wwwMALATTIA DI NEWCASTLE (ND) o PSEUDOPESTE AVIARE Colpisce pollo, tacchino e colombo, le anatre e le oche sono il serbatoio. E’ un’infezione virale altamente contagiosa e causa di grave patologia, anche mortale. E’ nell’ex lista A dell’OIE (Office International des Epizoties) e rientra fra le malattie più gravi. Il controllo di questa malattia è regolamentato da una normativa comunitaria e nazionale: Direttiva 92/66/CEE Dpr 15 Novembre 1996 n° 657. STORIA La malattia è stata importata dall’Indonesia grazie al traffico di animali vivi usati come scorte alimentari per i marinai. Nel 1927 c’è stata la prima segnalazione da Doyle (contea di Newcastle Upon Tyne, UK). Questa malattia si è poi diffusa via terra in tutto il mondo e nel giro di 15 anni fa la sua comparsa anche in Italia (1940). Dal 1940 in Italia ci sono stati focolai ricorrenti di cui l’ultimo in data 2000. AGENTE EZIOLOGICO Fam. Paramyxoviridae Gen. Avulavirus. Esistono 9 sierotipi di cui solo il 1° (Avian Paramyxovirus-1 o PMV-1) è responsabile della malattia di Newcastle, gli altri danno forme respiratorie in altre specie. E’ un virus a RNAss, (15.000 nucleotidi) pleomorfo con envelope e nucleocapside. Vi sono 6 geni che codificano per 7 proteine: Glicoproteina HN: permette l’aggancio ai recettori della cellula (H) e il rilascio dopo la moltiplicazione virale (N). Ha attività emoagglutinante per i GR di pollo e neuraminidasica. E’ importante per la diagnosi di laboratorio -> HA e inibizione dell’HA. Proteina F: è una proteina di fusione. Permette la fusione con la membrana della cellula e quindi l’entrata del virus nella cellula. E’ la chiave per interpretare le diverse patogenicità presentate da questo virus. NB: la proteina F non è una caratteristica peculiare dei paramyxovirus, ce l’ha anche il virus della peste bovina e del cimurro!! Proteina M di matrice: dà aggancio ad altre proteine che si proiettano al di fuori dell’envelope. Ha un ruolo nell’assemblaggio dei diversi componenti del virus. Proteine P ed L: molto importanti per la replicazione virale. Proteina NP del nucleo capside: il nucleo capside ha simmetria elicoidale e aspetto a spina di pesce. Esiste un UNICO SIEROTIPO (PMV-1). Sono tuttavia presenti fra i vari virus differenze antigeniche evidenziabili con Ab monoclonali -> DIVERSI PATOTIPI. I patotipi sono gruppi con diverse virulenze e diverse forme cliniche. Vengono classificati in base alla tempistica con cui provocano mortalità nelle uova embrionate di pollo SPF (inoculate dalla cavità allantoidea): LENTOGENI (> 90 ore) MESOGENI (61- 90 ore) VELOGENI (< 60 ore) -> sono i più patogeni. Le ore indicano il tempo medio di morte o MDT. Questo però nell’embrione….e nell’adulto? Classificazione dei patotipi di PMV-1 in base alla forma clinica riprodotta in condizioni sperimentali: Velogeni viscerotropi: danno malattia acuta con lesioni emorragico- necrotiche nell’intestino (UE e Italia). Danno anche sintomi nervosi e respiratori. Sono quelli diffusi in Europa. Velogeni neurotropi: forma acuta respiratoria e nervosa (USA- Pneumoencefalite). Mesogeni: sintomatologia respiratoria, a volte nervosa – bassa mortalità (dipende dalle complicazioni virali/ batteriche). Lentogeni respiratori: forma respiratoria lieve o inapparente. Enterici asintomatici: infezione enterica asintomatica. Si tratta di virus che hanno come prima sede di replicazione l’intestino e non danno alcun sintomo. Gli ultimi 3 si trovano solo in Asia e vengono usati come vaccini vivi. PATOGENESI Penetrazione per via RESPIRATORIA o DIGERENTE. Nel caso dei ceppi LENTOGENI ho forme LOCALIZZATE: il NDV invade le cellule della mucosa respiratoria e digerente e si replica