Cell Migration - Classe delle lauree magistrali in Biologia (LM-6)
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Laurea magistrale in Scienze Biomolecolari 2006­2007 Laboratorio di chimica biologica e biologia cellulare modulo di biologia cellulare docente: silvia de marchis Modelli per lo studio del tessuto nervoso in vitro • linee cellulari • colture cellulari primarie (gliali e neuronali) • colture organotipiche/espianti Linee cellulari vs. Colture primarie Vantaggi: 5. reperibilità (banche di cellule: i.e. ECACC, ATCC) 7. possibilità di conservare le cellule in azoto liquido, coltivarle quando necessario 9. se manipolate in modo corretto le cellule esibiranno proprietà identiche nel tempo e nello spazio… possibilità di lavorare su un campione omogeneo 11. possibilità di lavorare con grandi quantità di cellule 13. efficacia di trasfezione delle cellule 15. possibilità di condividerle con altri laboratori Linee cellulari alcuni esempi…. control +NGF PC12 feocromocitoma di ratto ATCC n. CRL 1721 Immortalized GnRH neurons (GN and GT cells) S . R a d o v i c k e t a l. ( 1 9 9 1 ) P . L . M e l lo n e t a l. ( 1 9 9 0 ) H um an L H R H P ro m o te r S V ­ 4 0 T ­ A n t ig e n 1 ,1 4 k b 2 ,8 k b R at L H R H P ro m o te r 2 ,3 6 k b L H R H ­T A G H y b r id G e n e S V ­ 4 0 T ­ A n t ig e n 2 ,8 k b L H R H ­T A G H y b r id G e n e I n je c tio n o f G e n e in to 1 ­C e ll E m b r y o s I n j e c t io n o f G e n e in t o 1 ­ C e ll E m b r y o s T r a n s p la n t a t io n o f E m b r y o s in t o P s e u d o p r e g n a n t M ic e T r a n s p la n t a t io n o f E m b r y o s in t o P s e u d o p r e g n a n t M ic e H y p o th a la m u s W T H y p o th a la m ic T u m o r (in fe r tile ) Tag + O lf a c t o r y B u lb Immature GnRH neurons; high motility O lf a c to r y B u lb T u m o r I m m o r ta liz e d O lfa c to r y B u lb C e lls (G N C e lls ) I m m o r ta liz e d H y p o th a la m ic L H R H N eu rons (G T C e lls ) Mature hypothalamic GnRH neurons; no movement GN11 cells monitored for 8 hrs in SFM GN11 cells monitored for 8 hrs in SFM + HGF/SF (50 ng) GnRH neurons/primary culture Colture primarie di neuroni/glia Protocolli per ottenere colture arricchite dei diversi tipi cellulari Neuroni Oligodendrociti Astrociti Età donatore Protocolli di separazione: adesione differenziale Mezzo di coltura Protocolli per purificare tipi cellulari specifici Età donatore Protocolli di separazione: FACS, Percoll Colture primarie Le colture primarie sono ottenute da cellule derivate direttamente dall’animale per dissociazione del tessuto 3. dissezione 4. dissociazione 5. coltura su substrati appropriati in presenza di terreni appropriati SPECIE ETA’ DONATORE Colture primarie • • • • • Dissezione: sterilità (cappe a flusso laminare) utilizzo di soluzioni fisiologiche (BSS/Hepes +glucosio 0.6%) tessuto sempre immerso temperatura (ghiaccio) metodi fini di dissezione (vibratomo) Colture primarie 2. 3. 4. 5. Dissociazione: Soluzioni prive di ioni bivalenti (Ca, Mg) Trattamento con proteasi (tripsina/ papaina/mix) 37°C incubazione in assenza siero/ inibizione proteasi DNAsi Dissociazione meccanica Colture primarie Substrati (critico per neuroni) 3. Polilisina – poliornitina (L e D isomeri) 4. ECM (es. collagene, laminina, fibronectina) 5. Cellule gliali Terreni Basal medium+siero o Serum free medium + ormoni e fattori di crescita Neurobasal+N2 (o B27) Colture primarie Coltivate in vitro le cellule: possono o meno dividersi, differenziano, muoiono Per ogni esperimento si riparte dall’animale (banche di tessuto) NEUROSFERE Colture primarie Il successo non è automatico… • Piccoli dettagli possono fare la differenza…ogni tipo cellulare richiede la messa a punto di protocolli specifici. • Essenziale l’esperienza diretta ­ osservare un esperto all’opera…. Colture organotipiche/espianti • Colture di frammenti/fette di tessuto: ­dissezione Spessore tessuto…problema diffusione O2 Millicell cell culture plate inserts are widely used in cell and tissue culturing applications. The Millicell­CM, with Biopore membrane, is particularly well suited to organotypic cell cultures. This unique membrane is extremely biocompatible. Explants readily adhere to its surface without the addition of an extracellular matrix coating. Stationary Organotypic Cell Culture is a method for growing and maintaining healthy tissue slices without the use of rocker plates or roller tubes. Il problema biologico: • La neurogenesi…un fenomeno che persiste in aree ristrette del SNC dei mammiferi adulti • Qual’è l’interesse? Adult olfactory bulb neurogenesis 1. proliferation Stem cells and neurogenesis in the adult mammalian brain Doetsch, 2003, Curr Opin Genet Dev Abrous, et al. 2005 Physiol. Rev. L’approccio sperimentale • In vivo: Modelli animali (topi transgenici) Trattamenti con fattori /trapianti • • • • In vitro: Colture organotipiche/espianti Colture cellulari primarie Neurosfere Factors controlling SVZ proliferation, migration, differentiation and survival Olfactory input Neurotransmitters Abrous et al., 2005 Physiol Rev Growth factors Early Morphogens Injury Intrinsic factors Neurotransmitters Hormones Adhesion and ECM molecules Microtubule dynamics proteins CREB cAMP response element­binding SVZ­Explants SVZ­Explants cultured in 3D­matrices Embedding the explants in Collagen/Matrigel Coculture assay (HEK cell aggregate) obtained by hanging drops 1DIV Collagen=individual cell migration Matrigel=chain migration SVZ­Explants cultured in Matrigel ICC Doublecortin / p­CREB 3 DIV Imaging Neurons using live­cell microscopy Time­delayed co­culture of SVZa neurons with Slit­secreting HEK cell aggregates. SVZa neurons were allowed to migrate out of explants in collagen/Matrigel for 24 h, media was aspirated, and then a Slit­secreting HEK cell aggregate was placed next to the SVZa explant (dotted line) and covered with more collagen/Matrigel. The explant was then cultured for another 24 h in DMEM + 10% FCS. Cells that were initially close to the Slit source at the time of aggregate placement were repelled after 24 h of co­culture with Slit. This repulsion can be visualized with live­cell time­lapse microscopy. Cell Tracers injections in vivo OB LV OB RMS Cell Tracker Green P4­2dpi Cell Tracers injections in vivo PSA­NCAM CTG CTB Adult 7dpi Cell Tracers injections in vivo CTB Cell tracker green 2dpi Organotypic slice 3div OB 1.5div 0div OB OB OB Cell Transplantation in organotypic slice explant OB explant OB
