DNA fetale nel sangue materno. Applicazioni e Prospettive Sandro Gabrielli Clinica Ostetrica e Medicina Prenatale Policlinico S.Orsola-Malpighi, Bologna [email protected] Sequenom Harmony BGI Lifecodexx PATOLOGIA Natera Verinata Down syndrome (T21) >99% 99.9% 99.1% >99% 99.9% 97.6% Edwards syndrome (T18) >99% 97.4% >99% 98% 99.9% 100% Patau syndrome (T13) >99% 87.5% 91.7% 80% 99.9% 100% Turner syndrome (mX) 91.7% 95% 94.7% 96.7% No No Triploidy detection Yes No No No No No Male >99.9% 99.1% 99.4% 99% No No Female >99.9% 97.6% 97.9% 99% No No Sex Chromosome - extra copy Yes Yes Yes Yes No No 22q 11.2 deletion syndrome / DiGeorge Syndrome 95.7% No 60-86% No No No 1p36 deletion syndrome / Angelman syndrome / Cridu-chat syndrome / Prader-Willi syndrome 93.8->99% No 60-90% No No No How early can the test be used? 9 weeks >10 weeks >10 weeks >10 weeks >10 weeks 9+ weeks SE IL TEST DEL DNA FETALE È POSITIVO…. Praticamente tutti i feti Down sono diagnosticati dal test ma c’è un 0.1% di falsi positivi Donne positive al Test combinato VPP (%) 100 91 83 71 62 50 40 33 1:20 Donna di 38 Anni a 10 settimane o NT aumentata Donna di 35 Anni a 10 settimane Popolazione generale Donna di 25 anni A 10 settimane 1:100 1:240 1:700 1:1000 Incidenza di sindrome di Down nella popolazione che ha beneficiato del test Risultato chiaro che non Lascia dubbi. Il test è o negativo o positivo Se è nella «fascia grigia» è comunque positivo V va meglio per le Ovodonazioni DNA fetale Eseguito a 13 sett 46,XY (Maschio normale) Eco a 16 settimane: sospetto femmina Eco a 20 settimane : feto femmina La paziente era una ovodonazione che partiva come gemellare.. Molto probabilmente è stato amplificato Il segnale Y del sacco del feto riassorbito DNA fetale e Demised twin • In caso di discordanza di sesso e/o di cariotipo, l’errore può riguardare sia un FP che un FN . Dubbi con Verinata (NCV) ma miglior risultato con Natera (SNPs) . • Più probabile che il demised twin sia aneuploide • Non ci sono studi che indicano per quanto tempo il sacco riassorbito immetta DNA in circolo ma NON meno di 6-7 settimane . 37 anni, NT=3 mm, Test Combinato 1:300 Trisomia 18 Trisomia X Amnio negativa 46,XX Test Combinato positivo per T18 NIPT positivo per T21 negativo per T18 (ff=11.5%) Funicolocentesi : T18 (QF-PCR) T18 allelic ratio= 1:2 ; T21 allelic ratio=1:1 QF-PCR su placenta: T18 allelic ratio=1.3:1 T21 allelic ratio= 1.5:1 Biopsia placentare multipla mosaico T21 > T18 ? DNA fetale e mosaicismo • FALSO POSITIVO – Mosaicismo confinato alla placenta (1-2% dei CVS ma probabilmente molto di più) – Mosaicismo materno (raro) • VERO POSITIVO – Quanto ? Non correlazione fra positività al DNA fetale e clinica • FALSO NEGATIVO – Errore dovuto al fatto che è necessaria una maggior frazione fetale del 4% minimo per poter rilevare al test (meno cellule contribuiscono). • DISCORDANZA DNA VILLOCENTESI – CVS eseguito su una zona di placenta non a mosaico – Mosaico del mesenchima (Tipo II) ?? 42 years old, gravida 4 parity 1 abortion 2. Combined test 1:5 CVS :46 XX NIPT : positive for T21 Amniocentesis 46 XX with UPD 21 (aborto volontario) NIPT NON HA AIUTATO DNA fetale nelle pazienti trapiantate Patient Information 26 y.o. G1P0, 12w5d Indications for Counseling Personal history of congenital renal abnormalities (Unilateral absent kidney with renal reflux in contralateral kidney) and two prior kidney transplants Family history of Down syndrome in sibling NIPT result: “No Aneuploidy Detected” with presence of two sex chromosomes (XY) 20 week ultrasound showed