Le tecniche di
coltura in vitro
Francesco Sunseri
La definizione
“… the aseptic culture of plant protoplasts,
cells, tissues or organs under conditions
which lead to cell multiplication or
regeneration of organs or whole plants “
(Murashige, 1963)
2
Argomenti da trattare:
1. Concetti fondamentali / Storia
2. Tipi di cellule o tessuti
3. Processi di crescita
4. Regolatori di crescita
3
Che cosa sono
La coltura di cellule e tessuti di piante trova il suo
fondamento nella totipotenza cellulare
In tutte le piante vascolari l’embrione si evolve in
una struttura bipolare per la presenza di due
meristemi apicali
Durante il ciclo della pianta tali meristemi
producono continuamente nuovi organi che si
aggiungono a quelli prodotti durante
l’embriogenesi
4
Che cosa sono
Le piante vascolari sono state pertanto definite
organismi a ontogenesi ricorrente, a causa di tale
fenomeno nelle piante non si assiste alla
separazione tra linea somatica e linea germinale
Durante lo sviluppo gli apici vegetativi possono
modificarsi in apici riproduttivi, sviluppando le
strutture tipiche della riproduzione
Per entrambe queste ragioni nelle piante
vascolari qualsiasi cellula somatica può
considerarsi un progenitore potenziale di un
nuovo individuo …
5
Coltura in vitro
Il termine sottende a differenti metodologie che
consentono la crescita e lo sviluppo di cellule,
tessuti ed organi vegetali su terreni sintetici
La crescita e la moltiplicazione di nuove cellule si
può indurre anche da tessuti già differenziati che
subiscono un processo di sdifferenziamento
Si formano quindi ammassi amorfi, definiti calli,
che possono essere mantenuti indefinitamente in
vitro o possono essere indotti a rigenerare organi
o piante intere
6
Callo
Rappresenta la naturale risposta della pianta
ad una ferita
E’ una massa di cellule in attiva divisione per
la produzione di cellule indifferenziate
prodotte da espianti di tessuto vegetale
E’ formato da cellule totipotenti
7
Coltura in vitro
Tutti i vegetali possono essere considerati
sorgenti potenziali di cellule per coltura in vitro
Alcune specie sembrano fare eccezione a tale
regola, ma è probabile una erronea scelta delle
condizioni colturali
Infatti le condizioni colturali possono mostrare
differenze significative in relazione a sostanze
specifiche e condizioni microambientali utilizzati
8
Principali caratteristiche
Si effettuano:
su micro scala
in condizioni ambientali
ottimizzate (nutrienti, luce,
temperatura)
in assenza di microrganismi
(funghi, batteri, virus).
9
1. Storia
]
Teoria cellulare e totipotenza
]
Formazione del callo e sostanze di crescita
]
Prime colture cellulari
]
Prime colture di tessuti vegetali
]
Colture di organi vegetali
10
Teoria cellulare ….
Le cellule furono osservate per
la prima volta nel 1664 da
Robert Hooke, che studiò con
un microscopio rudimentale
sottili fettine di sughero e vide
che esse erano formate da
elementi di forma regolare.
Egli chiamò cellule questi
elementi (dal latino cellula,
"piccola stanza"), perché esse
avevano l'aspetto di piccole
scatole.
Cork tissue as observed by Robert Hooke11
in 1664
Le prime colture cellulari….
…Haberlandt .. agli inizi del 1900
… propose il concetto di totipotenza
… cellule allevate in adatte conditizioni
Callo coltivato a partire dal cambio
(Gautheret, Nobecourt, Whire nel 1930)
… le cellule restavano vive ma non si
moltiplicavano
12
Le prime colture di tessuti ….
- in funzione della scoperta dei
“Regolatori di crescita”
Distensione cellulare … ruolo delle auxine
Divisione cellulare ... ruolo delle citochinine
Rigenerazione di tabacco ....
(Skoog and Miller) …. interazione tra auxine
e citochinine dava differenziazione.
13
Successivi sviluppi …
GA per la crescita dei germogli
Aux + Cyt + zucchero
> sviluppo vascolare
Colture di ‘strati sottili’
… interazione con altri fattori es. pH
14
Il
primo uso commerciale di piante
propagate su mezzo artificiale è
stato fatto per la germinazione e lo
sviluppo di orchidee nel 1920
15
Pianta di carota da cellule radicali – Stewart in 1964
16
Pianta di tabacco da singola cellula
– Vasil & Hilderbrandt 1965
17
Coltura di organi vegetali ….
… ma la coltura delle piante in vitro ha visto il suo pieno
sviluppo grazie alla messa a punto di un mezzo di coltura
artificiale da parte di Murashige & Skoog nel 1962
→ micropropagazione
18
2. Tipi di cellule e tessuti
] Molti tipi di cellule
] Grado di specializzazione diversificato
- Meristematico
- Embrionale
- Riproduttivo
19
Tessuti meristematici ...
] Germoglio
... apicale,
… ascellare
20
tunica
corpus
new leaf
apical
meristem
leaf trace
axillary
meristem
procambium
cortex
pith
21
Tessuti meristematici ...
