INDICE
ABBREVIAZIONI…………………………………………………………………..3
SOMMARIO………………………………………………………………………...9
SUMMARY…………………………………………………………………………13
1
INTRODUZIONE…………………………………………………………….. 17
1.1 Il citomegalovirus umano (HCMV)……………………………………... 17
1.2 Struttura…………………………………………………………………... 18
1.3 Ciclo replicativo…………………………………………………………… 22
1.4 Fasi di maturazione e gemmazione del virione di HCMV………………. 25
1.5 Il tegumento……………………………………………………………… 28
1.6 Ruolo delle glicoproteine nel ciclo di replicazione……………………… 34
1.7 Il trafficking delle glicoproteine lungo il pathway endocitico e le
molecole trasportatrici……………………………………………………. 38
1.8 La glicoproteina B (UL55)……………………………………………….. 42
1.9 Proteine del pathway dei multivesicular body coinvolte nella
gemmazione di virus dotati di envelope…………………………………. 45
1.10 Ruolo dei multivesicular body nella gemmazione di virus a DNA……. 54
2 SCOPO………………………………………………………………………… 57
3
MATERIALI E METODI………………………………………………………. 59
3.1 Linee cellulari……………………………………………………………… 59
3.2 Ceppi virali………………………………………………………………… 60
3.3 Plasmidi……………………………………………………………………. 60
3.4 Oligonucleotidi innesco………………………………………………….. 64
3.5 Tecniche di biologia molecolare…………………………………………. 66
3.5.1
Purificazione del DNA plasmidico…………………………………………………66
3.5.2
Restrizioni enzimatiche……………………………………………………………. 68
3.5.3
Tecniche di clonaggio……………………………………………………………….68
3.5.4
Reazione di amplificazione a catena della polimerasi……………………………...70
3.5.5
Competenza e trasformazione batterica…………………………………………... 71
3.5.6
Mutagenesi sito specifica……………………………………………………………72
3.5.7
Sequenziamento dei plasmidi e purificazione delle sequenze……………………. 73
3.5.8
BAC mutagenesi……………………………………………………………………. 74
3.6 Tecniche di biologia cellulare……………………………………………... 76
3.6.1
Tecniche di trasfezione………………………………………………………………76
3.6.2
Trasduzione delle cellule HFF………………………………………………………78
3.6.3
Infezione delle colture cellulari con HCMV………………………………………. 79
3.6.4
Lisi cellulare…………………………………………………………………………79
3.6.5
Immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione……………………………..80
3.6.6
SDS-gel elettroforesi………………………………………………………………...80
3.6.7
Immunoblotting…………………………………………………………………… 81
3.6.8
Saggi di immunofluorescenza indiretta…………………………………………… 82
4 RISULTATI…………………………………………………………………….. 85
4.1 Ottenimento dei costrutti esprimenti l’omologo della gB di HSV-1 in
HCMV (UL55) in forma wt e in una forma parzialmente tronca a livello
della coda citoplasmatica………………………………………………….. 85
4.2 UL55 è ubiquitinata in cellule trasfettate ed infettate…………………. 86
4.3 UL55 colocalizza con le membrane dei MVB ed il suo trafficking
intracellulare richiede la corretta biogenesi dei MVB……………………. 89
4.4 Le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 sono coinvolte
nell’ubiquitinazione e degradazione di UL55 ed interagiscono con la
glicoproteina attraverso il suo motivo PPSY……………………………... 95
4.5
UL55PPSA mostra una differente localizzazione rispetto a UL55wt e
UL55833 in cellule trasfettate………………………………………………. 99
4.6 UL55PPSA e la forma wt in presenza di Vps4E228Q rilocalizzano a livello
delle membrane degli endosomi precoci…………………………………. 100
4.7 UL55 segue la via dei MVB/lisosomi…………………………………….. 101
4.8 Localizzazione dei mutanti di UL55 nel contesto dell’infezione virale… 102
4.9 Ruolo delle deubiquitinasi AMSH e UBPY……………………………… 104
4.10 UL55, ma non UL55833, interagisce con Tsg101………………………... 105
4.11 La proteina dei MVB Tsg101 è reclutata all’assembly compartment…... 111
4.12 Costruzione di virus ricombinanti mediante tecnologia BAC………… 114
5 DISCUSSIONE………………………………………………………………….117
6
BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………….. 129
ABBREVIAZIONI
AA
aminoacido/i
AAA
ATPase associated with various cellular activities
AC
assembly complex o assembly compartment
Ab
anticorpo
AC-LL
acidic cluster-dileucine signal
AIP1
ALG-2 interacting protein 1
AIP4
atrophin-1 interacting protein 4
Alix
ALG-2 interacting protein x
Amp
ampicillina
AMSH
SH3 domain of STAM
AP
adaptor protein
Ara
arabinosio
ATP
adenosina trifosfato
BAC
bacterial artificial chromosome
pb
paia di basi
BSA
albumina di siero bovino
CAF
cloramfenicolo
CHMP
charged multivesicular body protein
CC
coiled-coil
CCV
clathrin coated vescicles
CKII
casein kinase-II
co-IP
co-immunoprecipitazione
CPD
carbossipeptidasi D
DB
dense body
DLD
Disintegin-Like Domain
DMEM
Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DNA
acido desossiribonucleico
D.O.
densità ottica
d.p.i.
day post-infection
DUB
de-ubiquitinating enzyme
E
early, precoce
EBV
virus di Epstein-Barr
EDTA
acido etilendiamminotetracetico
EE
early endosome
EEA-1
early endosomal antigen-1
EIAV
virus dell’anemia infettiva equina
ERC
endocytic recycling compartment
ESCRT
endosomal sorting complex required for transport
EGFR
epidermal growth factor receptor
FBS
fetal bovine serum
FCS
fetal calf serum
FITC
isotiocianato di fluoresceina
g
glicoproteina
GAT
GGA and TOM
gc
glycoprotein complex
GCV
Ganciclovir [2-amino-9-(1,3-dihydroxy
propan-2 yloxymethyl)-3-H-purin-6-one]
GFP
green fluorescent protein
GGA
ADP-rybosilation factor(ARF)-dependent clathrin adaptor
GLUE
GRAM-like ubiquitin binding in EAP45
GPCR
recettori accoppiati a proteina G
Grp
glucose regulated protein
h
ore
HA
emoagglutinina
HBV
virus dell’epatite B
HCMV
citomegalovirus umano
HECT
homologous to E6-AP C terminus
HFF
human foreskin fibroblasts
HHV
human herpesvirus
HIV-1
virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1
h.p.i.
hours post-infection
HRP
horseradish peroxidase
Hrs
hepatocyte growth factor-regulated tyrosine
kinase substrate
HSV
herpes simplex virus
IE
immediate early, precocissimo
Ig
immunoglobuline
ILV
vescicole intraluminali
IP
immunoprecipitazione
IF
immunofluorescenza
Kan
kanamicina
kb
kilobasi
kDa
kiloDalton
L
late, tardivo
LAMP-1
lysosome associated membrane protein-1
LB
loading buffer
LB-Medium
Luria Bertani-Medium
LE
late endosome
LTP
large tegument protein
LTPbp
large tegument protein binding protein
LTR
long terminal repeat
MAb
anticorpo monoclonale
MCMV
citomegalovirus murino
MCP
major capsid protein
mCP
minor capsid protein
MCR5
human embryonic lung fibroblast
MEM
Eagle’s minimum essential medium
µg
microgrammi, 10-6 g
MIEP
major IE promoter enhancer
µl
microlitri, 10-6 litri
m.o.i.
molteplicità d’infezione
MoMLV
virus della leucemia murina di Moloni
MPR
mannose 6-phosphate receptor
MTOC
microtubule organizing center
MVB
multivesicular body
Nedd4
neuronal precursor cell-expressed developmentally
down-regulated-4
ng
nanogrammi, 10-9 g
NIEP
non-infectious enveloped particle
nm
nanometri, 10-9 m
NTP
nucleotide trifosfato
ORF
open reading frame
PAb
anticorpo policlonale
PACS-1
phosphofurin acid cluster sorting protein-1
PBS
phosphate buffer saline (tampone fosfato)
PBS-Tween 0,1%
PBS addizionato di Tween 20 0,1%
PCR
polymerase chain reaction
PFA
paraformaldeide
PFU
unità formanti placca
PI
fosfatidilinositolo
PI(3)P
fosfatidilinositolo 3-fosfato
PIP3
phosphadtidylinositol (3,4,5)-trisphosphate
Plk
polo-like kinase
pp
fosfoproteina
PPxY
Pro-Pro-x-Tyr
PRV
pseudorabies virus
P(T/S)AP
Pro-Thr/Ser-Ala-Pro
p/v
peso-volume
PVDF
polivinilidendifluoride
RE
reticolo endoplasmatico
RNA
acido ribonucleico
rpm
rivoluzioni per minuto
RSV
virus del sarcoma di Rous
SB
steadiness box
SH3
src homology-3
SDS
dodecilsolfato di sodio
SDS-PAGE
SDS-Poliacrilammidegelelettroforesi
siRNA
small interfering RNA
SIV
virus dell’immunodeficienza nella scimmia
STAM
signal transducing adaptor molecule
TOM
target of myb1
TBE
trisborato EDTA
TGN
trans-Golgi network
TK
timidina chinasi
TLR
toll-like receptor
TM
transmembranario/a
Tsg101
tumor susceptibiliy gene 101
Ubi
ubiquitina
UBP
ubiquitin isopeptidase
UBPY
ubiquitin-specific processing protease Y
UEV
ubiquitin E2 variant
UIM
ubiquitin-interacting motif
UL
unique long
US
unique short
USP
ubiquitin-specific protease
UV
luce ultravioletta
Vps
vacuolar protein sorting
v/v
volume-volume
VZV
virus della Varicella Zoster
YPxL
Tyr-Pro-x-Leu
VHS
Vps27, Hrs, STAM
VSV
virus della stomatite vescicolare
WB
western blotting
wt
wild-type
WW
triptofano-triptofano
SOMMARIO
Il sistema endosomiale delle cellule eucariotiche è una complessa rete di
compartimenti membranosi che coordinano il trasporto delle proteine tra la
membrana plasmatica, il trans-Golgi network (TGN) ed i lisosomi. Un ruolo
centrale a questo livello è svolto da un organello identificato con il termine
multivesicular body (MVB). Numerose proteine coinvolte nella biogenesi di
questo pathway sono essenziali per la gemmazione di virus ad RNA dotati di
envelope come retrovirus (Göttlinger et al., 1991), rhabdovirus, filovirus (Strack
et al., 2000), arenavirus e paramyxovirus (Strack et al., 2003). Più recentemente è
stato chiarito che anche alcuni virus a DNA dotati di envelope, ed in particolare
l’herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) (Calistri et al., 2007; Crump et al., 2007),
il virus dell’epatite B (HBV) (Lambert et al., 2007; Watanabe et al., 2007),
l’herpes virus umano di tipo 6 (HHV-6) (Mori et al., 2008) ed il citomegalovirus
umano (HCMV) (Tandom et al., 2009), sfruttano le membrane dei MVB per
assemblaggio e gemmazione. La teoria attualmente più accreditata riguardo al
processo di acquisizione del pericapside ed al meccanismo di gemmazione degli
herpesvirus è la teoria del doppio envelopment in base alla quale il virione
acquisisce a livello della membrana nucleare interna un envelope primario, che
viene perso per gemmazione dalla membrana nucleare esterna. Il virione acquisce,
infine, l’envelope secondario e definitivo a livello di organelli intracitoplasmatici
di natura membranosa. La morfogenesi di HCMV è completata in un
compartimento perinucleare che il virus forma durante l’infezione noto come
assembly complex o assembly compartment (AC).