solo localmente. La glicoproteina HN permette l’aggancio ai recettori della cellula e il rilascio dopo la moltiplicazione virale. Nel caso di ceppi VELOGENI ho forme SISTEMICHE: il virus invade prima digerente e respiratorio, poi va in circolo. Basi molecolari della patogenicità: La patogenicità dei ceppi di PMV-1 è legata alla struttura della proteina F. La proteina F permette la penetrazione nella cellula mediante fusione dell’envelope del virus con la membrana cellulare e permette inoltre la fusione di cellule contigue, il che consente al virus di passare da una cellula all’altra senza subire l’attacco degli Ab. La proteina F viene prodotta come precursore F0, costituito da due porzioni (F1 ed F2) legate da un sito di clivaggio da un ponte disolfuro. Per l’attivazione dev’essere tagliato il sito di clivaggio e le due porzioni restano attaccate con ponti disolfuro. Mediante CLIVAGGIO operato dalle proteasi della cellula ospite dà origine ad F1 ed F2. Il clivaggio è essenziale per la produzione di particelle virali infettanti. Se questo non si verifica, l’infezione abortisce. Tutta la differenza nelle diverse patogenicità sta nel sito di clivaggio: Lentogeni: F1 con LEUCINA, F2 con LISINA Velogeni: F1 con FENILALANINA e F2 con ARGININA. Nei ceppi ad elevata patogenicità prima del sito di clivaggio c’è un doppio (se non multiplo) aa basico, mentre i ceppi lentogeni hanno un singolo aa basico. Queste differenze nel sito di clivaggio dipendono dalla proteasi usata dal virus. I ceppi velogeni usano proteasi ubiquitarie. I ceppi lentogeni usano solo proteasi Tripsina-like, che sono presenti soltanto nelle cellule del respiratorio e del digerente. Il clivaggio può essere operato da diverse proteasi presenti nell’ospite, ma non tutte le proteasi sono in grado di scindere il precursore F0 nelle due sub unità F1 ed F2. Tale capacità dipende dal tipo di aa presenti nelle porzioni comprese fra 113 e 116 e in posizione 117. In particolar modo si è visto che tutti i ceppi virulenti possiedono: Una coppia di aa basici (arginina- arginina o lisina- arginina) in posizione 115 e 116, che rappresenta il terminale carbossilico della sub unità F2; Almeno un altro aa basico (arginina) in posizione 113; La fenilalnina in posizione 117. I ceppi a bassa virulenza o virulenti hanno 1 solo aa basico al terminale carbossilico della sub unità F2 e la leucina in posizione 117, che è il terminale aminico della sub unità F1. EPIDEMIOLOGIA Ospiti: Oltre 241 specie di uccelli sensibili. Pollo, tacchino e piccione sono fra le specie più sensibili. Anatre, uccelli acquatici e oche sembrano essere più resistenti, infatti non manifestano la forma clinica -> sono il serbatoio. E’ una zoonosi minore: nell’uomo dà congiuntivite. Trasmissione: Orizzontale: secrezioni respiratorie e feci (acqua e mangimi contaminati). Verticale: dimostrata ma discussa perché il virus uccide l’embrione. Però la trasmissione si è avuta in soggetti vaccinati. Riguarda solo virus ad alta patogenicità che colpiscono anche l’ovaio, quindi sono interessate le galline riproduttrici non vaccinate. Grazie alla resistenza del virus la trasmissione verticale si può avere anche con contaminazione del guscio con feci infette perché il virus è super- resistente. Bisogna fare attenzione perché se la trasmissione avviene in questo modo può sembrare congenita. Pur essendo rapidamente inattivato dai disinfettanti perché ha l’envelope, il virus è piuttosto resistente. Resiste infatti a: Essiccamento, variazioni di pH T° ambientali di 40- 43° per 1 mese T° di refrigerazione per più di 4 mesi Congelamento per più di 6 mesi. Modalità di diffusione di NDV: - - Movimenti di uccelli vivi: