19) Trascrizione-Traduzione Mutazioni.pptx
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21/04/17 GENE EXPRESSION Il DNA (informazione genetica) guida la sintesi delle proteine 21/04/17 Lasintesidiunaproteinaprevededuefasi:la trascrizioneelatraduzione Trascrizione 2 TRANSCRIPTION 1. DurantelatrascrizioneilDNAvieneusatocomestampoperlaformazione dell’RNAmessaggero(mRNA). 2. Durantelatraduzione,unRNAtrascriLovienetradoLoinunasequenzadi amminoacidi. 3 SylviaS.MaderImmagini e concetti della biologia ©Zanichellieditore,2012 Genes GenesarethebasicphysicalandfuncAonal unitsofheredity.Eachgeneislocatedona parAcularregionofachromosomeandhas aspecificorderedsequenceofnucleoAdes (thebuildingblocksofDNA). What is a locus? • Alocusdescribestheregionofachromosome whereageneislocated.11p15.5isthelocusfor thehumaninsulingene.11isthechromosome number,pindicatestheshortarmofthe chromosome,and15.5isthenumberassignedtoa parPcularregiononachromosome.When chromosomesarestainedinthelab,lightanddark bandsappear,andeachbandisnumbered.The higherthenumber,thefartherawaythebandis fromthecentromere. 1 21/04/17 PROKARYOTICGENES EUKARYOTICGENESTRUCTURE TranscripAoninprokaryotes 10 I geni eucariotici sono interrotti da sequenze non codificanti Solo il 5% del trascritto primario raggiunge i ribosomi. GENINEGLIEUCARIOTI E s i s t o n o g e n i d i o l t r e 100.000 coppie di nucleoAdi ma solo una minima parte della lunghezza del DNA viene uAlizzata perché alle sequenze codificanA deRe esoni si alternano lunghe sequenze non codificanA c h i a m a t e i n t r o n i ( c h e cosAtuiscono la maggior parte del gene) e che vengonoeliminate,dall’RNA trascriRo, nel processo di SPLICING. Inoltre,ognigenepossiededellesequenzediDNA regolatricicheleganoleproteineregolatricidelgenecon funzionedicontrollodellatrascrizione.Questesequenze possonotrovarsiamontedell’iniziodellatrascrizionema ancheneglIintronienegliesoni. 2 21/04/17 TrascrizionedelDNA Produceunamolecola(filamento)diRNA copiadiunodeiduefilamenAdiDNA. Glienzimichecatalizzanoquestareazionesi chiamanoRNA-POLIMERASI.Essi funzionanosemprenelladirezione5’-3’. RNA Polymerase Features • Starts at a promoter sequence, ends at termination signal • Proceeds in 5’ to 3’ direction • Forms a temporary DNA:RNA hybrid • Has complete processivity 21/04/17 Trascrizione 13 EUKARYOTICRNAPOLYMERASES 21/04/17 Trascrizione 16 BASICPRINCIPLESOFTRANSCRIPTION 3 21/04/17 PROKARYOTES INITIATION IN EUKARYOTES TRANSCRIPTION IN EUKARYOTES Segnalidiinizioedifine dellatrascrizione Direzioneditrascrizione Ipromotorisonodirezionalicioèdirigonola trascrizionediunosolodeiduefilamenAdiDNA secondolalorodirezione. Inuncromosomaalcunigenisonotrascri]usando comestampounfilamentoedaltriusandol’altro. LeRNA-polimerasisileganoa specifichesequenzediDNA chiamatePROMOTORIed incomincianolatrascrizione. Latrascrizioneterminaquandola RNA-polimerasiraggiungespecifiche sequenzediDNAchiamate TERMINATORI. 21/04/17 Trascrizione 23 21/04/17 Trascrizione 24 4 21/04/17 Gene OgniregionedelDNAcapacedisinteAzzareunamolecolafunzionalediRNA cosAtuisceunGENE. Tramite TRASCRIZIONE e TRADUZIONE la cellula esprime la propria informazionegeneAca. Vengonotrascri]variApidiRNA 1) mRNA:RNAchecodificanoperproteine 2) rRNA:fannopartedelribosoma 3) tRNA:fungonodaadaRatoritramRNAe amminoacidi 4) piccoliRNA:sonoimportanAnello splicingdell’mRNAeinaltriprocessi cellulari. QuestaESPRESSIONEpuò avvenireconunaefficienza diversa. 