SETTORE MICROBIOLOGIA per
LABORATORIO
2007-2008
3 LABORATORI PRINCIPALI
UN SETTORE UNICO DI
MICROBIOLOGIA
• SALMONELLE
DETERMINAZIONI ANNUE
POTABILI+NATURALI+REFLUE
circa 500
ACQUE POTABILI-NATURALI 60000
determinazioni
ACQUE REFLUE-FANGHI 5500
determinazioni
ARIA-SUPERFICI 2500
determinazioni
• TOSSICITA’
DETERMINAZIONI ANNUE
POTABILI+NATURALI+REFLUE
circa 2200
2017
LABORATORI
HERATECH
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
1
2
3
ANALISI TOSSICITA’ ACQUE POTABILI E REFLUE
CON BATTERI BOLUMINESCENTIANALIZZATORE EASYCHEMTOX
AUTOMAZIONE NELLA GESTIONE DEI
CAMPIONI E DEI RISULTATI ANALITICI
ANALISI SALMONELLA IN PCR
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi Salmonella nelle acque
METODO TRADIZIONALE
APAT IRSA 7080/
RAPPORTI ISTISAN 07/5
ISSA 011A
FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA
CRESCITA A 37°C (24h)
PASSAGGIO IN RV (24h)
PRIMA SEMINA SU PIASTRA DI HEKTOEN
(24h)
SECONDA SEMINA SU PIASTRA DI HEK
(24h)
IDENTIFICAZIONE E CONFERMA
METODO
ALTERNATIVO
PCR - RT
FILTRAZIONE
IN ACQUA PEPTONATA
CRESCITA A 37°C (24h)
REAZIONE DI PCR
(3h tot)
COLONIE SOSPETTE
4 giorni per campioni negativi
6-7 giorni per campioni positivi
Test di conferma con terreni
selettivi e test biochimici e/o
sierologici con fasi a cadenza
giornaliera
Conferme non
necessarie
Elevata specificità
Maggiore sensibilità
0.1 UFC
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi Salmonella nelle acque
La PCR (Polymerase chain reaction) è una metodica
sensibile, veloce e versatile che consente di ottenere
grosse quantità di materiale genetico a partire da
piccole quantità di DNA.
Permette di analizzare specifiche sequenze che altrimenti
costituirebbero bersagli molto rari in un genoma
complesso.
E’ una reazione enzimatica di amplificazione in vitro di un
segmento di DNA ottenuta tramite l’enzima Taq
polimerasi a partire da una coppia di primers
(oligonucleotidi), sequenze di DNA a singolo filamento
necessari per l’innesco della reazione.
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
REAL-TIME PCR
(PCR Quantitativa)
Una zona specifica di DNA
viene bersagliata con due
oligonucleotidi che
amplificano, tramite la
reazione polimerasica, la
zona stessa copiandola un
enorme numero di volte e
rendendola visibile e
manipolabile per l’analisi
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi Salmonella nelle acque
Nel nostro sistema, automatizzato, la rilevazione dei frammenti
amplificati avviene mediante registrazione dell’ emissione di
fluorescenza durante la reazione di amplificazione, per ibridazione di
sonde altamente specifiche- molecular beacons - marcate con
molecole fluorescenti.
Nel momento in cui si appaiano alla sequenza complementare, si
aprono ed emettono il segnale di fluorescenza per allontanamento del
fluoroforo dal suo inibitore (quencher):
SI SEGUE ISTANTE PER ISTANTE L’INDIVIDUAZIONE DEL PATOGENO
Le prove sperimentali per valutare le prestazioni della PCR Real Time
utilizzando il termociclatore Stratagene Mx3005P e il kit Rapid-Pathogen
Detection system evidenziano:
• la maggiore sensibilità della tecnica
• rapidità-esito dell’analisi di campioni di acqua con notevole anticipo
rispetto alla metodica tradizionale.
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
PCR Real time per analisi Salmonella
Accuratezza: elevata specificità e sensibilità con livelli di rilevazione
migliori di quelli del metodo di riferimento
Rapidità nell’ottenimento del risultato (una notte di arricchimento e meno di
tre ore per la reazione di detection)
Facilità d’uso: kit di analisi e software semplice, utilizzo di strips pratiche,
adatte ad un impiego routinario in laboratorio, tutte le fasi visualizzabili a
video, risultati che non necessitano di interpretazioni soggettive
Migliore gestione dei campioni vista la possibilità di conservarli in frigo
per una settimana
Migliore tracciabilità dei dati grazie all’ archivio informatico di tutte le fasi
analitiche.
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
PCR Real time per analisi Salmonella
COLLABORAZIONE UNIBO
Per verificare i margini di ottimizzazione del funzionamento/gestione di bacini depurativi al
fine della rimozione dei macronutrienti e dei patogeni
ANALISI di parametri di processo (macronutrienti: azoto e fosforo - microbiologici: E.coli
e Salmonella) nei bacini di finissaggio nello stato di fatto e nell’impianto pilota
appositamente costruito per simulare variazioni di battente idraulico e di tempi di
ritenzione idraulici.