Questo progetto nasce dalle evidenze messe in luce nel nostro gruppo di ricerca
che dimostrano come la glicoproteina gB di HSV-1 svolga un ruolo centrale nel
permettere al virus di sfruttare il pathway dei MVB durante le fasi finali del
proprio ciclo replicativo. La glicoproteina, infatti, colocalizza con noti marcatori
dei MVB ed il suo traffico intracellulare e maturazione richiedono la corretta
biogenesi di questi organelli. Inoltre, gB è ubiquitinata a livello della coda Cterminale dove si localizzano i residui coinvolti in endocitosi e trafficking
intracellulare (Calistri et al., 2007).
Partendo dal presupposto che gB è una delle glicoproteine più conservate tra gli
herpesvirus, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di analizzare se anche
nel caso di altri virus appartenenti alla famiglia Herpesviridae, che sembrano
utilizzare i MVB per la propria maturazione e/o gemmazione, questa glicoproteina
rappresenti uno degli anelli di congiunzione tra virus e pathway cellulare. In
particolare, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla gB di HCMV (UL55),
essendo le evidenze a sostegno del ruolo dei MVB nel ciclo replicativo di questo
virus ancora contraddittorie (Fraile-Ramos et al., 2007; Tandom et al., 2009).
Mentre normalmente questa glicoproteina localizza a livello dell’AC (Sanchez at
al., 2000), abbiamo dimostrato attraverso saggi di immunofluorescenza (IF) che,
in cellule nelle quali la biogenesi dei MVB viene bloccata, gB rimane dispersa nel
citoplasma delle cellule infettate. In cellule trasfettate, invece, il blocco della
biogenesi di questo pathway ne determina l’accumulo sia a livello intracellulare
sia in compartimenti membranosi e la rilocalizzazione a livello di siti positivi per
EEA-1 (early endosomal antigen-1), un marcatore degli endosomi precoci. Questi
dati suggeriscono il coinvolgimento dei MVB e la necessità della loro corretta
biogenesi nel trafficking anche della gB di HCMV.
Inoltre, i nostri dati mostrano che UL55, ma non altre glicoproteine di HCMV,
quali UL75 (gH), è ubiquitinata sia in cellule infettate sia in cellule trasfettate con
costrutti che mediano la sua espressione. Significativamente, abbiamo osservato
che UL55 presenta un sequenza PPSY, reminiscente del motivo PPxY, sequenza
consenso che media l’interazione con proteine caratterizzate da domini WW, quali
le ubiquitino ligasi E3 della famiglia Nedd4 (Strack et al., 2000). Infatti, siamo
stati in grado di dimostrare che le ubiquitino ligasi di questa famiglia, che sono
implicate nella biogenesi dei MVB (Staub et al., 1997), interagiscono fisicamente
con UL55, proprio attraverso il motivo PPSY, e sono coinvolte nella sua
ubiquitinazione e nella sua degradazione lisosomiale, almeno in condizioni di
over-espressione. In particolare abbiamo osservato che: i) quando sovraespresse le
ubiquitino ligasi portano ad una significativa riduzione dei livelli di UL55 in
cellule co-trasfettate con il costrutto esprimente la glicoproteina virale; ii) almeno
in condizioni di sovraspressione, UL55 si accumula nelle cellule in presenza
dell’inibitore dei lisosomi bafilomicina.
Il complesso ruolo giocato dall’ubiquitinazione nel trafficking di UL55 è stato
ulteriormente dimostrato indagando la funzione svolta, a questo livello, dalle due
de-ubiquitinasi AMSH e UBPY, entrambe attive a livello dei MVB (Clague and
Urbè, 2006). Coerentemente al modello prevalente in letteratura (Welchman et al.,
2005), i nostri risultati suggeriscono che AMSH sia coinvolta nella
deubiquitinazione di UL55 al fine di favorire il suo reciclo, mentre UBPY la
deubiquitini per permetterne l’incorporazione nei MVB.
A dimostrazione ulteriore del coinvolgimento dei MVB nel destino intracellulare
di UL55, quest’ultima, ma non gB di HSV-1 nè gB del virus della pseudorabbia
(UL27), interagisce anche con Tsg101, un’altra proteina fondamentale per la
biogenesi dell’organello cellulare. È noto che le proteine che interagicono con tale
componente dei MVB contengono un dominio aminoacidico ricco in proline di
tipo P(T/S)AP. UL55 non contiene sequenze consenso sovrapponibili a tale
motivo e i nostri dati permettono di escludere che il legame sia mediato dalle
ubiquitino ligasi Nedd4 o da alcune proteine adattatrici, che reclutano a livello
endosomiale e del TGN proteine ubiquitinate destinate ai MVB (Hrs, GGA, Tom).
Abbiamo, invece, dimostrato che il legame tra UL55 e Tsg101 è mediato dalla
coda citoplasmatica della glicoproteina e dal dominio N-terminale UEV (ubiquitin
E2 variant) di Tsg101. Mutanti di Tsg101 a livello del dominio UEV che non
legano più l’ubiquitina o L-domain di tipo P(T/S)AP, invece, continuano ad
interagire con UL55. Infine saggi di IF in cellule infettate hanno messo in luce che
la proteina Tsg101 è reclutata all’AC. Ulteriori esperimenti chiariranno il
meccanismo molecolare alla base di questa interazione.
Consapevoli che i dati ottenuti, pur indicando un ruolo chiaro per i MVB nel
trafficking della gB di HCMV, erano stati ottenuti principalmente in cellule
trasfettate, abbiamo voluto analizzare la rilevanza funzionale e biologica dei nostri
risultati ottenendo, mediante mutagenesi basate sulla strategia BAC (bacterial
artificial chromosome), virus ricombinanti caratterizzati da specifiche mutazioni a
livello di UL55 o dalla sua completa delezione. L’analisi di questi mutanti in
termini di crescita, localizzazione intracellulare di specifiche proteine virali e/o
cellulari (saggi di IF) e maturazione/gemmazione dei virioni (saggi di microscopia
elettronica) chiariranno il ruolo delle interazioni tra UL55 e le proteine dei MVB
nel ciclo replicativo di HCMV.
Nel complesso fino a questo momento i nostri dati mostrano che UL55, come la
gB di HSV-1, è una delle proteine chiave che associa envelopment e gemmazione
virali al pathway dei MVB.
SUMMARY
The eucaryotic endosomal system is a complex network of vesicles and organelles
surrounded by membranes which coordinates protein transport between the
plasma membrane, the trans-Golgi network (TGN) and the lysosomes. A central
role at this level is played by an organelle named multivesicular body (MVB).
Several proteins involved in the MVB biogenesis are essential for budding of
RNA-enveloped viruses, like retroviruses (Göttlinger et al., 1991), rhabdoviruses,
filoviruses (Strack et al., 2000), arenaviruses and paramyxovirus (Strack et al.,
2003). More recently it has been clarified that also some DNA-enveloped viruses,
and in particular Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) (Calistri et al., 2007;
Crump et al., 2007), Hepatitis B Virus (HBV) (Lambert et al., 2007; Watanabe et
al., 2007), Human Herpes Virus type 6 (HHV-6) (Mori et al., 2008) and Human
Cytomegalovirus (HCMV) (Tandom et al., 2009), exploit the MVB membranes
for their assembly and budding. The more accredited view concerning
herpesviruses envelopment and budding is the ‘double envelopment theory’,
envisioning that virion acquires at the level of the inner leaflet of the nuclear
membrane a primary envelope, that it is lost by budding from the outer nuclear
membrane. Finally, virions acquire the secondary and final envelope at the level
of intracytoplasmic membranous organelles. HCMV morphogenesis is completed
in a virally induced perinuclear compartment, referred as ´assembly compartment’
or ‘assembly complex’ (AC).
This project moves from the data obtained in our laboratory regarding HSV-1 gB
as one of the protein linking the virus to the MVB pathway. Indeed, the
glycoprotein colocalizes with well-known MVB markers and its intracellular
trafficking and maturation require the correct biogenesis of these organelles.
Furthermore, gB is ubiquitinated in the C-terminal tail at the level of residues
involved in endocytosis and trafficking between endosomes, TGN and lysosomes
(Calistri et al., 2007).
The aim of this work was to contribute to elucidate whether other viruses of the
Herpesviridae family hijack the same cellular pathway and whether the HSV-1
gB behaviour is conserved among some glycoprotein homologs. In particulare, we
decided to focalized our attention on HCMV gB (UL55). By immunofluorescence
assays (IF) we observed that the MVB block results in the gB accumulation both
in the cytoplasm and in membrane compartments and in the gB relocalization at
the level of intracytoplasmic enlarged vesicles positive for the endosomial marker
EEA-1, while in infected cells the glycoprotein recruitment to the AC is impaired.
Therefore, these data suggest that, like for HSV-1 gB, also UL55 intracellular
trafficking requires a functional MVB biogenesis. Moreover, in support to a role
for MVBs/lysosomes in gB fate, we were able to show that, in transfected cells,
the glycoprotein accumulates in the presence of the lysosome inhibitor
bafilomycin. UL55 contains a PPxY domain, that matches the consensus sequence
for ligands recognized by the E3 ubiquitin ligases of the Nedd4 family. Our
results show that UL55, but not UL75 (gH), is ubiquitinated both in infected and
transfected cells and that the Nedd4-like ubiquitin ligases specifically interact
with HCMV gB through its PPSY motif and are involved in its ubiquitination and
lysosomial degradation.
We also analyzed the AMSH and UBPY role in UL55 deubiquitination.
Consistently to the model reported in literature (Welchman et al., 2005), our
results suggest that AMSH causes the UL55 deubiquitination for its recycling,
while UBPY deubiquitinates it to permit its MVB incorporation.
As a further evidence of the MVB involvement in the UL55 intracellular fate the
HCMV glycoprotein, but not HSV-1 gB nor the Pseudorabies Virus gB (UL27),
interacts also with another protein essential for the MVB biogenesis, Tsg101.
From the literature it is known that proteins interacting with this MVB component
contain a P(T/S)AP L-domain. Since UL55 does not contain such a consensus
sequence, we investigated the possible mechanism for this interaction. We
excluded that the binding could be mediated by the ubiquitin ligases Nedd4-like
or other adaptor proteins recruiting at the endosomes or at the TGN ubiquitinated
cargoes addressed to the MVBs (Hrs, GGAs, Toms). Moreover, we clarified that
the interaction between UL55 and Tsg101 depends on the glycoprotein
cytoplasmic tail and the N-terminal UEV (ubiquitin E2 variant) domain of
Tsg101. On the other hand, Tsg101 mutants in the UEV that do not interact with
the ubiquitin nor with the P(T/S)AP L-domain of HIV-1 Gag p6 domain, continue
to co-immunoprecipitate with UL55. Finally, confocal miscroscopy highlighted
that Tsg101 is recruited to the AC during the infection. Further experiments will
shed light on the molecular mechanism needed for this interaction.
To move our UL55 characterization toward a functional and biological analysis,
we built, by employing BAC mutagenesis, recombinant viruses carrying gB
specific mutations or lacking the glycoprotein coding sequence. The analysis of
these mutants in terms of viral growth, protein localization (analyzed by IF) and
virion maturation and egress (analyzed by electron microscopy assays) will clarify
the role of the interactions between UL55 and MVB proteins for the HCMV life
cycle.
Overall, our data point out to HCMV gB, in a simil way to HSV-1 gB, as the key
protein that links HCMV envelopment-egress to the MVB pathway.
__________________________________________________________________Introduzione
1
1.1
INTRODUZIONE
Il citomegalovirus umano (HCMV)
Il citomegalovirus umano (HCMV) o herpesvirus umano di tipo 5 (HHV-5) è il
più grande membro della famiglia Herpesviridae ed uno dei patogeni umani di
maggiori dimensioni.
La famiglia comprende complessivamente più di 120 membri, ampiamente
distribuiti in natura e caratterizzati dalla capacità di provocare infezioni che, dopo
l’esaurimento della fase clinica conseguente all’infezione primaria, si mantengono
allo stato latente per moltissimi anni o per tutta la vita. Periodicamente il virus
latente può riattivarsi spontaneamente o in seguito ad una varietà di stimoli non
ancora del tutto chiariti (stress, radiazioni U.V., traumi nel sito originario di
infezione,
ipertermia,
diminuzione
dell’immunità
cellulo-mediata),
con
ricomparsa o meno di manifestazioni cliniche evidenti. Gli herpesvirus sono
suddivisi in tre sottofamiglie: α Herpesviridae, β Herpesviridae e γ Herpesviridae
(Roizman et al., 1981).