selvatici, esotici, pollame allevato … Es: piccione: se il suo ceppo PP1 fa più passaggi può infettare il pollo con forme gravi. Es: I fagiani da ripopolazione sono vaccinati,non mostrano segni clinici, ma il vaccino non previene né l’infezione né l’escrezione del virus anche ad alta patogenicità. Es: Le anatre migratrici sono il serbatoio. Movimenti uova da cova Movimenti del personale o delle attrezzature -> è resistente nell’ambiente! Attenzione alle gabbie per il trasporto degli animali al macello. Movimenti prodotti avicoli (comprese le feci): es. dopo l’influenza aviare non avevamo più ovaiole, per cui abbiamo importato uova sporche di feci infette -> nuovi focolai di ND. QUADRO CLINICO Variabile per: Patotipo (velogeno, lentogeno) Specie ospite: il pollo e il tacchino sono più sensibili, l’anatra è più resistente. Età (i giovani sono più sensibili) Stato immunitario: condiziona la gravità dei sintomi. Per questa malattia si vaccina. Negli animali vaccinati si osservano solo forme neurologiche transitorie. Complicanze dovute ad altri microrganismi (solo per mesogeni e lentogeni). CEPPI VELOGENI: Forma acuta o iperacuta: Periodo medio di incubazione: 2-5 gg Morte nel giro di 24 ore (max 4-5 gg) nei soggetti non immuni Mortalità anche del 100%. L’infezione è sistemica e ho: Depressione del sensorio (tendenza a rimanere immobili con palpebre semi chiuse, penne arruffate) Edema della testa ed emorragie petecchiali sulla cute Diarrea verdastra (questi sintomi gastroenterici compaiono dopo 4-5 gg) Sintomatologia respiratoria (scolo nasale, tosse, rantoli, starnuti) Colorito cianotico perché è un virus che causa vasculite Essudato a livello oculare Alla fine alcuni soggetti presentano sintomatologia nervosa, sono quelli più resistenti che sono sopravvissuti al focolaio (infatti l’ultimo distretto che il virus raggiunge è il SNC). Forma subacuta nervosa: le forme nervose si possono vedere prima della morte dell’animale oppure alla fine di un focolaio. Tremori Movimenti di antero- pulsione della testa Torcicollo, opistotono -> è molto caratteristico Convulsioni tonico- cloniche se stimolati Movimenti di maneggio Paralisi progressiva di ali e zampe finchè non sta più in piedi (decubito laterale). Ceppi velogeni nelle ovaiole e nei riproduttori: Totale o brusco calo dell’ovodeposizione ( 90%- 40%) Uova con guscio depigmentato, sottile, rugoso o mancante (“uovo in panna”) Albume acquoso Recupero dopo 3-4 settimane E’ però da notare che non dà alterazioni di forma dell’uovo, ma del guscio. Nei gruppi vaccinati il calo dell’ovodeposizione può essere l’unico sintomo, insieme a sintomi neurologici transitori. Nei gruppi vaccinati l’entrata in allevamento di un ceppo altamente patogeno dà solo il calo della deposizione e alterazione del guscio. Lesioni anatomo- patologiche dei ceppi velogeni viscerotropi: - - Edema della testa Congiuntivite con essudato purulento Emorragie petecchiali di cresta e bargigli (le petecchie emorragiche sono a causa della vasculite) Carcassa disidratata (smettono di bere) Edema sottocutaneo Lesioni emorragico- necrotiche all’apparato digerente: Pro ventricolo: lesioni emorragiche Intestino: lesioni emorragico- necrotiche localizzate nella parete a livello degli aggregati linfatici sottomucosi : placche del Peyer e tonsille cecali. Tonsille ciecali con lesioni necrotico- emorragiche. Contenuto intestinale verdastro oppure intestino vuoto con parete iperemica. Lesioni istologiche al cervello: encefalo mielite non purulenta Lesioni emorragiche ai visceri Milza e borsa di Fabrizio congesti, emorragici Lesioni all’apparato respiratorio: Tracheite emorragica con materiale caseoso o catarrale