Manipolazione in vitro, colture cellulari, rigenerazione e
clonazione.
Totipotenza: capacità propria di cellule differenziate di mantenere
la piena potenzialità genetica e di esprimerla in determinate
condizioni, in modo da ottenere la rigenerazione di un nuovo
individuo. E’ spesso genotipo- ed espianto-dipendente.
This internode section has been cultured
for 5 days on media containing plant
growth regulators. Note the new shoots
developing - this is called organogenesis.
Internode section of Parrot feather.
Per mettere a crescere in vitro dei tessuti vegetali si procede
con una serie di passaggi:
-Scelta e prelievo dell’espianto (porzione di tessuto)
-Sterilizzazione superficiale con candeggina
-Messa a dimora in terreno di crescita sterile
La crescita in vitro richiede la presenza di sostanze nutritive minerali.
La crescita in vitro intesa come divisione e proliferazione richiede
anche la presenza di composti che stimolano il ciclo cellulare e il
de-differenziamento: auxine e citochinine (NON CITOCHINE!!)
Organogenesi in vitro: sviluppo, separato nel tempo, di distinti organi
vegetativi partendo da un espianto
somatico.
Dipende dall’applicazione di ormoni (auxine e citochinine) e dalla
abilità del tessuto a rispondere agli ormoni con un programma di
sviluppo.
Divisibile in tre fasi in base al bilancio ormonale necessario:
1- acquisizione della competenza alla rigenerazione di organi (abilità,
de-differenziamento);
2- le cellule competenti vengono stimolate verso un programma di
sviluppo determinato per un organo specifico in base all’ormone
aggiunto;
3- la morfogenesi prosegue in modo autonomo e indipendentemente
dagli ormoni aggiunti.
1- acquisizione della competenza alla rigenerazione di organi (abilità,
de-differenziamento);
Messa a dimora dell’espianto, aggiunta di ormoni (auxine e citochinine)
ad una concentrazione tale da stimolare la divisione mitotica e la
crescita indifferenziata
formazione del callo
Il parametro importante è
il
rapporto
tra
le
concentrazioni dei due
ormoni,
di solito non devono avere
la stessa concentrazione.
2- le cellule competenti vengono stimolate verso un programma di
sviluppo determinato per un organo specifico in base all’ormone
aggiunto;
L’induzione alla rigenerazione degli organi avviene modificando il
rapporto tra le concentrazioni dei due ormoni:
sbilanciandolo verso le citochinine ( aux.)
sviluppo parte aerea
sbilanciandolo verso le auxine ( citoc.)
sviluppo radici
3- la morfogenesi prosegue in modo autonomo e indipendentemente
dagli ormoni aggiunti.
Una volta ottenuta la piantina rigenerata non è più necessario
aggiungere gli ormoni, la pianta cresce autonomamente.
Quando è sufficientemente cresciuta, la piantina
può essere trasferita in terra indistinguibile dalla pianta madre
Applicazioni:
micropropagazione,
clonazione vegetale,
piante transgeniche,
materiale pathogen-free.
Problemi:
laboriosità,
sterilità,
variazione somaclonale,
mosaicismo o chimerismo,
fragilità degli organismi rigenerati,
abituazione.
Embriogenesi somatica: sviluppo di embrioni partendo da cellule
somatiche, senza fecondazione e sviluppo dello zigote.
Embriogenesi
Nell’embrione degli animali si definiscono già tutti gli organi e tessuti
dell’individuo adulto,
nelle piante si ha invece lo sviluppo di un abbozzo di pianta (l’asse
embrionale e i due cotiledoni) che solo in un secondo tempo e durante
tutta la vita della pianta genererà tutti gli organi grazie all’attività dei
meristemi.
Già nell’asse embrionale si definiscono però:
- la simmetria radiale dei tessuti negli organi
- l’asse di sviluppo verticale apice-base
- i meristemi primari attivi dopo la germinazione.
Lo sviluppo dell’embrione dopo la fecondazione di un ovulo nella
pianta madre segue una serie di fasi ben precise diverse nelle varie
piante, ma ben caratterizzate in Arabidopsis.
Globo/sfera
Cuore
Torpedine
Stadio cotiledonare
Durante le tre fasi principali si osserva che:
la definizione dell’asse di simmetria apice-base avviene già alla prima
divisione mitotica dello zigote (cellula apicale e basale),
già nello stadio a cuore si evidenziano tre porzioni:
apicale cotiledoni e
meristema
centrale ipocotile
basale radici
Embriogenesi somatica:
nel
callo
in
sottopopolazione
(masse
crescita
degli
una
aggregati
proembriogeniche,
PEM)
mostra la capacità di dare origine ad
embrioni somatici, che si sviluppano in
modo analogo a quelli zigotici.
Tale capacità si manifesta al momento
della
rimozione
degli
ormoni
dal
terreno.
A.PEM formation in immature zygotic embryos B. Same photo showing a close up of PEMs (10X). C. PEMs forming at the base of immature
whole seeds D. Same photo showing close up of PEMs (10X). E. PEM formation in split seeds F. Close up of PEMs shown in D (10X).
Heart-shaped somatic embryo
of rose
Somatic embryos of cassave; different stages
Gli ormoni sono necessari per indurre lo sviluppo del callo e per indurre
tale potenzialità embriogenetica.
Induzione: in presenza continua di ormoni le PEM producono tutti i
prodotti genici necessari per la fase globulare ma anche prodotti che ne
inibiscono il successivo sviluppo coltura cellulare con potenzialità
embriogenetica.
Rimuovendo gli ormoni si
interrompe la sintesi degli
inibitori
l’embriogenesi prosegue
da sola
Il
completamento
del
programma è garantito
dalla sintesi endogena
dell’ormone. Non si hanno
le fasi successive di
dormienza.
Applicazioni embriogenesi somatica:
- moltiplicazione vegetativa,
- semi artificiali o disidratazione indotta da ABA,
Vantaggi:
- no chimerismo perché derivano probabilmente da
singole cellule.
Artificial seed
Somatic embryo
Artificial endosperm
Protoplasti
Manipolazione cellule vegetali singole, ottenute per degradazione della
parete vegetale ad opera di enzimi idrolitici (cellulasi, emicellulasi e
pectinasi, di origine fungina).