L’uomo è ospite naturale di 8 membri:
α herpesvirus: l’herpes simplex virus di tipo 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) e il
virus della Varicella Zoster (VZV);
β herpesvirus: HCMV e gli herpesvirus umani di tipo 6 e 7 (HHV-6,
HHV-7) (Roseolovirus);
γ herpesvirus: l’Epstein-Barr virus (EBV) e l’herpesvirus umano di tipo 8
(HHV-8).
L’HCMV è un patogeno umano ubiquitario ed è classificato come β herpesvirus
in base alle sue proprietà biologiche e alla struttura del genoma virale. L’analisi
comparativa della sequenza genomica ha portato alla correlazione e
classificazione nella stessa sottofamiglia anche dei virus umani HHV-6A, HHV6B e HHV-7 e tra i non umani del citomegalovirus murino (MCMV) e del
Proboscivirus (EIHV-1). I CMV non umani differiscono in termini di struttura
genomica e non è stato riportato causino patologie nell’uomo.
I β herpesvirus sono caratterizzati complessivamante dalla capacità di infettare
uno stretto spettro d’ospite, da un lungo ciclo riproduttivo e da una lenta crescita
in coltura.
17
_______________________________________________________________________________
L’infezione da HCMV decorre per lo più in maniera asintomatica in ospiti
immunocompetenti. Tuttavia è la principale causa virale di difetti alla nascita in
neonati con infezione congenita e la maggiore causa di gravi manifestazioni e
morte in pazienti immunocompromessi (Reddehase, 2006). La trasmissione può
avvenire con il contatto diretto con sangue e secrezioni contaminate, dal trapianto
di tessuti infetti e in rapporti sessuali. Durante la gravidanza, soprattutto nel primo
trimestre di gestazione, l'infezione primaria può causare la trasmissione transplacentare con possibilità di aborto e gravi danni al feto, frequenti in donne
sieropositive.
I meccanismi patogenetici alla base dell’infezione da HCMV non sono
attualmente del tutto chiariti. L’infezione primaria è caratterizzata da un alto
livello di replicazione virale in monociti e linfociti, in cui induce un caratteristico
effetto citopatico con la formazione di inclusioni citoplasmatiche e nucleari e la
distruzione del citoscheletro con conseguente ingrossamento della cellula
(citomagalia). Dopo la fase litica il virus rimane in latenza nel sangue periferico,
nell’epitelio dei tubuli renali e nell’epitelio delle ghiandole salivari. Antigeni e
acidi nucleici virali sono rilevabili in epiteli, endoteli, macrofagi e cellule
dendritiche, che sono nell’uomo le cellule ospiti dell’infezione. L’infezione
primaria acuta può portare a sintomi quali una sindrome simil-mononucleasica
con febbre, affaticamento e linfocitosi. La riattivazione virale è accompagnata da
un’infezione virale produttiva, che può determinare danni severi a carico di vari
organi come i polmoni (pneumonia), il sistema nervoso (encefaliti), la retina
(retiniti) e il sistema gastro-intestinale (coliti). L’infezione persistente può portare
a malattie di carattere proliferativo come l’aterosclerosi e il cancro gastrointestinale (Reddehase, 2006). La risposta T-citotossica è critica per il controllo
della repicazione virale. Per questo la terapia immunosoppressiva, necessaria per
prevenire il rigetto mediato dalle cellule T dopo il trapianto di organi solidi,
incrementa la suscettiblità all’infezione da HMCV.
1.2
Struttura
L’HCMV umano, come gli altri herpesvirus, è un virus molto complesso di circa
150-200 nm in diametro e costituito da un genoma virale a DNA lineare a doppio
filamento di 235 Kb lungo 65-68 nm e con un contenuto di GC del 58%. Il
18
_________________________________________________________________Introduzione
filamento di DNA consiste di due componenti covalentemente legati, chiamati L
(long) e S (short). Ciascun componente è formato da sequenze uniche, circondate
alle estremità da sequenze ripetute (repeats) invertite contenenti segnali cis-acting
coinvolti nel cleavage e nel packaging dei genomi della progenie virale. Le
repeats del componente L sono chiamate ab e a’b’, mentre qualle delle S sono
chiamate a’c’ e ca (Davison and Wilkie, 1981).
alan b
b’a’mc’
caS
Figura 1.2.1 Struttura del genoma di HCMV
aL e aS sono le sequenze terminali uniche ripetute, mentre am e an sono sequenze
terminali ripetute presenti in una o più copie, o in zero o più copie
rispettivamente. La lunghezza della sequenza a varia da ceppo a ceppo in un
intervallo dalle 700 alle 900 pb. I componenti L e S possono essere invertiti l’uno
rispetto all’altro, dando origine a quattro isomeri equimolari ed indipendenti
designati come P (prototype), IL (inversion of the L component), IS (inversion of
the S component) e ISL (inversion of both S and L component).
HCMV è in grado di codificare più di 200 proteine (Becker et al., 1968), di cui 70
sono conservate nel genoma di tutti i β herpesvirus. Tra i più importanti geni
conservati vi sono i geni precocissimi maggiori UL122 e UL123, coinvolti nella
regolazione dell’espressione genica, i geni precocissimi minori UL36 e UL37 che
codificano soppressori della morte cellulare, i geni regolatori precoci UL112UL113 e i trascritti della latenza. Il fatto che molti prodotti genici siano conservati
in tutta la famiglia Herpesviridae spiega le comuni modalità di replicazione virale.
Il ceppo di laboratorio AD169 contiene circa 150 ORF codificanti proteine, di cui
41 essenziali, 88 non essenziali e 27 in grado di aumentare la capacità replicativa
del virus nei fibroblasti (Shenk et al., 2003). Nel virione il DNA è impacchettato a
forma di toroide e va a costituire il core. Dopo l’ingresso del virus nelle cellule, in
assenza di sintesi proteica, le porzioni terminali del genoma sono probabilmente
in stretta prossimità, o addirittura legate insieme in forma di DNA circolare. Come
per gli altri membri della famiglia, il virione consiste di quattro elementi (Figura
1.2.2):
a) un core icosaedrico elettron-opaco, noto anche come nucleocapside;
19
_______________________________________________________________________________
b) un capside circondante il core, in cui le proteine virali formano 162
capsomeri (150 esoni e 12 pentoni), che arrangiano in una struttura
icosaedrica di 125 nm. Le 6 proteine che lo compongono sono: la proteina
capsidica maggiore (MCP) prodotto del gene UL86, la proteina capsidica
minore (mCP o TR11) codificata dal gene UL85, la proteina che lega la
proteina capsidica minore (TR12 o mC-BP, UL46), la più piccola proteina
capsidica (SCP, UL48-UL49), la proteina PORT (UL104), che costituisce
uno speciale pentone usato per la scapsidazione del DNA virale e UL80,
che è coinvolta nell’assemblaggio del capside.
c) uno strato proteico amorfo circondante il capside, il tegumento o matrice,
costituito da almeno 35 proteine virali (Kalejta, 2008; Tabella 1.2.1),
alcune proteine cellulari e molecole di RNA;
d) un rivestimento esterno detto pericapside o envelope lipidico, che
incorpora le glicoproteine virali (almeno 20) e alcuni componenti cellulari
(Mocarski et al., 2007, Tabella 1.2.1).
Figura 1.2.2 HCMV umano e principali strutture che lo costituiscono (Rechke et al., 1997).
Le cellule infettate da HCMV generano tre tipi di particelle virali: l’1% è
costituito da progenie infettiva matura, mentre il 99% consiste di virioni non
infettivi, comprendenti particelle provviste di envelope non infettive (noninfectious enveloped particles, NIEP) e per più del 50% da corpi densi (dense
bodies, DB). La quantità reciproca di questi tre differenti tipi di particelle dipende
dal ceppo virale e dalla molteplicità d’infezione (m.o.i.) (Reddehase, 2006;
Mocarski et al., 2007). I tre tipi di particelle possono essere separati sulla base di
differenze fisiche per sedimentazione in gradiente di densità. Le NIEP sono
composte dalle stesse proteine virali dei virioni infettivi e possiedono un capside,
ma mancano del DNA virale. In microscopia elettronica possono essere distinte
20
_________________________________________________________________Introduzione
dalle particelle infettive per la mancanza di un core di DNA elettron-denso
(Reddehase, 2006). I DB sono particelle più eterogenee per dimensioni provviste
di tegumento e envelope ma mancanti del DNA virale e del capside e, pertanto,
non replicative ma competenti per la fusione. Essi hanno una composizione
differente per contenuto di proteine del tegumento, con una prevalenza della
proteina pp65 (UL83) (Figura 1.2.3; Irmiere and Gibson, 1983; Streblow et al.,
2006).
Figura 1.2.3 Microscopia elettronica di virioni di HCMV e DB. Ingrandimento 8400X.
(Varnum et al., 2004).
Viral protein
Capsid
Tegument
HCMV ORF
UL46 (mC-BP)
Viral protein
Glycoproteins
HCMV ORF
Viral protein
HCMV ORF
RL10
Transcription-
IRS1
UL48-49 (SCP)
TRL14
replication
TRS1
UL80
UL4 (gp48)
Machinery
US3
UL85 (mCP)
UL5
UL86 (MCP)
UL22A
UL37
UL104 (PORT)
UL33
UL44
UL36
UL23
UL38
UL45
UL24
UL41A
UL51
UL25
UL50
UL54
UL26
UL55 (gB)
UL57
UL32 (pp150)
UL73 (gN)
UL69
UL47 (LTPbp)
UL74 (gO)
UL72
UL48 (LTP)
UL75 (gH)
UL84
UL50
UL77
UL89
UL53
UL93
UL97
UL71
UL100 (gM)
UL122 (IE1)
UL76
UL115 (gL)
UL123(IE2)
UL82 (pp71)
UL119
UL83 (pp65)
UL132
Uncharacterized
UL35
UL79
UL94
US27
UL88
UL99 (pp28)
US28
UL96
US22
TRL10
UL103
US23
TRL12
UL112
US24
Tabella 1.2.1 Proteine codificate da HCMV (Reddehase, 2006).
21
_______________________________________________________________________________
1.3
Ciclo replicativo
Sono noti diversi ceppi di HCMV: AD169, Towne, Davis, Toledo e Merilyn. Il
virus replica in molti diversi tipi cellulari nell’uomo e in particolare cellule
endoteliali ed epiteliali, fibroblasti e cellule muscolari liscie (Sinzger et al., 2008).
Tuttavia la maggior parte dei ceppi di laboratorio ha perso la capacità di infettare
cellule diverse dai fibroblasti, per cui gli studi classicamente sono effettuati in
fibroblasti primari o secondari, un tipo di cellule stromali derivate da ogni tipo di
tessuto. La replicazione in cellule diverse richiede l’utilizzo di ceppi virali che
mantengano le caratteristiche di isolati clinici. Differenze geniche e nella modalità
di replicazione sono iniziate ad emergere usando diversi tipi di cellule primarie
come cellule vascolari endoteliali, cellule mieloidi (macrofagi e cellule
dendritiche) e cellule epiteliali della retina. Il seguente paragrafo descrive il ciclo
replicativo di HCMV nei fibroblasti.