21/04/17 Trascrizione 25 21/04/17 Differenza nella trascrizione EucarioA Maturazione(PROCESSING)dell’RNA citoplasmadoveavvienelatraduzione. Leprincipalimodifichesono: 1) CAPPINGAggiuntadelcappuciodi7meAlguanosina(solomRNA) 2) POLIADENILAZIONE(solomRNA) 3) SPLICING 26 Differenza nella trascrizione PROKARYOTES-BACTERIA GliRNAeucarioAcisonoprocessaAnelnucleoprimadiesseretrasportaAnel Trascrizione ACOSASERVONOCAPPINGEPOLIADENILAZIONE? • StabilizzanolamolecoladimRNA • Facilitanol’exportnelcitosol • Rendonopiùefficientel’iniziodellasintesiproteica L’mRNAcosì“processato”(dopocapping,splicing,poliadenilazione)è trasportatodalnucleoalcitoplasma.Questomovimentononèpassivo eavvieneaRraversoilcomplessodelporonuclearechesele]vamente controllaglimRNAdatrasportare. 5 21/04/17 La coda di poli(A) al 3 dell mRNA è lunga più di 100 nucleotidi. Gliintronivengonorimossiinun processochiamatosplicing Reazionidi“tagliaecuci”catalizzatedacomplessidiRNA +proteinechiamaAsnRNP“sneurps”(smallnuclear ribonucleoproteinparAcles),parteessenzialedello spliceosoma. SuccessivamenteglimRNAprocessaAsonotrasportaAnel citoplasmaaRraversoiporinucleari. L aggiunta del cappuccio al 5 dell mRNA (capping) avviene durante la trascrizione. SPLICING SPLICING SPLICINGALTERNATIVO E’UNPROCESSOATTRAVERSOILQUALEPIU’ mRNAPOSSONOESSEREGENERATIDALLO STESSOPRE-mRNA,QUINDIDALLOSTESSO TRASCRITTO,UNENDOINMODODIVERSOGLI ESONI. ÈCONSIDERATOLAFONTEPIU’IMPORTANTEDI DIVERSITA’DELLEPROTEINENEIVERTEBRATI. FREQUENTENEGLIEUCARIOTISUPERIORI(~60% DEIGENIUMANI). GENOMAUMANO 30-40.000GENI CENTINAIADIMIGLIAIADIPROTEINE!!! IL15%DELLEMUTAZIONIPUNTIFORMICHECAUSANOMALATTIE GENETICHENELL’UOMOE’ACARICODELLOSPLICING. • SindromediFrasier (difeXnellosviluppodireneegonadi) • Distrofiamiotonica • FibrosicisAcaaApica • AmyotrophicLateralSclerosis(ALS) neurodegeneraPvedisorder(FUS) • SpinalMuscularAtrophy(SMA) deathofneuronalcellsintheanteriorhornofspinalcord(SMN1) • ReAniAsPigmentosa(RP) progressiverePnaldegeneraPon(PRPF31,PRPF8,PRPF3) • AlcuniApiditumore rabdomiosarcoma(SF3b1) 6 21/04/17 ESEMPIDISPLICING A C B casseLeexons TRADUZIONE Figure 2 alternaPve5’splicesite D alternaPve3’splicesite E retainedintrons mutuallyexclusiveexons McGraw-HillEncyclopediaofScience&Technology tRNA LemolecoleditRNAsonoadaRatorimolecolaritraogniamminoacidoedilsuo codone. Amminoacil-tRNAsintetasi Sonoenzimicheunisconoognit-RNAall’amminoacidoopportuno, importanAssimiperoRenereun’altafedeltàdellasintesiproteica. StruRuradeiribosomi Aggregatomolecolareenormeformatoda4RNA(rRNA)eoltre80proteine. Lasintesiproteicaavvienealivellodeiribosomi IribosomisonosituaAnelcitoplasmaliberioassociaAalreAcoloendoplasmaAco. rRNA Processing Prokaryotes- Eukaryotes 7 21/04/17 rRNA Processing - Eukaryotes -Nucleolus Sintesiproteica La subunità minore del ribosoma lega l’mRNA, lo posiziona nella maniera migliore e accoppiaitRNAaicodonidell’mRNA.Lasubunitàmaggiorecatalizzalaformazionedei legamipepAdicitraivariamminoacidi. Peptidil-tRNA Exit Amminoacil-tRNA Il codice genetico Translation Problema del codice: bisogna tradurre il codice a 4 lettere dei nucleotidi in quella a 20 lettere degli amminoacidi. ILCODICEGENETICOÈDEGENERATOORIDONDANTE Ad ogni gruppo di tre nucleotidi (codone) corrisponde un amminoacido. ILCODICEGENETICOÈUNIVERSALEcioèvalepertu]gliorganismivivenA(cisonorarissime Essendoci4x4x4=64possibilicombinazioniditrenucleoAdi,adalcuniamminoacidicorrispondepiùdiuncodone: 45 eccezioniades.perimitocondri). IlcodicegeneAcoètraducibileintremodidiversia secondadelmodulodileRura Necessariaunapunteggiatura:Codonidiinizioedifine 123 UGUGUGUGUG 123 8 21/04/17 Sintesiproteica ApposiAcodoni segnalanol’iniziodella sintesiproteica Sintesiproteica Il t-RNA iniziatore è l unico che può legarsi al sito P della subunità minore FORMAZIONE DEL COMPLESSO DI INIZIO IN PROCARIOTI CICLO DI ALLUNGAMENTO LaprimapartedellaproteinasinteAzzataè l’N-terminale.Laproteinapoisi accrescefinoaC-terminale. Poliribosomi Sintesiproteica Altricodoni(3diversi) segnalanolafinedella sintesiproteica. Inibitoridellasintesiproteica baRericasiusanocome anAbioAci. 