SALMONELLA - ANALISI IN PCR
possibilità di aumentare l’efficienza e la garanzia di rimozione di questo patogeno
Il piano di monitoraggio proposto rappresenta un primo screening e il primo
step dell’indagine per definire una base dati solida rappresentativa delle condizione di
diffusione della Salmonella nel periodo primaverile-estivo.
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi tossicità
Per stabilire la tossicità di prodotti e
sottoprodotti delle attività umane - sostanza
note, miscele (rifiuti- fanghi) o acque di scarico
- per un determinato ECOSISTEMA si utilizzano
Nessuna metodologia chimica è in grado di
stabilire quale sia la frazione realmente
biodisponibile e quindi in grado di interagire con il
biota
Test su bioindicatori allevati in
laboratorio
Daphnia magna-crostaceo cladocero
Riproduzione:
• partenogenetica (condizioni ottimali)
• anfigonica o sessuale (condizioni limitanti)
Buon indicatore: breve ciclo vitale e buona capacità
riproduttiva
Esposizione degli organismi a diverse concentrazioni del
campione in esame per una durata di 24/48 ore
• Viene utilizzato per diverse tipologie di matrici, sostanze
chimiche note (mg/L), acque di scarico e superficiali (%),
rifiuti (% o mg/L) e fanghi (mg/L)
• Endpoint: morte /immobilizzazione del crostaceo
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi tossicità
ANALISI
TOSSICITA’
CON DAFNIA
MAGNA
ALLEVAMENTO
ANALISI
TOSSICITA’
CON VIBRIO
FISCHERIMETODO
AUTOMATICO
ANALISI
TOSSICITA’
CON DAFNIA
MAGNA
EFIPPI
COMMERCIALI
ANALISI
TOSSICITA’
CON VIBRIO
FISCHERIMETODO
MANUALE
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi tossicità con Vibrio fischeri
• La bioluminescenza emessa dai batteri marini
gram negativi della specie Vibrio fischeri (ceppo
NRRL-B-11177) viene utilizzata per un saggio a 5-15
e 30 minuti
• Secondo la UNI EN ISO 11348-3:2009 il risultato
dell’analisi
con
Vibrio
fischeri
è
una
concentrazione di effetto (EC50-EC20)
• La diminuzione di luminescenza viene ritenuta
proporzionale alla tossicità del campione
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi tossicità con Vibrio fischeri
Gli effetti ottenuti possono essere:
NON TOSSICO -bioluminescenza invariata o diminuzione minore
del 10% nel campione tal quale
TOSSICO misurabile - diminuzione di bioluminescenza contenuta
tra 10 e 90 % nelle diverse diluizioni del campione
estremamente TOSSICO -bioluminescenza assente nel campione
•
Se il campione tal quale dà un'inibizione <10 % allora l’EC50 non è calcolabile, il
campione è non tossico, e il risultato analitico è
“EC 50 > 100% o non calcolabile”.
•
Se l’inibizione è compresa tra 10 e 90% è invece possibile calcolare un valore finito
di EC 50, che sarà il risultato da fornire al gestore.
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi tossicità con Vibrio fischeri
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Analisi tossicità con Vibrio fischeri
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Automazione nella gestione campioni e risultati
La procedura ha permesso di velocizzare e
rendere più sicura la gestione dei campioni e più
rapida la fase di inserimento dei risultati analitici
•
Fase di preparazione: In questa fase è
prevista la stampa delle etichette, da
apporre sulle relative piastre. Sono riportate
tutte le informazioni delle analisi del Piani di
lavoro di MICROBIOLOGIA.
•
Fase di inserimento risultati: E’ prevista una
maschera, a più schede, per la gestione dei
risultati, con acquisizione tramite lettura dei
barcode
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Algae Online Analyser
•
•
Il laboratorio HERAtech ha individuato l’impianto pilota
Algae Online Analyser, in grado di monitorare e
quantificare in continuo la biomassa algale e cianobatterica
tramite la fluorimetria in vivo in acque grezze, di processo
e potabili. Il principio si basa sull’analisi dello spettro di
fluorescenza emesso dai pigmenti dopo averli sottoposti
ad eccitazione per mezzo di una luce di lunghezza d’onda
compresa tra 400 e 650 nm
Viene determinata la clorofilla e l’attività fotosintetica; è in
grado di discriminare simultaneamente fino a 5 classi algali
(Clorofite, Cianobatteri, Crisofite e Criptofite) utilizzando
sei LED a diverse frequenza.
LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE
Algae Online Analyser
•
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•
Limitata manutenzione (pistone interno per pulizia della camera)
Semplice operatività
Possibilità analisi campioni in sequenza
Possibilità uso off line
Nessuna preparazione del campione o di reattivi
Supporto al metodo tradizionale che comporta tempo ed elevata
specializzazione per il riconoscimento al microscopio
Grazie per l’attenzione