Rispetto agli α herpesvirus, i β herpesvirus replicano molto più lentamente. Il
HCMV richiede 48-72 ore per completare il ciclo replicativo (Mocarski et al.,
2007). L’infezione inizia con l’interazione di componenti virali con la superficie
cellulare (WuDunn and Spear, 1989); la fusione del pericapside con la membrana
consente l'ingresso del virus nella cellula. I due eventi iniziali, ossia l'attacco alla
superficie cellulare e la fusione pH indipendente del pericapside virale con la
membrana plasmatica, coinvolgono l’envelope virale e le sue glicoproteine
(Isaacson and Compton, 1993). Una volta penetrato nella cellula, il capside,
privato del rivestimento esterno, è trasportato ai nucleopori, dove il DNA è
rilasciato nel nucleo, grazie all’intervento di alcune proteine virali (Batterson et
al., 1983). Probabilmente sono i microtubuli del citoscheletro a mediare il
trasporto dei capsidi fino ai nucleopori (Döhner and Sodeik, 2004). Alcune
proteine del tegumento, inclusa pp65, sono traslocate al nucleo (Kalejta, 2009). Il
DNA si accumula nel nucleo, dove avvengono la trascrizione, la replicazione e
l’assemblaggio di nuovi capsidi. Appena l’acido nucleico vi è penetrato, anche in
assenza di sintesi proteica, la RNA polimerasi II dell’ospite, in associazione con
altre proteine cellulari e con proteine virali, trascrive alcuni geni virali (geni α o
immediate early, IE), producendo una serie di proteine dette precocissime. La
sintesi delle proteine di tutti gli herpesvirus è rigidamente controllata e coordinata,
in modo tale che le proteine abbiano la stessa cinetica e le stesse esigenze di
22
_________________________________________________________________Introduzione
sintesi. I gruppi proteici sono trascritti in modo sequenziale con effetto a cascata.
Come avviene per altri virus a DNA è possibile distinguere tre categorie di geni, a
loro volta divisi in sottoclassi, a cui corrispondono tre tipi diversi di proteine:
1) I geni α o precocissimi (IE), che mappano in diversi siti in UL o US e nelle
regioni IRS oTRS e sono i primi ad essere espressi immediatamente dopo l’entrata
e senza che siano richiesti altri geni. La loro principale funzione è l’attivazione
della trascrizione dei geni precoci, ma alcune proteine precocissime intervengono
anche in alcune fasi finali della replicazione virale. La maggior parte dei geni
precocissimi subisce splicing, mentre i precoci e i tardivi rimangono unspliced.
Sono state mappate nel genoma di HCMV quattro regioni di geni IE: UL36 e
UL37, IE1 e IE2 (UL122 e UL123), TRS1 e IRS1, e US3. Ognuna di queste
codifica diversi trascritti e proteine. IE1 (p72) e IE2 (p86) sono altamente
conservati nei β herpesvirus. Oltre a regolare l’espressione genica, IE1 sopprime il
signaling di STAT (signal transducer and activator of transcription), che attiva
l’interferone (IFN), mentre IE2 induce l’arresto del ciclo cellulare.
2) I geni β o precoci (early, E), che non sono espressi in assenza di proteine α
attive. La loro espressione inizia 6 ore dall’infezione e continua fino a 18-24 ore.
Funzionano principalmente nella replicazione del DNA, nella produzione di
substrati per la sintesi del DNA e nella maturazione del capside (Mocarski et al.,
2007). Gli herpesvirus hanno la peculiarità di possedere una alto numero di geni
in grado di codificare autonomamente enzimi e proteine necessari alla loro
replicazione, come enzimi per il metabolismo degli acidi nucleici (timidilato
sintetasi, dUTPasi, ribonucleotide reduttasi), enzimi per la relicazione (DNA
polimerasi, elicasi, primasi) e protein-chinasi. Complessivamnte almeno 23 geni
β sono essenziali per la replicazione, altri invece non sono indispensabili ma
intervengono nella modulazione delle risposte cellulari e dell’ospite all’infezione.
I geni β sono ulteriormente classificati in β1 e le β2, in base ai tempi di
attivazione e repressione trascizionali. I β1 comprendono il gene UL112-UL113,
che codifica 4 fosfoproteine (pp34, pp42, pp50, pp84) risultato di uno splicing
alternativo e che formano un complesso che contribuisce a iniziare la replicazione
del DNA. Tra i β2 vi è UL54 che codifica per la DNA polimerasi. La DNA
polimerasi UL54 è il target degli attuali farmaci anti-HCMV approvati. Consiste
di 8 domini catalitici (Wong et al., 1988) ed è caratterizzata, grazie al suo dominio
23
_______________________________________________________________________________
esonucleasico e alla funzione di proofreading, da un basso tasso di errore
(2x108/pb) (Dressman et al., 1997).
Altre proteine espresse a partire da geni β comprendono:
la proteina polimerasica accessoria (UL44), la single stranded DNA binding
protein (UL57), le tre subunità del helicase-primase complex (UL70, UL102 e
UL105) (Mercorelli et al., 2008), UL4, che codifica la glicoproteina dell’envelope
gp48 la cui funzione non è nota e molte proteine del tegumento (pp65, pp150,
pp71, pp48). Un importante prodotto di un gene β è UL69, l’omologo di ICP27 di
HSV-1, che, similmente a quest’ultimo, lega il RNA ed è traslocato dal
citoplasma al nucleo, contribuendo alla regolazione del trasporto del RNA.
Il passaggio dalla fase precoce a quella tardiva avviene dalle 24 alle 36 ore
dall’infezione, mentre i massimi livelli di rilascio virale iniziano tra le 72 e le 96
ore.
3) I geni γ o tardivi (late, L), che per la maggior parte codificano componenti
strutturali del virus, come le glicoproteine o le proteine del capside (Mocarski et
al., 2007). Sono divisi in due gruppi: γ1 e γ2. La loro espressione, soprattutto dei
geni γ2, è inibita bloccando la sintesi del DNA.
La regolazione della trascrizione genica degli herpesvirus è un fenomeno molto
complesso, non ancora totalmente compreso e basato su una serie di eventi
rigidamente controllati. Essa si verifica a più livelli:
a) trascrizionale, grazie all’interazione tra sequenze agenti in cis del genoma
virale e fattori trascrizionali sia cellulari che virali che formano il complesso di
inizio trascrizione insieme alla RNA polimerasi II. Nel genoma di HCMV sono
presenti diverse regioni con questa funzione attive a diversi tempi nel corso
dell’infezione. Tra queste le meglio caratterizzate sono:
il major intermediate-early promoter enhancer (MIEP), una larga
porzione genomica di più di 1 Kb che controlla la trascrizione dei geni IE1
e IE2 subito dopo l’entry, ma che potrebbe avere un ruolo anche nella
latenza e nella riattivazione. Infatti potrebbe funzionare da origine di
replicazione nella latenza per mantenere il genoma in cellule progenitrici
ematopoietiche in attiva divisione. Alcune proteine del tegumento
influenzano le prime fasi dell’infezione regolando l’attività di MIEP. Tra
24
_________________________________________________________________Introduzione
queste principalmente pp71, ma anche UL26 o altre vie di trasduzione del
segnale attivate dal virus o da altri fattori (ad esempio fattori di crescita);
il minor enhancer promoter che controlla la trascizione del gene IE US3,
particolarmanete forte in cellule differenziate e represso nelle cellule non
differenziate.
b) post-trascrizionale, mediante il processamento degli mRNA ed il loro trasporto
dal nucleo al citoplasma.
c) traduzionale, per interazione degli mRNA con proteine cellulari e virali.
La replicazione del genoma di HCMV avviene secondo un meccanismo a "cerchio
rotante", con conseguente formazione di concatameri (Sears and Roizman, 1990).
Le origini di replicazione del genoma di HCMV vengono definite come quelle
sequenze necessarie in un frammento di DNA virale affinché esso, una volta
trasfettato in cellule permissive, possa essere amplificato ad opera della DNA
polimerasi virale. Il DNA concatamerico virale neosintetizzato è stabilizzato da
proteine virali e viene scisso in corrispondenza di sequenze di riconoscimento
specifiche; si ottengono così genomi di lunghezza completa ad estremità libere.
Anche il processo di assemblaggio del capside è comune a quello degli altri
herpesvirus ed inizia con la formazione di un procapside grazie a 6 conservate
proteine capsidiche: MCP, TR11, TR12, SCP, PORT e UL80. Una volta che la
sintesi del DNA è completa, i genomi vengono inseriti nei capsidi preformati
(packaging). 10 proteine virali intervengono in questa fase e tra queste UL93,
UL51, UL52 UL77, UL104, ma anche la proteina chinasi VPK (UL97) e alcune
chinasi cellulari. Una volta che il packaging del DNA è completo, i nucleocapsidi
sono traslocati attraverso la membrana nucleare nel citoplasma, dove hanno luogo
le fasi maturative finali.
1.4
Fasi di maturazione e gemmazione del virione di HCMV
Il processo di acquisizione del pericapside ed il meccanismo di gemmazione della
particella virale dalla cellula ospite rimangono le fasi più controverse del ciclo
replicativo degli herpesvirus. Per quanto riguarda la maturazione del virione e
l’uscita dalla cellula ospite sono stati proposti negli anni modelli alternativi, ma
attualmente il modello di envelopment a due tappe risulta quello più largamente
accettato. Questo modello prevede che il virione presente nello spazio
25
_______________________________________________________________________________
periplasmatico e che ha acquisito l’envelope “primario” a livello della membrana
nucleare interna fonda con la membrana nucleare esterna con conseguente perdita
dell’envelope “primario” e rilascio del capside nel citoplasma. Secondo questa
teoria l’assemblaggio delle proteine del tegumento e delle glicoproteine virali
avverrebbe in compartimenti citoplasmatici non esattamente identificati ma
comprendenti probabilmente membrane di diversa origine ed in particolare
compartimenti endosomiali e le vescicole del trans-Golgi network (TGN)
(Stackpole, 1969; Jones and Grose, 1988; Zhu et al., 1995; Skepper et al., 2001;
Mettenleiter, 2002; 2004; 2006). La teoria del two-step envelopment è stata
recentemente supportata sia da studi di microscopia elettronica sia di carattere
biochimico condotti su virioni isolati dallo spazio perinucleare e dal citoplasma.
Tali analisi hanno, infatti, evidenziato diversità in contenuto proteico, morfologia
e composizione lipidica del pericapside fra le particelle virali presenti nei due
compartimenti cellulari durante l’infezione e che componenti delle particelle con
envelope primario sono assenti nei virioni maturi (Van Genderen et al., 1994;
Granzow et al., 2001).
Figura 1.4.1 Ciclo replicativo di HCMV. Sono schematizzate le fasi di ingresso, replicazione e
trascrizione del genoma virale, maturazione ed uscita del virus dalla cellula ospite con il modello
attualmente più accreditato del “envelopment a due tappe” (Mocarski et al., 2001).
26
_________________________________________________________________Introduzione
Per HCMV acquisizione del tegumento ed envelopment secondario avvengono in
un caratteristico compartimento che si forma durante l’infezione, localizzato a
ridosso del nucleo e noto come assembly complex o assembly compartment (AC)
(Figura 1.4.2). L’AC è una larga struttura circolare generalmente presente una per
ogni cellula infettata anche in sincizi contenenti più di 10 nuclei, strettamente
associata al nucleo e al microtubule organizing center (MTOC). Questo
compartimento è stato osservato in fibroblasti primari, cellule endoteliali e cellule
muscolari liscie. Il nucleo in parte va ad avvolgere l’AC e assume pertanto una
forma simile a quella di un rene. Nell’AC i nucleocapsidi provvisti di tegumento
gemmano all’interno di vescicole di origine cellulare contenenti le glicoproteine
virali. Le vescicole contenenti i virioni sono poi trasportate alla membrana
plasmatica e rilasciate dalla cellula in seguito alla fusione della membrana delle
vescicole con la membrana plasmatica (esocitosi) (Mocarski et al., 2007).