9 21/04/17 Livelli di organizzazione delle proteine Leproteinesonobiologicamentea]vesoloseripiegatenella conformazionecorreRa(Folding) es.FoldingossidaAvo Il corretto ripiegamento è “aiutato” da specifiche proteine (hsp e chaperonine) Alcune proteine (chaperone) guidano l avvolgimento (ad esempio, heat shock proteins). Degradazione delle proteine Ogni proteina ha una sua specifica durata. Le proteine vengono degradate da proteasi attraverso due pathway principali: • • Molte chaperonine sono dotate di attività ATPasica necessaria per esplicare la loro attività biologica. Le hsp (heat shock proteins) ostacolano la denaturazione; sono proteine molto conservate evolutivamente Attraverso il lisosoma (non specifico, principalmente per proteine extracellulari) Attraverso il pathway del specifico) proteasoma/ubiquitina (molto regolato e EliminareproteineconfoldingnoncorreRoèessenziale:mala]e neurodegeneraAvecomeilmorbodiHunAngton,diAlzheimersonocausate dall’accumulodiproteinemalconformatechesiaggreganoedanneggianole cellule. UBIQUITINA Il Pathway Ubiquitina/Proteasoma The three biochemical steps that conjugate Ub to the protein substrate. Isolata da Goldstein nel 1975, come proteina con funzione ignota, è stata poi idenAficata in tu] gli organismieucarioAedintu]itessuA. E’ una proteina piccola, di 76 aminoacidi, altamenteconservata. L’ubiquiAnazione di una proteina target comporta una serie di a]vità enzimaAche a cascata, che portanoallaformazionediunlegamepepAdicotra l’ubiquiAnaedilgruppoNH2diunresiduodiLisina nellaproteinatarget. E3 è una ubiquitina ligasi: lega l ubiquitina alla proteina da degradare. Esistono centinaia di enzimi E3: la loro variabilità garantisce estrema specificità di substrato all'intero processo. Figure 7.26b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Le proteine che sono state legate covalentemente ad almeno 4 molecole di ubiquitina vengono riconosciute dal proteasoma e degradate. Lecker S H et al. JASN 2006;17:1807-1819 ©2006 by American Society of Nephrology 10 21/04/17 Il Proteasoma (26S) Il Proteasoma 19S ATPasi 20S pepPdasi 19S ATPasi Substrateentryisacomplexprocessthatiscatalyzedbythe19SparPcle.Thiscomplex architectureevolvedtoisolateproteolysiswithinanano-sizedcompartmentandpreventsthe nonspecificdestrucPonofcellproteins. Il Proteasoma Il Proteasoma The 26S proteasome structure includes the 20S core that contains the unique proteolytic sites that break peptide bonds. TheATPasesalsoactasa“keyinalock”tocauseopeningof thegated,substrateentrychannelofthe20Souterringand into its central degradaPve chamber. Linearizing and delivering the substrate uPlizes significant energy, perhaps one third as much ATP as the ribosome would use in synthesizing the protein, but it ensures the efficient and regulatedeliminaPonoftheprotein. Lecker S H et al. JASN 2006;17:1807-1819 ©2006 by American Society of Nephrology MutazionieriparazionedelDNA VariazionipermanenAdellasequenzadelDNAsidefiniscono mutazioni.Lemutazioni hannopermessoladiversificazionedegliorganismivivenA,maabreveterminesonospesso deleterie. Le cellule hanno sistemi l’accumulodinumerosemutazioni. di riparazione del DNA che evitano IdiversiApidimutazioni Mutazioni geniche (o puntiformi) Mutazioni cromosomiche § Mutazioni nel numero dei cromosomi § Mutazioni nella struttura 11 21/04/17 Mutazionigeniche Le mutazioni geniche puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA* con un altra Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o alla inserzione di una base nel filamento del DNA • Sostituzione • Delezione • Inserzione Lemutazioni