Polmonite atelectasica Ovaiole e riproduttori: Regressione ovarica: follicoli piccoli, flosci, si rompono facilmente (se il follicolo si rompe ne consegue una peritonite ovarica). Ho atresia e riassorbimento del materiale vitellino. Ovarite emorragica CEPPI MESOGENI Quadro clinico: Forme respiratorie La mortalità in genere è bassa se il focolaio non è complicato A volte forme nervose Nelle ovaiole e riproduttori si ha calo della deposizione CEPPI LENTOGENI Forme respiratorie Solo nei giovani La mortalità in genere è bassa se il focolaio non è complicato Vengono usati come vaccini MALATTIA DI NEWCASTLE NEL COLOMBO E’ endemica nel colombo. Ceppo mesogeno diverso da quello del pollo (Ab monoclonali) -> Pigeon paramyxovirus. Dà solo forma enterica e nervosa, no forma respiratoria: Diarrea verdastra Sintomatologia nervosa: depressione, paresi/ paralisi delle zampe e delle ali, torcicollo, tremori e movimenti di maneggio. DIAGNOSI Sintomatologia clinica e lesioni anatomo- patologiche. Ma per questa malattia è necessaria la DIAGNOSI DIRETTA: isolamento virale e valutazione della patogenicità del ceppo. DPR 15 Novembre 1996 n° 657: regolamento per l’attuazione della direttiva 92/66/CEE che prevede misure comunitarie contro la Malattia di Newcastle. Si applicano misure di polizia veterinaria solo in caso di focolaio di ND nella cui definizione rientrano le infezione da APMV-1 con ICPI> 0,7. Contiene: Definizione di “Malattia di Newcastle”: infezione da PMV-1 con ICPI (Indice di patogenicità intracerebrale) > di 0,7. Indicazioni sulla diagnosi di laboratorio. Campioni diagnostici: da soggetti moribondi o morti recentemente. I campioni vengono prelevati dal loro apparato respiratorio o digerente-> tamponi orofaringei, rinofaringei, tracheali o cloacali. Si possono fare campioni di organi: trachea, polmoni, intestino con contenuto intestinale, duodeno + pancreas, tonsille cecali, fegato, milza, cervello, cuore. Protocollo da seguire per la diagnosi di laboratorio: vd schema Esami di laboratorio sul liquido allantoideo: HA: si evidenzia la capacità del virus di agglutinare GR di pollo. Questa proprietà però è espressa da altri virus e batteri. HI: inibizione dell’emoagglutinazione. Uso di antisieri policlonali specifici nei confronti di APMV-1 e dei principali virus emoagglutinanti responsabili di malattie del pollame. INDICE DI PATOGENICITA’ INTRACEREBRALE (ICPI) Previsto per la tipizzazione dal DPR 657/96. Inoculazione intracerebrale del virus in 10 pulcini SPF (Specific pathogen free) di 1 giorno. Osservazione per 8 gg ogni 24 ore Calcolo dell’indice Codice: da 0 a 2 ( 0 -> normale; 1 -> malato; 2-> morto). Un ICPI prossimo a 2 indica ceppi ad elevata patogenicità, se invece ICPI è prossimo a 0 indica ceppi a bassa patogenicità. Secondo la legge la malattia di Newcastle è un’infezione da PMV-1 con ICPI > 0,7. Es. di calcolo dell’ICPI: NORMALI MALATI MORTI 1° gg 10 0 0 2° gg 8 2 0 3° gg 8 2 0 4°gg 7 3 0 5°gg 6 2 2 6°gg 2 0 8 7°gg 0 1 9 8°gg 0 0 10 Totale 41 10 29 Normali: totale x 0 = 41 x 0 = 0 Malati: totale x 1 = 10 x 1 = 10 Morti: totale x 2= 29 x 2 = 58 58 + 10 + 0 = 68 68 : n° di osservazioni -> 68: 80 = 0,85 -> è infezione perché è > 0,7. INDICE DI PATOGENICITA’ ENDOVENOSA (IVPI) - Inoculazione di 10 polli di 6 settimane Osservazione per 10 gg per sintomi clinici L’indice va da 0 a 3 ( 0 -> normale; 1 -> malato; 2 -> segni clinici ; 3-> morto). TEMPO MEDIO DI MORTE (MDT) Inoculazione in uova embrionale SPF: Velogeni < 60 ore Mesogeni: 61- 90 ore Lentogeni > 90 ore F- clivaggio: isolamento del virus nella cui sequenza aa del gene F a livello del sito di clivaggio siano presenti almeno 3 aa basici (arginina e