Evidenze di microscopia elettronica indicano che l’AC è formato da anelli
concentrici di vescicole originate da differenti compartimenti appartenenti al
pathway biosintetico-secretorio, come l’apparato del Golgi, TGN e gli EE
(endosomi precoci) (Das et al., 2007). La formazione dell’AC è dipendente
dall’espressione di una o più proteine virali tardive. In questo compartimento sono
reclutate molte proteine del tegumento (pp28, pp150), proteine dell’envelope
(gM/gN, gB), ma anche proteine non strutturali e proteine cellulari: golgina-97,
EEA-1 (early endosomal antigen-1), mannosidasi-II, GM130, p230, Bip/Grp78
(glucose regulated protein 78). La sua formazione, pertanto, è un processo
dinamico e determina un progressivo rimodellamento e una profonda
riorganizzazione del citoplasma delle cellule infettate. Gaspar e Shenk hanno
evidenziato che la proteina Chk2 (checkpoint kinase 2) che controlla il ciclo
cellulare e normalmente espressa nel nucleo, rilocalizza a livello dell’AC durante
l’infezione (Gaspar and Shenk, 2006). Il modello di Pellet riguardo la
composizione e la struttura dell’AC prevede che le vescicole degli EE siano
trasportate nel centro dell’AC, positivo per marker degli EE come EEA-1, e che
intorno a questa area centrale si disponga un anello intermedio contenente le
membrane del TGN, circondato a sua volta da componenti dell’apparato del
Golgi. Componenti del reticolo endoplasmatico (RE) rimangono, invece, al di
fuori dell’AC (Das et al., 2007, Figura 1.4.2).
27
_______________________________________________________________________________
Figura 1.4.2 Struttura dell’assembly complex di HCMV secondo il modello di Pellet (Das et
al., 2007).
1.5
Il tegumento
Il tegumento o matrice è definito come la regione localizzata tra il capside e il
pericapside e comprende un elevato numero di proteine virali, proteine cellulari e
anche molecole di RNA virali e cellulari. Delle 71 proteine virali inglobate nei
virioni infettivi più di metà sono proteine del tegumento. Alcune proteine del
tegumento sono uniche per i β herpesvirus, altre sono omologhe a proteine degli
α herpesvirus. La sua acquisizione è un processo molto complesso che richiede il
reclutamento e l’interazione tra molte proteine virali, similmente a quanto
descritto per HSV-1 (Mettenleiter, 2004). Inoltre, studi recenti hanno sottolineato
come questa componente strutturale, per lungo tempo considerata una struttura
amorfa, sia, invece, fondamentale per l’integrità della particella virale, in quanto
risultato di una complessa rete di interazioni proteina-proteina (Mettenleiter,
2002). Il tegumento presenta, infatti, una complessa e strutturata organizzazione e
può essere suddiviso in due strati: lo strato più interno (inner tegument) e quello
più esterno (outer tegument). Le proteine dello strato più interno interagiscono
fortemente con le proteine del capside, mentre quelle dello strato esterno giocano
28
_________________________________________________________________Introduzione
un importante ruolo per le loro interazioni con le porzioni citoplasmtiche delle
glicoproteine
del
pericapside.
Queste
interazioni
sono
importanti
per
l’acquisizione dell’envelope finale e assicurano l’integità della particella virale.
Negli ultimi anni, però, sono emerse molteplici altre funzioni delle proteine del
tegumento: regolazione dell’espressione genica, evasione del sistema immunitario
(Scalzo et al., 2007), rilascio del DNA virale nel nucleo (Bechtel and Shenk
2002), inizio e regolazione del ciclo replicativo virale (Bresnahan and Shenk
2000), Hurley, 2008), morfogenesi e arresto del ciclo cellulare. La maggior parte
delle proteine del tegumento sono fosforilate e altamente immunogeniche. La loro
fosforilazione potrebbe facilitare la loro associazione stabile e l’incorporazione
nel virione.
In base alla loro principale funzione possiamo classificare le proteine del
tegumento come segue (Kalejta, 2008):
o
Entrata: UL48 e UL47
o
Espressione genica: pp71, ppUL35, ppUL69
o
Evasione della risposta immune: pp65, pIRS1/pTRS1
o
Assemblaggio e uscita: ppUL97, pp150, pp28
o Entrata
La large tegument protein (LTP, UL48), poli-proteina dello strato interno del
tegumento, è il prodotto genico di maggiori dimensioni codificato dal genoma di
HCMV (253 kDa) e per questo è anche chiamata high molecular weight protein. È
ampiamente conservata nella famiglia Herpesviridae (Chee et al., 1990), ma
rispetto ai dati riportati in letteratura sul suo omologo in HSV-1 UL36 la precisa
funzione di UL48 rimane controversa. Sembra essenziale per la replicazione virale
(Shenk et al., 2003). Interagisce con MCP, UL47 e UL69 (Shenk and Bechtel,
2002) e con la proteina del RE p180 (Ogawa-Goto, 2002). Come per UL36, anche
il processamento proteolitico dell’estremità N-terminale di UL48 produce un
enzima ad attività deubiquitinasica (DUB domain) (Wang et al., 2006). Possibili
ruoli di questo dominio potrebbero essere deubiquitinare le proteine virali per
prevenirne la degradazione nel proteosoma e favorire l’assemblaggio dei virioni, o
promuovere l’interazione della particella virale con le proteine coinvolte nel
pathway di secrezione dei multivesicular body (MVB) (Kattenhorn et al., 2005;
Schlieker et al., 2005; Kalejta, 2008).
29
_______________________________________________________________________________
La LTP binding protein (LTPbp, UL47), che interagisce con MCP, UL69 e UL48.
Aumenta traduzione e stabilità di UL48 e la sua delezione comporta accumulo
intracitoplasmatico di nucleocapsidi, perdita di infettività e della capacità di
diffusione cellula-cellula e difetti di crescita virale. Potrebbe avere un ruolo simile
a quello dell’omologo negli α herpesvirus UL37 nella scapsidazione, nel trasporto
intracellulare durante la morfogenesi, nell’assemblaggio del tegumento e
nell’envelopment secondario.
o Espressione genica
pp71 (UL82), fosfoproteina di 71 KDa con funzione di transattivatore virale,
stimolando l’enhancer MIEP, in maniera più efficiente se in complesso con la
proteina del tegumento UL35. È, pertanto, usata anche in vitro per incrementare
l’efficienza di trasfezione del DNA virale. La sua delezione comporta severi
difetti della crescita virale. Tra i meccanismi con cui attiva l’espressione genica vi
è il suo legame nel nucleo con la proteina Daxx, che, reclutata a livello dei
promotori da vari fattori di trascrizione, funziona da repressore trascrizionale.
Inoltre, pp71 promuove anche, attraverso la degradazione dei soppressori tumorali
della famiglia Rb (retinoblastoma), la progressione dalla fase Go alla S.
ppUL35, trascritta nelle due forme UL35 e UL35a. La prima rappresenta la forma
incorporata nel tegumento di virioni e DB, mentre la seconda rappresenta gli
ultimi 193 aminoacidi dell’estremità C-terminale del trascritto completo.
Entrambe le forme interagiscono con pp71, accelerando l’inizio della trascrizione
dei geni IE. Nell’assemblaggio promuove l’uscita dal nucleo insieme ai capsidi di
pp71 e pp65 e la loro incorporazione nel tegumento.
ppUL69, fosfoproteina nucleare precoce (Bresnahan and Shenk, 2000) coinvolta
nell'induzione dell’arresto del ciclo cellulare nella fase G1 (Lu and Shenk 1999),
nella transattivazione dell’espressione dei geni IE (Winkler et al., 1994) e
nell’esporto di RNA nucleari unspliced verso il citoplasma. La sua delezione
causa un ritardo della crescita virale nei fibroblasti. Forma un complesso con le
proteine del tegumento UL47, UL48, MCP (Bechtel and Shenk, 2002) e pp65
(Chevillotte et al., 2009).
30
_________________________________________________________________Introduzione
o Evasione della risposta immune
pp65 (UL83), la più abbondante (15% in abbondanza) proteina del tegumento,
(Irmiere and Gibson, 1983) e l’antigene rilevato nei saggi di antigenemia. A valle
della fusione è trasportata nel nucleo. È coinvolta nell’evasione della risposta
immunitaria adattativa ed innata (Arnon et al., 2005; Gilbert et al., 1996) grazie
alla sua attività chinasica, che previene la presentazione al MHC-I di varie
proteine IE. Attenua anche la risposta all’IFN. La sua capacità di fosforilare le
proteine è determinata da un’attività endogena (Yao et al., 2001; Kalejta, 2009)
e/o dalla sua interazione con chinasi cellulari o con la chinasi virale ppUL97
(Gallina et al., 1999; Kamil and Coen, 2007). Non è essenziale per la replicazione
nei fibroblasti, ma lo è per la formazione dei DB. La sua delezione compromette
l’incorporazione di ppUL69 e ppUL97 e parzialmente di UL25 (Chevillotte et al.,
2009).
pIRS1 e pTRS1, proteine precoci espresse all’interno della famiglia genica US22,
che comprende in tutto 12 prodotti genici, 9 dei quali codificano proteine del
tegumento (UL23, UL24, UL36, UL43, US22, US23, US24, IRS1 e TRS1). Non è
noto se i restanti 3 componenti della famiglia (UL28, UL29, e US26) siano
proteine strutturali, ma sono coinvolte nella replicazione del DNA virale. pIRS1 e
pTRS1 bloccano la sintesi proteica virale, prevenendo la fosforilazione di fattori
cellulari coinvolti nella sintesi proteica e della RNAsi L, che sono attivati come
risposta antivirale dell’immunità innata. La delezione di TRS1 determina
l’alterazione dell’accumulo del DNA virale nel nucleo e del packaging.
o Assemblaggio e uscita
La protein chinasi VPK o pp97 (UL97), proteina precoce localizzata nel nucleo
(van Zeijl et al., 1997) con capacità di autofosforilarsi e di fosforilare altre
proteine virali e cellulari (Kawaguchi and Kato, 2003; Michel at al, 1998; Krosky
et al., 2003; Marschall et al., 2005; Hume et al., 2008). Fosforila, e quindi attiva,
anche il farmaco antivirale Ganciclovir (GCV) (Sullivan et al., 1992). Interagisce
con pp65 (Kamil and Coen 2007), che è necessaria per la sua incorporazione nelle
particelle virali (Chevillotte et al., 2009). Mutazioni a suo carico, come e anzi più
frequentamente che per la polimerasi pp54, sono associati alla farmaco-resistenza.
Circa il 90% dei casi di resistenza al GCV sono attribuiti ad alterazione di pp97
(Chou, 2001). Possiede una’attività chinasica ciclina dipendente che stimola la
31
_______________________________________________________________________________
progressione del ciclo cellulare, legando e fosforilando la proteina Rb. La sua
inattivazione porta alla formazione di inclusioni nucleari che consistono
principalmente di pp65 e pUL25 e a difetti di assemblaggio e uscita.
pp150 (UL32), grossa fosfoproteina altamente immunogenica. È la seconda
proteina del tegumento per abbondanza e lega la superficie del capside assemblato
ed in particolare la MCP, contribuendo all’esatta localizzazione e alla stabilità dei
nucleocapsidi. Questa associazione inizia nel nucleo e prosegue nel sito di
assemblaggio del virione a livello delle inclusioni citoplasmatiche dove pp150
accumula e dove svolge una funzione chiave nelle fasi finale della maturazione
virale. Recentemente è stato dimostrato che pp150 interagisce con le proteine del
capside UL46, UL85 e UL80.5 e quelle del tegumento UL48, TRS1, UL69,
UL97, UL25 e US22 (Moorman et al., 2009).
pp28 (UL99), fosfoproteina altamente immunogenica, che prende contatto con
l’envelope virale e con le membrane cellulari attraverso la miristilazione della
Gly2 e viene esposta al lato citosolico della membrana in seguito a fusione
dell'evelope virale. Sia il residuo miristilato sia un cluster acido (AA 44-59) sono
richiesti per la sua corretta localizzazione e incorporazione nei virioni. La sua
delezione causa un completo blocco della maturazione virale con l’accumulo nel
citoplasma di capsidi rivestiti dal tegumento e di altre di proteine del tegumento e
glicoproteine nell’AC.
