COLORAZIONE POLICROMATICA con il METODO di GRAM
Parete cellulare batterica
E’ una struttura rigida ed inestensibile che non interferisce con il trasporto ed il passaggio delle
sostanze, ma ha solo la funzione di proteggere la cellula dalla lisi osmotica, cioè alla rottura cui
andrebbe incontro a causa della pressione osmotica.
La parete cellulare dei batteri è caratterizzata dalla particolare composizione chimica: è l’unico tipo
di parete costituito prevalentemente da una sostanza chiamata peptidoglicano (o mureina).
Struttura del peptidoglicano
Il peptidoglicano è un polimero costituito dalla successione lineare di due zuccheri complessi che si
ripetono nello spazio alternandosi: l’acido acetilmuraminico ( AMA) e
l’N-acetilglucosamina (AGA).
Le catene polimeriche di AMA ed AGA sono affiancate e sovrapposte secondo distanze
determinate e collegate da corte unità peptidiche. La struttura risultante conferisce rigidità alla
parete cellulare.
Lo spessore della parete cellulare è il risultato della sovrapposizione di un certo numero (>25) di
strati di catene polimeriche.
La parete cellulare, oltre alla mureina, è costituita anche da altre sostanze che riempiono gli spazi
vuoti tra le catene e rivestono superficialmente la struttura.
Classificazione Gram
La quantità relativa di peptidoglicano nella parete cellulare determina la classificazione dei batteri
in due gruppi:
1. Batteri gram-positivi (Gram+), in cui :
- la percentuale di mureina rappresenta più del 50% dei componenti
- la densità dei legami peptidici presenti è molto alta
- gli altri componenti presenti sono acidi teicoici e polisaccaridi
- la parete cellulare appare molto spessa e quindi rigida
2. Batteri gram-negativi (Gram-), in cui:
- la percentuale di mureina rappresenta poco più del 10% dei componenti
- la densità dei legami peptidici è bassa
- gli altri componenti presenti sono proteine, fosfolipidi, lipopolisaccaridi
- la parete cellulare appare sottile e quindi meno rigida rispetto alla precedente
Principi della Colorazione con il metodo Gram
E’ una colorazione indiretta e regressiva, che si avvale di una serie di coloranti e di reattivi chimici
utilizzati con una sequenza specifica e per un tempo determinato.
Il preparato batterico viene inizialmente fissato :
si deposita la porzione di coltura batterica sul vetrino e si procede alla fissazione, generalmente a
caldo sulla fiamma diretta del bunsen, o anche a freddo con alcol etilico assoluto; in questa fase i
componenti cellulari ( proteine e lipidi soprattutto) sono resi inattivi, insolubili ed immobili.
In seguito il preparato viene trattato in successione con :
1. un colorante basico
2. una soluzione mordenzante
3. alcol etilico 95%
4. colorante di contrasto
Il colorante basico è generalmente il cristal-violetto e colora selettivamente,
evidenziandole, le cellule dei batteri Gram+ ( a causa della significativa quantità di
peptidoglicano presente)
La soluzione mordenzante è in genere il reattivo di Lugol ed aiuta le cellule a
trattenere il colore precedentemente acquisito
L’alcol etilico 95% elimina l’eccesso di colorante sulle strutture che non l’hanno
trattenuto chimicamente (lavaggio)
Il colorante di contrasto è la safranina che colora selettivamente i Gram-.