possonoaveregravi conseguenze GLU VAL Es.anemiafalciforme:mala]a geneAca(mutazione provenientedallecellule germinali) *Se la mutazione avviene nell RNA la conseguenza sono alcune centinaia di molecole di proteina alterata sulle migliaia di copie che esistono in ogni cellula Originedellemutazioni L e m u t a z i o n i p o s s o n o o r i g i n a r s i d a Sistema di riparazione del DNA appaiamenA non corre] durante la replicazione.Iltassodierroreèdi1nucleoAde errato su 107 incorporaA. Con il sistema di riparazionedelDNAsiarrivaatassodierroreè di1nucleoAdeerratosu109incorporaA. La riparazione avviene solo sul frammento neosinteAzzato. Mutazionigeniche: SosAtuzione La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi Dachecosasonocausatelemutazioni? Un certo numero di errori durante la replicazione del DNA avviene spontaneamente. Il tasso di mutazione p u ò e s s e r e e n o r m e m e n t e a u m e n t a t o dall esposizione ad agenti mutageni Agenti fisici (ad es raggi X o UV) Agenti mutageni chimici I mutageni chimici sono molecole che si combinano con il DNA oppure causano cambiamenti chimici nelle basi nucleotidiche oppure sono simili alle basi nucleotidiche e vengono incorporate al loro posto causando però errori di appaiamento Mutazioni silenti. Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido la proteina prodotta sarà la stessa Fino a quattro diverse triplette specificano lo stesso aminoacido (il codice genetico è degenerato) • mutazioni SILENTI • mutazioni DI SENSO • mutazioni NON SENSO Le sostituzioni silenti spesso riguardano la terza base del codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano lo stesso aminoacido 12 21/04/17 Mutazioni DI SENSO. Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso aminoacido CCU Prolina GCU Alanina Mutazioni NON SENSO. La proteina avrà quindi lo stesso numero di aminoacidi ma una sequenza che differisce per un aminoacido La gravità degli effetti di una sostituzione dipenderà dalla somiglianza tra l aminoacido sostituito e il nuovo e dalla posizione della sostituzione Se si compara la sequenza dell emoglobina dell uomo con altre specie si osservano differenze in parecchi aminoacidi e pur tuttavia tutte queste emoglobine svolgono la funzione in modo efficiente. Alcune regioni della proteina sono molto simili anche tra specie filogeneticamente lontane, si dice che questa è una regione ben conservata. Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente (dipende dal punto in cui è avvenuta la sostituzione) AAG Lisina TAG Codone di stop LemutazionidisensorappresentanolaprincipalevariazionegeneAcasucuilavoralaSelezioneNaturale Mutazionigeniche:DelezioneoInserzione Talvolta l errore consiste nell inserire una base in più nella sequenza del DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base MutazioninellastruRuradeicromosomi Esistono 4 tipi principali di mutazione della struttura dei cromosomi: 1. delezione 2. duplicazione 3. inversione 4. traslocazione In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata (mutazioni per spostamento della griglia di lettura - frame shift) A (inserzione) A U G A G G A C U C C C G G A U U A Met Arg Thr Pro A U G A G G A A C U C C Asp Ser Gly Leu C G G A U U A Arg Iso MutazioniedEvoluzione SNP(single-nucleoPdepolymorphism;ingergo“snip”).QuesP polimorfismisonopunPdelgenomadovelasequenzadifferisce daunapersonaall’altradellastessapopolazione–0,1%circa 3x106nucleoPdi Mutazione del gene MYH16 (myosin heavy chain 16) ha permesso lo sviluppo del cranio in homo sapiens rispetto ad altri primati, Questo guadagno evolutivo è stato ottenuto sacrificando i potenti muscoli della mascella. 13 21/04/17 hLps://www.23andme.com/en-int/ 14