Altre proteine del tegumento comprendono:
UL71, proteina strutturale precoce (Varnum et al., 2004) di circa 48 kDa, omologa
alla proteina UL51 degli α herpesvirus (Bankier et al., 1991; Baumeister et al.,
1995; Lenk et al., 1997) e a BSRF1 del EBV (Johannsen et al., 2004). Non è
essenziale per la replicazione virale (Dunn et al., 2003), sebbene l’introduzione di
un codone di stop al N-terminale determini l’accumulo di nucleocapsidi privi di
envelope nel citoplasma delle cellule infettate, una diminuzione del titolo virale
rilasciato a livello extracellulare e difetti nella diffusione cellula-cellula. I primi
34 aminoacidi all’astremità N-terminale comprendenti due siti di palmitoilazione
costituiscono il segnale di co-localizzazione con le membrane del TGN. Viene
reclutata all’AC a precoci e tardivi stadi di infezione ma distribuisce in tutto l’AC,
diversamente da altre proteine virali (pp28, pp150, gB) che accumulano
32
_________________________________________________________________Introduzione
nell’anello dell’AC positivo per le particelle virali infettive (comunicazione orale
Daniela Fischer e Jens von Einem).
ppUL25, proteina di 85 kDa non essenziale e altamente immunogenica, la cui
funzione nella morfogenesi virale rimane ancora da chiarire. È reclutata all’AC
dove colocalizza con pp28 (Battista et al., 1999) ed è incorporata nel virione in
forma fosforilata (Battista et al., 1999). La sua fosforilazione potrebbe dipendere
da pp65, direttamente o dalle chinasi associate a pp65 pUL97 e Plk1.
UL26, componente minore del tegumento, membro della famiglia US22, richiesta
per la replicazione virale. Virus mutati in questa proteina precoce presentano una
minore sintesi dei geni IE e decrementata stabilità di pp28, dovuta all’alterazione
dello stato di fosforilazione di questa proteina e forse di altre proteine del
tegumento.
UL45, proteina precoce che accumula solo dopo la replicazione del DNA virale e
presenta una significativa omologia con la subunità maggiore della ribonucleotide
reduttasi, sebbene manchi di residui con attività catalitica. La sua funzione non è
ancora stata elucidata, ma mutanti virali in questa proteina hanno difetti di crescita
soprattutto ad alte m.o.i..
UL76, proteina tardiva strutturale non essenziale che nel nucleo regola
l’espressione genica virale.
UL94, componente essenziale del virione, espressa nel nucleo a tardi tempi di
infezione come dimero associato da ponti di solfuro. La sua funzione non è chiara
ma contiene un dominio di legame al DNA.
US24, proteina precoce non essenziale la cui delezione causa difetti della crescita
virale con la riduzione dell’espressione di pp28 e in misura minore di UL44.
UL36 e UL38, coinvolte nell’inibizione dell’apoptosi.
Componenti minori del tegumento comprendono:
UL44 (fattore di processività della DNA polimerasi), UL51 e UL89 (componenti
della terminasi), UL54 (DNA polimerasi), UL57 (single-stranded DNA binding
protein), UL72 (omologo della dUTPasi), UL79, UL84 (coinvolta nella
replicazione del DNA), UL88, UL96, UL103, UL104 (PORT) e UL112.
33
_______________________________________________________________________________
1.6
Ruolo delle glicoproteine nel ciclo di replicazione
L’ingresso del virione nella cellula bersaglio richiede l’interazione tra varie
glicoproteine virali ed i recettori cellulari presenti sulla membrana citoplasmatica.
Sia l'attacco di HCMV alla superficie cellulare sia la successiva fusione
dell’envelope con la membrana citoplasmatica sono eventi mediati dalle
glicoproteine virali. L'envelope degli herpesvirus ha una composizione proteica
complessa che ha reso difficile lo studio di questi meccanismi. HCMV codifica
più
di
50
proteine
potenzialmente
glicosilate
o
contenenti
domini
transmembranari (TM). Le glicoproteine di HCMV assemblano in tre complessi,
tutti fondamentali per l'ingresso del virus nelle cellule bersaglio d'infezione:
gcI (glycoprotein complex I), che contiene omodimeri di gB
(UL55);
gcII che contiene gM/gN (UL100/UL73), complesso necessario nella
fase di entrata, diversamente da quello che accade per altri herpesvirus;
gcIII che contiene gH/gL (UL75/UL115) (in alcuni complessi con
gO (UL74) e con UL128, UL130 e UL131, ma che sembrano necessarie
per la fusione solo in particolari ospiti cellulari).
L’ingresso prevede vari eventi sequenziali:
attacco mediato dal legame con specifici recettori cellulari
fusione dell’envelope con la membrana cellulare
penetrazione e rilascio dei nucleocapsidi nel citoplasma
associazione del nucleocapside coi pori nucleari
rilascio del genoma virale nel nucleo
Attacco
L’attacco della particella virale alla superficie cellulare è mediato dal legame di
gB e del complesso gM/gN ai proteoglicani di eparansolfato. L’eparansolfato è un
glicosaminoglicano ampiamente diffuso, relativamente conservato nel pathway di
entrata di molti herpesvirus e che permette al virus di legare molti tipi cellulari,
anche quelli dove il virus non replica attivamente. Altre molecole riconosciute
sono il dermatansolfato e il condroitinsolfato, che vengono legate da alcuni
domini di gB (Herold et al., 1991; 1994).
gM (UL100, 42 KDa) è la proteina più abbondante dell’envelope virale (5 volte
più abbondante di gB) e costituisce il 10% dell’intera massa virale. E’ una
34
_________________________________________________________________Introduzione
glicoproteina N-glicosilata di tipo III con 7 domini TM, non conservata rispetto
agli altri herpesvirus. gM richiede gN (UL73) per essere reclutata nel RE dove le
due proteine interagiscono. Il complesso è necessario per la corretta formazione
del virus maturo. Poiché il livello di gN è solo l’1% rispetto a quello di gM,
questo implica che quest’ultima sia presente in larga maggioranza in forma libera,
non legata nel complesso gM/gN. gM contiene nella coda il motivo ricco di
tirosine YQAL e un cluster particolarmente acido (12 residui acidi). In trasfezione
ed infezione gM/gN colocalizza con AP-1 (adaptor protein-1), Rab7 e CD63
(marker dei MVB/late endosomes, LE) e gB, che a sua volta colocalizza con gli
stessi marker di TGN e MVB/LE, favorendo l’ipotesi di un trafficking comune
delle due glicoproteine. La delezione dell’intera coda terminale di gM determina
l’assemblaggio di virioni non infettivi per difetti di localizzazione del complesso
gM/gN all’AC. Le delezioni, invece, del motivo YQAL e del cluster acido,
singolarmente e accoppiate, determinano una velocità di trasporto all’AC di
gM/gN più bassa. I virioni sono vitali ma con difetti in replicazione. I motivi,
quindi, sono coinvolti nel trafficking all’AC (Krzyzaniak et al., 2007). Negli
α herpesvirus, invece, la gM non interviene nell’entry, ma risulta fondamentale
nel passaggio del virus fra cellule adiacenti (cell-to-cell spread) (Krzyzaniak et
al., 2007), grazie all’interazione con i recettori a livello delle giunzioni cellulari.
Questo sistema di diffusione virale che avviene in vivo nei tessuti epiteliali e
neuronali è tipico degli herpesvirus. Le particelle virali neo-sintetizzate sono
veicolate in specifici domini della superficie laterale, quali le giunzioni e le
sinapsi, ed entrano in questo modo rapidamente in contatto con le cellule
adiacenti, propagando l’infezione ed eludendo il sistema immunitario (Jonhson et
al., 2001; Jonhson and Huber, 2002). Anche in HCMV le glicoproteine che
mediano l’ingresso del virus nella cellula bersaglio dell’infezione ed in particolare
gB e gM/gN sono richieste in questo processo e mutanti virali privi di queste
glicoproteine presentano una ridotta capacità di diffusione tra cellule adiacenti
(Krzyzaniak et al., 2007; Isaacson and Compton, 2009).
Fusione
L’associazione di gB e di gM/gN ai recettori cellulari innesca una cascata di
eventi che coinvolgono altri recettori e mediatori dell’entry, che portano alla
fusione fra l’envelope e la membrana cellulare. Le glicoproteine coinvolte nella
35
_______________________________________________________________________________
fusione tra l’envelope e la membrana citoplasmatica sono gH/gL e gB. gH/gL è un
eterodimero conservato in tutti gli herpesvirus. La gH di HSV-1 sembra utilizzare
un segmento fusogeno interno ed un tratto coiled-coil (CC) per svolgere un'azione
diretta nella fusione. In HCMV gH ha la stessa funzione ma il ruolo del tratto
fusogeno conservato non è stato analizzato. gH richiede gL come chaperone per
acquistare la conformazione strutturale corretta ed essere trasportata alla
superficie cellulare (Hutchinson et al., 1992). L’espressione del complesso gH/gL
in assenza di infezione induce la formazione di sincizi. Oltre che nella
penetrazione, gH, in HCMV così come in altri herpesvirus, ha un ruolo anche
nella diffusione cellula-cellula. Recentemente è stato dimostrato che gH lega
l’integrina αvβ3, che potrebbe essere un corecettore nell’entry di HCMV. In β e
γ herpesvirus il complesso gH/gL può essere modificato dal legame di altre
glicoproteine. Nei γ herpesvirus il complesso gH/gL lega la glicoproteina gp42
formando il trimero gH/gL/gp42, che determina l’attacco, la fusione e il tropismo
per i linfociti B e le cellule epiteliali. In HCMV oltre all’eterodimero gH/gL sono
stati identificati altri complessi: un eterotrimero contenente anche gO (UL74), che
aumenta l’efficienza di fusione di gH/gL, ma sembra solo modestamente nei
fibroblasti; un eterotetramero comprendente anche le proteine codificate da
UL128 e UL130 e un eteropentamero che incorpora insieme a gH/gL i prodotti
genici di UL128, UL130 e UL131. Questi complessi aumentano il tropismo di
ceppi clinici di CMV verso cellule epiteliali, endoteliali e dendritiche. In queste
cellule
l’assenza
o
mutazioni
a
carico
di
questi
geni
permettono
l’internalizzazione del virus ma i geni IE non sono codificati e, pertanto, è
possibile la propagazione selettiva del virus solo nei fibroblasti.
HCMV codifica altre famiglie di glicoproteine minori non necessarie per la
replicazione nei fibroblasti e tra queste gli omologhi virali dei recettori accoppiati
a proteina G (GPCR) UL33, UL78, US27 e US28. Una particolare attenzione è
stata posta sul recettore per le chemochine CC/CX3C US28. Si tratta di un
recettore costitutivo molto forte. La sua attivazione indotta dal ligando attiva la
via di signaling mediata dalle protein chinasi, la β arrestina, Gα12 e RhoA,
inducendo l’apoptosi e la migrazione cellulare. Il suo ruolo a livello virale non è
completamente chiaro.
36
_________________________________________________________________Introduzione
Figura 1.6.1 Modello dell’entrata del HCMV nelle cellule bersaglio. (1) attacco (tethering),
mediato dal legame con i proteoglicani di eparansolfato (HSPG) attraverso le glicoproteine gM/gN
e/o gB. (2) fusione (docking), mediata dal complesso gH/gL e dal legame di gB con il recettore per
l’epidermal growth factor (EGFR) espresso sulla superficie di cellule permissive per HCMV o con
altri recettori nelle cellule ematopoietiche. Queste interazioni e anche il legame tra le glicoproteine
dell’envelope e le integrine promuovono la concentrazione dei recettori in microdomini
specializzati (receptor clustering), che facilita il signaling. Queste interazioni guidano alla fusione,
che determina l’internalizzazione dei componenti virali. (3) penetrazione ed eventi di trasduzione
del segnale (postattachemnt events), che sono attivati da EGFR e/o integrine e che innescano gli
eventi a valle (traslocazione del capside nel nucleo ed espressione del genoma virale). I toll-like
receptor (TLR) iniziano uno specifico pattern di eventi durante l’entrata del virus nella cellula, che
attiva le cascate di signaling e la risposta immunitaria innata (Compton et al., 2004).