normal anatomy and…It’s a girl! the most recent kidney donor was a male Quando fare il test ? • La tendenza è quella di fare prima possibile per offrire un CVS entro 90 giorni – Accettabile nel caso di diagnosi di T21 • Ci sono almeno tre motivi per farlo ragionevolmente più tardi possibile – Vanishing Twin – FIVET : embrione anche se non impiantato può contribuire ?? - Competizione cellulare COMPETIZIONE CELLULARE • • • All’interno di un tessuto in crescita due popolazioni cellulari con differenti proprietà metaboliche SI CONFRONTANO con crescita della popolazione più forte a scapito di quella più debole INFLUISCE SUL CONTRIBUTO DELLE DUE LINEE CELLULARI ALLA COMPOSIZIONE DEL TESSUTO Il potenziale proliferativo di una cellula con anomalia cromosomica, la sua sopravvivenza, il suo destino, il suo contributo allo sviluppo finale di quel tessuto dipendono dalle INTERAZIONE CON LE CELLULE VICINE • MEDIATI DALLA p53 1. APOPTOSI 2. INIBIZIONE CICLO DI DIVISIONE CELLULARE (G0) Johnston (2009) Science 324:1679-1682 Bondar e Medzhitov (2010) Cell Stem Cell 2;6(4):309- 322 Thomson e Compton (2010) J Cell Biol 188,3: 369-381 Baker (2011) Curr Biol 11;21(1):R11-5 COMPETIZIONE CELLULARE APOPTOSI NORMALE PATOLOGICA Thompson e Compton (2010) J Cell Biol 188,3:369-381 Mantel e coll. (2011) Blood 109,10:4518-4527 COMPETIZIONE CELLULARE INIBIZIONE CICLO CELLULARE NORMALE PATOLOGICA Thompson e Compton (2010) J Cell Biol 188,3:369-381 Mantel e coll. (2011) Blood 109,10:4518-4527 E’ possibile una terapia prenatale della Sindrome di Down ??? • Studi preliminari su modelli animali – Pentilenetetrazolo (PTZ), – Memantina - Demenza – Fluoxetina (PROZAC) – Antidepressivo • Ci sono circa 250 geni sul Chr 21 ma solo alcuni sono responsabili della S. di Down. Studi di inattivazione del cromosoma 21 in eccesso. utilizzando lo specifico gene a RNA denominato XIST (da X-inactivation gene), espresso nell'embrione solo dal cromosoma X destinato a essere silenziato. Tale gene induce modificazione del cromosoma a mutarsi nel corpo di Barr, evitando che vi sia un'espressione duplicata di geni situati sui due cromosomi X. Tramite un enzima, XIST è stato introdotto in una coltura di staminali pluripotenti derivate da pazienti Down e si è ottenuto il silenziamento dei geni contenuti nella copia soprannumeraria del cromosoma 21; si è riscontrato un effetto notevole sulla funzionalità delle cellule • • Brevetto B13788R Brevetto B13788R Conclusioni • Numero inaspettato di falsi positivi da mosaicismo • Il segnale del feto riassorbito può costituire un problema prima ignorato • Spostare il test in avanti ?? • Conferma che il test va eseguito solo in popolazioni a rischio • Conferma della validità del test combinato • Nuovo campo : CHD mediante dosaggio di mRNA e miRNA Grazie per l’attenzione Dati su piccole popolazioni incoraggiano l’uso del MPS per la diagnosi di: a.Microdelezioni; b.Duplicazioni; c.Traslocazioni (non solo T21); d.Mosaicismo T21; con risultati uguali ai microarray e al cariotipo (CVS) Am J Hum Genet. 2013 Feb 7;92(2):167-76 Results – Concordant with Karyotype Duplications and Deletions Detected by Deep MPS Sample Affected Chromosome Gain/Loss Size (Mb) Chromosome Region 1 6 Gain 38 6q12-6q16.3 7 Gain 0.3 7q22.1 2 7 Loss 0.3 7q36.1 3 8 Loss 6 8p23.2-8p23.2 4 15 Loss 17 15q11.2-15q14 5 17 Gain 19 17q23.3-17q25.3 10 Loss 2 10q26.3 3 Gain 40 3q25.32-3q29 X Loss 9 Xp22.3-Xp22.31 6 Deep MPS can provide greater resolution and can detect fetal subchromosomal abnormalities at a resolution of 100kb across the genome