lisina) tra i residui 113 e 116 e l’aa fenilalanina in posizione 117. Isolamento su colture cellulari: i ceppi velogeni formano placche, effetto citopatico tipico, visibile a occhio nudo senza l’aggiunta di tripsina o DEA o Sali di Mg. Microscopia elettronica, immunofluorescenza, immunoperossidasi: per identificare il virus direttamente dai tessuti infetti. Pcr: preceduta da retro-trascrizione dell’RNA a DNA (RT). Quando eseguita a livello della porzione del genoma che codifica per il sito di clivaggio di F0, permette di identificare il patotipo. Limiti: Presenza di inibitori in alcuni campioni (feci) con possibilità di falsi – Possibili cross-contaminazione in laboratorio, quindi falsi + Possibilità di non identificare nuovi ceppi virali data la specificità del primer RT-Pcr: riduce ulteriormente i tempi di diagnosi e il rischio di cross-contaminazione in laboratorio. DIAGNOSI INDIRETTA: sierologia. E’ una tecnica di supporto alla diagnosi. Non solo devo vedere gli Ab, ma anche un movimento anticorpale. Si usa soprattutto per verificare lo stato immunitario dopo la vaccinazione. Prevede tre tecniche: Inibizione dell’emoagglutinazione (HI) Virus- neutralizzazione su colture cellulari ELISA: metodica molto rapida che permette di analizzare molti sieri in contemporanea.. L’IZS di referenza per queste malattie è Padova. CONTROLLO DELLA ND: REGOLAMENTO E DENUNCIA DPR n° 657 del 15 Novembre 1996: regolamento per l’attuazione della Direttiva 92/66/CEE che prevede misure comunitarie contro la Malattia di Newcastle. - Denuncia obbligatoria Abbattimento e distruzione -> stamping out Zona di protezione (3 Km) e zona di sorveglianza (10 Km) Vaccinazione obbligatoria (è l’unica malattia la cui vaccinazione è obbligatoria per legge, però non è coerente con la volontà di eradicazione). Per il controllo della malattia: Profilassi diretta -> Biosicurezza: la profilassi diretta è molto importante, si fa il Tp/Tv, controlli…. Profilassi indiretta -> Profilassi vaccinale PROFILASSI VACCINALE Da un punto di vista teorico la vaccinazione nei riguardi di APMV-1 dovrebbe impedire l’instaurarsi dell’infezione. In pratica essa protegge gli animali principalmente dalle forme cliniche, mentre la replicazione e l’eliminazione virale avvengono ugualmente, anche se a livelli ridotti. Quindi in nessun caso la vaccinazione può essere considerata un’alternativa alla profilassi diretta. Tipi di vaccini: VIVI -> propagati su uova embrionate. Possono essere allestiti sia con ceppi lentogeni che mesogeni, selezionati in base alla loro capacità di diffusione e al loro potere immunogeno. Anche fra i lentogeni esiste un range di virulenza e in linea di massima la risposta immunitaria stimolata è proporzionale alla patogenicità Vivi lentogeni: patogenicità ridotta ma non del tutto apatogeni. Sono gli unici permessi in Europa, dove esiste la direttiva 93/153/EEC che vieta l’impiego di vaccini allestiti con virus il cui ICPI sia > 0,4. Hitchner B1, La Sota, Clone 30 (tropismo per le vie respiratorie: possono dare leggere forme respiratorie, “reazioni vaccinali”). Il La Sota è leggermente più patogeno rispetto a Hitchner B1 o agli enterotropi, infatti la sua somministrazione è seguita da una lieve sintomatologia respiratoria ed è in grado di generare un effetto booster più marcato. Diffonde più rapidamente nel gruppo, vantaggio non trascurabile in caso di pericolo immediato. Il Clone 30 deriva dal ceppo La Sota di cui conserva l’immunogenicità, associata a una minore patogenicità. Ceppi enterogeni: NDV 6/10, V4 (i ceppi enterogeni sono asintomatici, non danno reazioni vaccinali). Vivi mesogeni: Komarov, Roakin, Mukteswar Non ammessi in europa!!!! Sono