Il processo di fusione richiede anche l'interazione di gB con recettori presenti sulla
membrana cellulare. Sono state identificate tre diverse tipologie di molecole che
possono legare gB (Spear et al., 2000): gli eterodimeri di integrina, i recettori per
l’EGF (EGFR, epidermal growth factor receptor) e il toll-like receptor 2 (TLR-2).
Le integrine di superficie sono recettori ubiquitari che una volta attivati portano
alla riorganizzazione del citoscheletro. È stato ipotizzato che sia l’interazione con
le integrine β2 a mediare l’attività fusogena di gB. L'interazione con le integrine
β1 è mediata dal suo disintegin-like domain (DLD) (Feire et al., 2004). Il legame
di gB al EGFR determina la fosforilazione del recettore e porta all’attivazione
della fosfatidilinositolo 3 chinasi (PI-3 kinase) e di Akt con il rilascio di calcio dai
depositi intracellulari. Tale interazione non è, però, stata confermata e recenti
pubblicazioni mostrano che HCMV inibisce la fosforilazione e il signaling del
EGFR. I mutanti in gB, gM/gN o gH/gL non sono in grado di infettare le cellule a
37
_______________________________________________________________________________
meno che non si fornisca un fattore “fusogeno” sostitutivo come il
polietilenglicole o la glicoproteina del virus della stomatite vescicolare (VSV-G)
(Anderson et al., 2000).
1.7
Il trafficking delle glicoproteine lungo il pathway endocitico e le
molecole trasportatrici
Un efficiente envelopment richiede che tutti i componenti necessari a costituire
particelle infettive, nucleocapside, proteine del tegumento e glicoproteine, si
localizzino correttamente nel sito di budding. La biosintesi ed il trafficking delle
glicoproteine erpetiche avvengono secondo la modalità delle proteine glicosilate
nelle cellule eucariotiche, seguendo la via di trasporto vescicolare della cellula (il
pathway biosintetico-secretorio o endocitoco). Questo pathway, che non sembra
necessitare di particolari segnali di attivazione, è formato da vari compartimenti in
costante comunicazione attraverso vescicole di trasporto che continuamente
gemmano da una membrana e fondono in un’altra in un traffico altamente
organizzato. Le glicoproteine sintetizzate a livello del RE sono trasportate
nell’apparato del Golgi, dove acquisiscono il loro corretto folding e subiscono le
modifiche post-traduzionali. L’apparato del Golgi è localizzato nella cellula in
posizione paranucleare ed è formato da dittiosomi, strutture costituite a loro volta
da gruppi di sacche membranose appiattite a forma di dischi impilate le une sulle
altre, che prendono il nome di cisternae e usualmente presenti in numero tra 5 e 8.
Il numero e la forma dei sacculi dipende dal tipo di cellula. I sacculi presenti in
prossimità del nucleo sono detti inferiori o prossimali e costituiscono la regione
cis del dittiosoma. I sacculi che invece sono presenti in prossimità della superficie
cellulare sono detti superiori o distali e costituiscono la regione trans dello stesso
dittiosoma. Entrambe queste parti sono connesse a diversi compartimenti cellulari,
formando in questo modo una rete di tubuli e cisternae interconnessi. Le vescicole
entrano dal RE nel cis-Golgi e raggiungono poi il TGN, dove è completata la
glicosilazione proteica. Non è ancora chiaro se la glicosilazione delle proteine
virali richieda l’intervento di enzimi virus-specifici e non è esclusa la possibilità
che il genoma virale codifichi enzimi con funzione simile a quella degli enzimi
della cellula ospite. Le glicoproteine virali presentano sia le N- sia le Oglicosilazioni, anche se quest’ultime sono meno frequenti. Le N-glicosilazioni
hanno un ruolo attivo nell’infettività virale; infatti, in seguito a trattamento con
38
_________________________________________________________________Introduzione
tunicamicina, in grado di legare e quindi bloccare i siti N-glicosilati, si osserva
l’accumulo di proteine virali glicosilate e di virus rivestiti dall’envelope nel
citoplasma cellulare (Ghosh-Choudhury et al., 1994). Il ruolo delle Oglicosilazioni non è ancora noto.
Dal TGN le vescicole contenenti le glicoproteine mature sono trasportate alla
membrana plasmatica, dove le glicoproteine stimolano la risposta anticorpale da
parte del sistema immunitario, o ad altri organuli. Esiste anche una via retrograda,
particolarmente importante per il reciclo di specifiche proteine da alcuni organelli
e che prevede che esse siano trasportate dal trans-Golgi al cis-Golgi e da qui al
RE (Alberts et al., 2002).
Molte glicoproteine virali così come le proteine cellulari contengono dei motivi
caratteristici, che controllano l’endocitosi dalla membrana plasmatica ed il
trafficking lungo il pathway di secrezione, mediando l’interazione delle proteine
target con i complessi cellulari che regolano il trasporto delle proteine tra i vari
compartimenti cellulari. Tali motivi sono:
i motivi ricchi di tirosine YXXΦ (dove Φ rappresenta un qualsiasi aminoacido
idrofobico);
i motivi di dileucina (LL o LI);
il cluster acido, contenente numerosi residui di acido aspartico o glutammico.
Molti lavori riguardanti il ruolo di questi motivi nella coda citoplasmatica di
alcune glicoproteine come le gB di HCMV e del virus della pseudorabbia (PRV)
evidenziano che i motivi ricchi di tirosine e i motivi LL sono coinvolti
nell’internalizzazione dalla membrana plasmatica grazie all’interazione con la
proteina adattatrice clathrin-associated AP-2. Delezioni o mutazioni a livello di
questi motivi, quindi, secondo questi lavori, determinano l’accumulo di queste
proteine in membrana (Radsak et al., 1996; Tugizov et al., 1999; Nixdorf et al.,
2001). Lavori più recenti, però, hanno evidenziato un coinvolgimento molto più
complesso degli adattatori non solo nell’endocitosi dalla membrana plasmatica ma
in tutto il trafficking endosomiale lungo il pathway di secrezione (Figura 1.7.1).
Ad esempio esperimenti di biotinilazione della gB di HCMV hanno dimostrato
che parte, ma non tutta, la glicoproteina incorporata nei virioni è recuperata dalla
membrana plasmatica e che il blocco dell’endocitosi mediante il dominante
39
_______________________________________________________________________________
negativo K44A della dinamina 1 non ha effetti sulla produzione di progenie virale
sia extracellulare sia cellulo-associata (Jarvis et al., 2002).
I motivi ricchi di tirosine YXXΦ sono coinvolti in:
1. endocitosi dalla membrana (di solito XX sono aminoacidi idrofilici e il
motivo localizza 10-40 residui dal dominio TM).
2. sorting ai lisosomi (in questo caso la Y è spesso preceduta da G senza
specificità per alcun AP e il motivo localizza 6-9 aminoacidi dal dominio
TM o al C-terminale).
3. sorting verso la membrana basolaterale in cellule polarizzate.
I motivi di dileucina LL o LI sono coinvolti in:
1. endocitosi (il motivo di solito localizza 6-7 residui dal dominio TM).
2. sorting dal ERC (endocytic recycling compartment) al TGN
3. sorting dal TGN agli endosomi
4. targeting endo-lisosomiale (la presenza di un residuo acido in posizione –4
(la prima L è +1) e un residuo acido in posizione –5 o una serina
de/fosforilabile (PP2A/CKII) modulano la forza del segnale e il legame a
AP-1 e AP-2. Di solito localizza molto vicino al dominio TM o al Cterminale).
Globalmente quindi i ruoli di LL sembrano sovrapposti a quelli di YXXΦ.
Esistono due tipi di motivi LL:
[DE] XXXL [LI]: modulabile quando preceduto da serine, che se fosforilate
ne diminuiscono l’attività. Costitutivamente attivo in proteine dei LE e dei
lisosomi. Lega le AP.
DXXLL: lega proteine che inserite in CVV (clathrin coated vesicles)
gemmano e ciclano tra TGN ed endosomi. Mutazioni di D e LL aumentano
l’espressione di tali proteine in membrana. Spesso la D si trova in un
contesto di un cluster acido per cui i motivi sono detti acidic clusterdileucine signals (AC-LL), localizzati 1 o 2 residui dal C-termine e che non
legano AP ma le GGA (ADP-rybosilation factor (ARF)-dependent clathrin
adaptors) tramite il dominio VHS (Vps27, Hrs e STAM) di queste ultime.
Il cluster acido rappresenta il motivo caratteristico di localizzazione al TGN. In
alcune proteine, come la gB di HCMV e la furina, il cluster acido viene fosforilato
dalla CKII. Questa modificazione covalente ne permette l’interazione con
40
_________________________________________________________________Introduzione
l’enzima PACS-1 (phosphofurin acid cluster sorting protein-1), responsabile del
trasporto delle proteine target dagli endosomi al TGN per mezzo di CCV
contenenti AP-1 e AP-3. (Bonifacino et al., 2003). Secondo Crump e colleghi
utilizzando un dominante negativo o mediante siRNA di PACS-1 proteine con il
cluster acido rilocalizzano dal TGN agli EE, ma non ai LE e ai lisosomi (Crump
et al., 2003). Oltre alla funzione più nota di sorting verso il TGN sono stati messi
in luce ruoli addizionali di PACS-1 nel late secretory trafficking e nel recycling
da EE alla membrana plasmatica, attraverso interazioni oltre che con AP-1 e AP-3
anche con GGA3 (Atkins et al., 2008). Oltre alla gB di HCMV altre proteine che
localizzano nel TGN che contengono un cluster acido fosforilabile sono: la furina,
gE di VZV, gE di HSV, US9 di PRV, il MPR (mannose 6-phosphate receptor),
Nef, la carbossipeptidasi D (CPD), Env del retrovirus felino RD114. In base alle
proprietà di PACS-1 non è chiaro se le proteine siano veicolate ai MVB/LE senza
passare per il TGN e, quindi, direttamente da ERC-EE o attraverso un
obbligatorio passaggio per il TGN, modello visto per la gM di HCMV secondo
Krzyzaniak et al., 2007.
Esistono 4 classi di proteine adattatrici AP, che differiscono in base al tipo di
subunità µ e sono:
AP-1: media attraverso PACS-1 il sorting verso il TGN ma anche quello contrario
in uscita dal TGN verso endosomi e lisosomi. Si pensa pertanto che la differenza
dipenda dalle proteine accessorie che lega (Lubben et al., 2008). Agisce in modo
clatrina dipendente o indipendente.
AP-2: legando YXXΦ media l’endocitosi clatrina dipendente dalla membrana.
L’affinità per AP-2 diminuisce se la tirosina o residui circostanti al motivo sono
fosforilati, mentre l’endocitosi aumenta per aumentata affinità con YXXΦ se AP2 stesso è fosforilato (Bonifacino et al., 2003). La deplezione di AP-2 porta
all’accumulo in membrana di varie proteine che allo steady state localizzano in
endosomi e/o lisosomi (come le proteine LAMP-1 (lysosome associated
membrane protein-1) e CD63) e aumenta la velocità di maturazione degli EE
verso MVB/LE e la velocità di trasporto delle proteine (ad esempio il MHC-I
tramite Nef) da EE verso la membrana o verso i MVB/LE, accelerando la loro
degradazione lisosomiale. È stato ipotizzato che questi effetti della deplezione di
41
_______________________________________________________________________________
AP-2 siano dipendenti dall’ubiquitinazione e dal coinvolgimento di ubiquitino
ligasi E3.
AP-3: agisce sia in modo clatrina dipendente sia indipendente e legando YXXΦ
partecipa al trafficking verso lisosomi o organelli lisosoma-associati. Localizza al
TGN e agli endosomi. Lega anche PACS-1 ma è coinvolta nel sorting anche di
proteine lisosomiali prive di cluster acido (LAMP-1, LIMP-2 e tirosinasi).
AP-4: lega il motivo FI (ad esempio nella furina) promovendo il sorting verso la
membrana basolaterale. È stato ritrovato in vescicole che gemmano dal TGN
clatrina indipendenti.