] Germogli ... apicali,
… ascellari
] Foglie
] Radici
22
Tessuti embrionali ...
]
Piante pre-formate
]
Germinali / somatici
]
Giovanile
23
Tessuti riproduttivi ...
]
Diploide / Aploide
]
Femminile / Maschile
24
3. Regolatori di crescita
] Le auxine
] Le citochinine
] Le gibberelline (GA)
] L’acido abscissico (ABA)
] L’etilene
25
Regolatori di crescita
Auxine
Essenziali (non sono noti effetti mutageni)
Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3-
Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA,
IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) – meno costosi e
più stabili
Stimolazione della distensione cellulare in fusti e
coleoptili
Promuovono la radicazione
Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in
quelli apicali (inibizione della crescita delle
gemme laterali)
26
Regolatori di crescita
Citochinine
Essenziali (non sono noti effetti mutageni)
Un solo composto naturale la Zeatina;
analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e
Kinetin
Stimola la divisione cellulare
Promuove la formazione di gemme avventizie
Sono sintetizzate nel meristema radicale e
trasportate nel floema sotto forma di Zeatinriboside
27
Regolatori di crescita
Gibberelline
Questa classe comprende più di 70 composti,
varie forme dell’ acido gibberellico
In commercio sono disponibili diversi
formulati (GA3, GA4, GA9)
Stimola l’eziolatura dello stelo
Sintetizzate nelle giovani foglie
28
Regolatori di crescita
Acido abscissico (ABA)
Esiste solo un componente naturale
Promuove l’abscissione delle foglie e la
dormienza dei semi
Gioca un ruolo dominante nella chiusura
degli stomi in condizioni di stress idrico
Ha un ruolo importante nell’embriogenesi
(aiuta la formazione di embrioni normali)
29
Auxine
Alte
Bilancio ormonale
Citochinine
Basse
Formazione di radici dopo il taglio
Embriogenesi
Formazione di radici avventizie
Induzione a callo
Formazione di germogli avventizi
Crescita di germogli ascellari
Basse
Alte
30
Rapporto auxine : citochinine
31
Mezzo di coltura in vitro
Elementi minerali (17 elementi essenziali)
Fonte d’energia e di carbonio (saccarosio)
Regolatori di crescita (fitormoni)
Vitamine
Composti organici
Acqua
pH (5.0-5.7)
Gelling agents: Agar, agarose, gellan gum
32
Composti inorganici
Macroelementi (>mg/l di N, P, K, Ca, Mg e
S) e microelementi (<mg/l Fe, Cu, Mn, Co,
Mo, B, I, Zn, Cl e alcune volte Al, Ni e Si).
Disponibili formulazioni commerciali in
polvere
Murashige and Skoog Medium (1965) è il
mezzo di coltura più comune
Il mezzo Gamborgs B5 è più diffusamente
utilizzato per colture cellulari in sospensione.
33
Vitamine
Un ampio range di vitamine sono disponibili
e possono essere usate
Generalmente, più è piccolo l’espianto, più
appropriata deve essere la scelta della/e
vitamine
Un cocktail di vitamine è spesso usato
L’inositolo di solito deve essere aggiunto a
maggiori concentrazioni (100mg/l)
34
Vitamine
Tiamina
Piridossina
Acido nicotinico
Biotina
Acido Citrico
Acido Ascorbico
Myo-inositolo
35
La rigenerazione può avvenire
via
organogenesi
via embriogenesi somatica
36
Organogenesi
L’organogenesi prevede la formazione
di germogli, foglie e radici e si verifica
quando si differenziano in vitro centri
meristematici unipolari quali le gemme
avventizie
Questi organi possono derivare da
meristemi preesistenti o da cellule
indifferenziate
Come per l’embriogenesi può aversi
una fase intermedia di callo, ma spesso
si osserva senza il passaggio da questo
stadio
37
Organogenesi
La differenziazione di radici e germogli in colture di
tessuto di tabacco era funzione del rapporto auxinecitochinine, e la differenziazione dell’organo potrebbe
essere regolato dal cambiamento delle concentrazioni
relative delle due sostanze nel mezzo di coltura
1957 Skoog and Miller
38
Embriogenesi Somatica
L’embriogenesi somatica consiste nella produzione di embrioni
da cellule somatiche o non germinanti, la rigenerazione
comporta la successione delle fondamentali fasi di sviluppo che
caratterizzano la differenziazione dell’embrione zigotico
Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare, priva di
connessioni vascolari con il tessuto originario, che evolve in un
embrione cotiledonare
39
Acclimatamento
Le piante ottenute in vitro devono
essere preparate alla sopravvivenza in
vivo
Alta umidità
Luce
Temperature tra 20-25°C
Elementi nutritivi
Terreno adatto
40
41
Applicazioni delle colture in vitro
micropropagazione e rapida moltiplicazione di cloni
rigenerazione e trasformazione genetica
induzione di variazione somaclonale
ottenimento di aploidi da micro e macrospore
allevamento e mantenimento di piante virus esenti
manipolazione di protoplasti ed ibridazione somatica
conservazione del germoplasma
produzione di metaboliti di interesse industriale
42