usati per allestire vaccini vivi nei paesi in via di sviluppo, in Africa, Medio oriente e Sud-est asiatico, dove circolano in forma endemica virus ad elevata patogenicità. Dato il loro ICPI (circa 1,4), questi vaccini sono vietati in Europa. Sono inadatti ad animali totalmente scoperti dal punto di vista immunitario e che non hanno superato il 2° mese d’età. La loro somministrazione va preceduta da vaccinazione con ceppi lentogeni. Decisione della Comunità Europea 93/ 152/ CEE - Prevede che i vaccini vivi siano prodotti con ceppi con ICPI non superiore a 0,4, quindi solo i lentogeni sono ammessi. Prevede che i vaccini inattivati siano prodotti con ceppi con ICPI non superiore a 0,7. METODI DI SOMMINISTRAZIONE Vaccini vivi: Spray in incubatoio a grosse gocce, aerosol Oculo- nasale Acqua da bere Vaccini spenti:vengono preparati impiegando stipiti virali dotati di un alto potenziale di crescita su uova embrionate (come il ceppo lentogeno Ulster 2c), in grado cioè di fornire elevate quantità di Ag visto che essi non replicano nell’ospite. Anche per questi la legislazione impone dei limiti, ammettendo solo l’impiego di ceppi il cui ICPI sia < 0,7. La somministrazione è individuale. Via parenterale (IM o SC) L’efficacia degli interventi immunoprofilattici è influenzata da molteplici fattori. Per superare l’ostacolo è opportuno prevedere una vaccinazione spray in incubatoio, questo si fa per stimolare una buona immunità locale e cellulo- mediata che garantirà un livello di protezione accettabile nelle prime 3 settimane di vita. Richiamo: Vaccini vivi -> almeno 3 setitmane Vaccini spenti -> 4 settimane Rispetto all’impiego dei soli vaccini vivi, ci sono piani più efficaci che prevedono anche l’uso del vaccino inattivato -> inducono un livello di Ab circolanti più elevati e minor % di soggetti sieronegativi. I vaccini vivi stimolano l’immunità locale, quelli inattivati stimolano l’immunità umorale ( che è protettiva nei confronti della malattia, serve inoltre a limitare intensità e durata dell’eliminazione virale a seguito dell’infezione). Per avere una copertura adeguata sarà quindi necessario abbinare le due vaccinazioni. Il programma vaccinale di ovaiole, riproduttori e boiler prevede minimo 2 vaccini vivi e 2 vaccini spenti. Sono particolarmente importanti le vaccinazioni col vaccino inattivato nei soggetti a vita lunga. Il titolo anticorpale dev’essere tenuto alto fino alla deposizione. Quindi si fa la somministrazione contemporanea di vaccino vivo e inattivato in incubatoio, in questo modo il vaccino vivo stimola una risposta immunitaria primaria, mentre inizia il graduale rilascio dell’Ag da parte del vaccino inattivato, che agisce come una dose booster inducendo elevati titoli anticorpali già a 4 settimane. Per gli animali destinati alla riproduzione o alla produzione di uova da consumo è necessario ripetere gli interventi vaccinali per conferire un’immunità più duratura nel tempo. L’immunità materna può interferire col vaccino e protegge dalla malattia ma non dall’infezione. I vaccini vivi vanno somministrati nei primi giorni di vita perché danno immunità locale (non c’è fenomeno di blanketing), mentre i vaccini spenti andranno somministrati dopo 3 settimane perché è necessario aspettare il calo dell’immunità trasmessa dalla madre. Se si vuole risparmiare si fanno assieme in incubatoio, ma non ha la stessa efficacia. Nell’ultimo decennio, a seguito dell’epidemia del 200 e dell’intensificarsi del rischio di focolai, la profilassi vaccinale in Italia è stata resa obbligatoria dal Ministero della Salute, secondo programmi minimi di interventi vaccinali, diversificati per specie avicola e indirizzo produttivo.