COLORAZIONE POLICROMATICA con il METODO di GRAM

LAB. MICROBIOLOGIA
COLORAZIONE POLICROMATICA con il METODO di
GRAM
Parete cellulare batterica
E’ una struttura rigida ed inestensibile che non interferisce con
il trasporto ed il passaggio delle sostanze, ma ha solo la funzione
di proteggere la cellula dalla lisi osmotica, cioè alla rottura cui
andrebbe incontro a causa della pressione osmotica.
La parete cellulare dei batteri è caratterizzata dalla particolare
composizione chimica: è l’unico tipo di parete costituito
prevalentemente da una sostanza chiamata peptidoglicano (o
mureina).
Struttura del peptidoglicano
Il peptidoglicano è un polimero costituito dalla successione
lineare di due zuccheri complessi che si ripetono nello spazio
alternandosi: l’acido acetilmuraminico ( AMA) e
l’N-acetilglucosamina (AGA).
Le catene polimeriche di AMA ed AGA sono affiancate e
sovrapposte secondo distanze determinate e collegate da corte
unità peptidiche. La struttura risultante conferisce rigidità alla
parete cellulare.
Lo spessore della parete cellulare è il risultato della
sovrapposizione di un certo numero (>25) di strati di catene
polimeriche.
La parete cellulare, oltre alla mureina, è costituita anche da
altre sostanze che riempiono gli spazi vuoti tra le catene e
rivestono superficialmente la struttura.
Classificazione Gram
La quantità relativa di peptidoglicano nella parete cellulare
determina la classificazione dei batteri in due gruppi:
1. Batteri gram-positivi (Gram+), in cui :
- la percentuale di mureina rappresenta più del 50% dei
componenti
- la densità dei legami peptidici presenti è molto alta
- gli altri componenti presenti sono acidi teicoici e polisaccaridi
- la parete cellulare appare molto spessa e quindi rigida
2. Batteri gram-negativi (Gram-), in cui:
- la percentuale di mureina rappresenta poco più del 10% dei
componenti
- la densità dei legami peptidici è bassa
- gli altri componenti presenti sono proteine, fosfolipidi,
lipopolisaccaridi
- la parete cellulare appare sottile e quindi meno rigida rispetto
alla precedente
Principi della Colorazione con il metodo Gram
E’ una colorazione indiretta e regressiva, che si avvale di una
serie di coloranti e di reattivi chimici utilizzati con una sequenza
specifica e per un tempo determinato.
 Il preparato batterico viene inizialmente fissato :
si deposita la porzione di coltura batterica sul vetrino e si
procede alla fissazione, generalmente a caldo sulla fiamma
diretta del bunsen, o anche a freddo con alcol etilico assoluto; in
questa fase i componenti cellulari ( proteine e lipidi soprattutto)
sono resi inattivi, insolubili ed immobili.
 In seguito il preparato viene trattato in successione con :
1. un colorante basico
2. una soluzione mordenzante
3. alcol etilico 95%
4. colorante di contrasto
 Il colorante basico è generalmente il cristal-violetto e
colora selettivamente, evidenziandole, le cellule dei
batteri Gram+ ( a causa della significativa quantità di
peptidoglicano presente)
 La soluzione mordenzante è in genere il reattivo di
Lugol ed aiuta le cellule a trattenere il colore
precedentemente acquisito
 L’alcol etilico 95% elimina l’eccesso di colorante sulle
strutture che non l’hanno trattenuto chimicamente
(lavaggio)
 Il colorante di contrasto è la safranina che colora
selettivamente i Gram-.