Figura 1.7.1 Pathway endocitico e adattatori coinvolti nel trasporto delle proteine cargo.
1.8
La glicoproteina B (UL55)
La gB del HCMV (UL55) è una tra le più conservate proteine nella famiglia
Herpesviridae. E’ una glicoproteina di tipo I di 906 residui aminoacidici,
costituita da una porzione N-terminale extracellulare, un dominio TM (residui
751-771) e una regione C-terminale citoplasmatica. Viene prodotta come
precursore N- ed O-glicosilato del peso molecolare di 160 KDa. A livello del
TGN il precursore è scisso dall’endonucleasi cellulare furina, enzima responsabile
del processamento proteolitico di vari pro-ormoni e numerosi substrati proteici
riconoscendo il motivo RX(R/K)R, presente in gB a livello dei residui 456-459. In
tal modo la glicoproteina viene scissa in due subunità rispettivamente di 116 e 55
KDa, che rimangono legate da ponti disolfuro (Figura 1.8.1). gB viene così
incorporata nel virione maturo in forma di omodimero. Tale caratteristica è
comune a tutte le gB ad eccezione degli omologhi in HSV-1, HSV-2 ed EBV,
42
_________________________________________________________________Introduzione
anche se non è indispensabile per la replicazione in coltura (Wells et al., 1990;
Brücher et al., 1990). La colocalizzazione di gB con marker del TGN è riportata
in molti lavori tra i quali Crump et al., 2003; Jarvis et al., 2002; Turcotte et al.,
2005. Il suo segmento idrofobico 714-747 e il motivo KNP (748-750) sono
coinvolti nel cleavage della glicoproteina e, aumentandone l’affinità per i
chaperoni molecolari Bip/Grp78 e Grp94, ne causano la ritenzione nel RE. Il
dominio TM, invece, svolge la funzione di ancoraggio alla membrana (Zheng et
al., 1996).
gB svolge un ruolo critico insieme a gM nell’attacco alla cellula, poiché entrambe
le glicoproteine legano i proteoglicani di eparansolfato. Successivamente
interviene nelle fasi di entry grazie all’interazione con vari recettori cellulari: gli
eterodimeri di integrina, i recettori per l’EGFR e il TLR-2, mediando così la
penetrazione del virus nella cellula. In questa fase gB forma insieme al complesso
gH/gL il core fusion machinery, conservato in tutti gli herpesvirus e necessario
per mediare la fusione tra le membrane cellulare e virale. È stato ipotizzato che sia
l’interazione con le integrine β2 a mediare l’attività fusogena di gB. La sua
interazione con le integrine β1 è mediata dal suo disintegin-like domain (DLD)
(AA 92-111) (Feire et al., 2004).
Oltre a svolgere un ruolo fondamentale nell’entrata, la glicoproteina è richiesta
insieme al complesso gH/gL nel processo di diffusione cellula-cellula attraverso le
giunzioni cellulari, ruolo conservato anche per gli omologhi in HSV-1, HSV-2,
PRV, EBV, HHV-8.
Più controverso è il ruolo di UL55 a livello di assemblaggio e gemmazione virali,
poiché sembrano esserci differenze specifiche tra i vari herpesvirus. In particolare
i difetti di budding riscontrati per HSV-1 con gB deleta (totalmente o
parzialmente a livello della coda) non sono stati altrettanto riproducibili in altri
virus come PRV e lo stesso HCMV, in cui, in base alle ultime evidenze, UL55
non sarebbe essenziale per l’assemblaggio. Questo risultato deriva da saggi di
complementazione effettuati con un virus ricombinante deleto di gB mediante la
tecnologia del BAC (bacterial artificial chromosome) e pseudotipizzato in
fibroblasti esprimenti gB wild-type (wt). La totale delezione di gB ha evidenziato
come la glicoproteina sia essenziale in fusione ed entry, nonchè nella diffusione
cellula-cellula, ma non nell’uscita del virus (Isaacson and Compton, 2009).
43
_______________________________________________________________________________
gB è il maggiore bersaglio di anticorpi neutralizzanti ed è, pertanto, studiata per la
messa a punto di vari tipi di vaccino. Gli anticorpi, riconoscendo due differenti
domini antigenici di gB, possono inibire l’attacco e bloccare la fusione e, pertanto,
possono agire in diverse fasi dell’entry. Anche in assenza di altri componenti
virali ed in particolare dopo il legame alle integrine, la glicoproteina è in grado di
innescare una cascata di eventi di signaling, inducendo l’attivazione della risposta
immunitaria innata con la produzione di interferone e di citochine infiammatorie,
riarrangiamenti del citoscheletro e l’attivazione di chinasi.
UL55, come tutti gli omologhi nella famiglia degli herpesvirus, contiene a livello
della coda citoplasmatica due motivi ricchi di tirosine (YXXΦ 845-848 e 894897), due motivi di dileucina (LL 848-849 e 883-884) ed un cluster acido
all’estremità C-terminale (DSDEEENV 899-906), che ne promuove, quando la
serina 900 è fosforilata, l’interazione con PACS-1.
Figura 1.8.1 Domini in cui è organizzata la glicoproteina B di HCMV (UL55).
Avendo un cluster particolarmente acido, UL55 è molto sensibile alle variazioni
dei livelli di PACS-1, ad esempio in presenza di una forma dominante negativa o
se il trasportatore viene depleto. Diversamente la localizzazione di gH di HCMV,
che localizza ugualmente al TGN ma non contiene un cluster acido, non viene
influenzata (Crump et al., 2003). La mutazione della serina 900 ad acido
aspartico, che ne mima uno stato costitutivamente fosforilato, determina
l’aumento della forza di interazione con PACS-1 che non varia la velocità di
trasporto al TGN ma ne diminuisce la velocità di trasporto dal TGN ad altri
compartimenti (Jarvis et al., 2003). Crump e colleghi mostrano che la deplezione
di PACS-1, inoltre, causa una diminuzione dal 40 al 50% di progenie di HCMV
infettiva, mentre in cellule sovraesprimenti PACS-1 si osserva un aumento di
virus prodotto del 200-250% (Crump et al., 2003). Questo lavoro, così come
Krzyzaniak et al., 2007, suggeriscono l’importanza maggiore per le glicoproteine
di HCMV del loop regolato da PACS-1 rispetto a quello membrana
44
_________________________________________________________________Introduzione
plasmatica/EE/ERC. Secondo Krzyzaniak e colleghi, però, l’interazione di PACS1 con il cluster acido non dipende dallo stato di fosforilazione della serina ma
dall’acidità del cluster, che in UL55 Asp900 è maggiore poiché viene aggiunto un
residuo acido. Infatti, una forma tronca della gM di HCMV priva del cluster acido
è mostrato avere un’efficienza di trasporto al TGN rallentata e, poiché, secondo
questo lavoro, il passaggio al TGN è richiesto per il successivo reclutamento
all’AC, questo effetto spiegherebbe il ritardo del reclutamento nel sito di
assemblaggio di questo mutante. Un altro mutante di gM, invece, che presenta 6
residui acidi invece di 12 presenta un comportamento intermedio rispetto a gM wt
e alla forma tronca (Krzyzaniak et al., 2007).
1.9
Proteine del pathway dei multivesicular body coinvolte nella
gemmazione di virus dotati di envelope
Molte evidenze in letteratura hanno dimostrato il coinvolgimento del sistema
endosomiale cellulare nella gemmazione di varie famiglie di virus con genoma ad
RNA dotati di envelope quali retrovirus, filovirus e paramyxovirus. Tale sistema
rappresenta una complessa rete di compartimenti membranosi che coordinano il
trasporto delle proteine tra la membrana plasmatica, il TGN ed i vacuoli/lisosomi.
Un ruolo centrale a questo livello è svolto da un organello di recente
individuazione e denominato multivesicular body (MVB).
La sua biogenesi avviene attraverso la formazione di vescicole intraluminali (ILV)
che gemmano dalla membrana all’interno degli endosomi. Così formatisi i MVB
fondono con il vacuolo/lisosoma, dove le proteine contenute nelle ILV sono
degradate da lipasi e idrolasi (Katzmann, 2002). Le proteine che non sono
inglobate nelle ILV vengono o riciclate, ritornando alla superficie cellulare o al
Golgi, o rimangono nella membrana esterna dei MVB, sfuggendo così alla
degradazione (Piper and Katzmann, 2004). Le proteine destinate alla degradazione
nel lisosoma vengono secrete nelle vescicole intraluminari dei MVB, che a loro
volta fondono con i lisosomi. I MVB sono delimitati da doppia membrana e
presentano solitamente una matrice elettron-lucente. Il loro diametro medio è di
200-500 nm, mentre il diametro delle ILV varia dai 40 ai 150 nm.
Nel lievito la biogenesi dei MVB richiede 17 proteine dette Vps (vacuolar protein
sorting) o di classe E, perché la perdita della loro funzione genera il fenotipo detto
di classe E, caratterizzato dal blocco della formazione dei MVB e dall’accumulo
45
_______________________________________________________________________________
di compartimenti endosomiali deformati e multilamellari, conosciuti come
compartimenti di classe E. Inoltre, il corretto indirizzamento delle proteine
vacuolari viene inibito e queste si accumulano sulle membrane esterne dei
compartimenti di classe E. E’ stato identificato un omologo umano per ciascuna
delle proteine di classe E di lievito, a dimostrazione della conservazione
nell’evoluzione della via cellulare regolata dai MVB. La maggior parte delle
proteine Vps svolge la sua funzione all’interno di uno dei quattro complessi
solubili che vengono reclutati in successione nel sito di formazione dei MVB e
chiamati ESCRT-0 (endosomal sorting complex required for transport) o HRS,
ESCRT-I, ESCRT-II e ESCRT-III (Katzmann, 2002; Figura 1.9.1).
Per permettere il riciclo del macchinario di assemblamento dei MVB, i complessi
ESCRT sono disassemblati nel sito di invaginazione della membrana dall’attività
enzimatica della AAA (ATPase associated with various cellular activities)
ATPasi Vps4, reclutata da ESCRT-III (Babst et al., 2002). I dominanti negativi di
questa proteina, come Vps4pE228Q, inibiscono il sorting ai MVB originando il
fenotipo di classe E. Le cellule di mammifero presentano due proteine Vps4
paraloghe, Vps4A e Vps4B/Skd1, che mostrano un elevato grado di identità tra
loro (80%) e con la proteina di lievito Vps4p (59 e 60% rispettivamente). In
lievito, nello stato basale, Vps4p è una proteina citosolica dimerica che porta
legato l’ADP. Il legame dell’ATP permette l’oligomerizzazione di Vps4p in un
complesso stabile, costituito da cinque dimeri e il suo reclutamento dal citoplasma
all’endosoma, tramite l’interazione con la proteina Vps24 (denominata CHMP3
nelle cellule di mammifero), appartenente al complesso ESCRT-III. A questo
punto, l’oligomerizzazione dei dimeri attiva la funzione ATPasica e il
cambiamento conformazionale conseguente all’idrolisi porta al disassemblaggio
dell’oligomero. Le proteine che costituiscono i complessi ESCRT-I-II-III vengono
rilasciate e possono legarsi nuovamente in membrana e iniziare un nuovo ciclo
(Babst, 2005).
La biogenesi dei MVB attraverso la formazione di vescicole che gemmano
all’interno degli endosomi è topologicamente identica alla gemmazione virale.
Questo può spiegare perché molti virus si siano evoluti per sfruttare questo
pathway per il loro rilascio dalla cellula. Dati recenti, infatti, hanno indicato il
coinvolgimento dei MVB nell’assemblaggio e il rilascio di molti virus ad RNA
provvisti di envelope: retrovirus e tra questi lentivirus come HIV-1 (Strack et al.,
46
_________________________________________________________________Introduzione
2003; Morita et al., 2004), oncoretrovirus (Rous Sarcoma Virus), spumavirus
(Foamy virus), filovirus (Ebola) (Jasenosky et al., 2004), arenavirus e
paramyxovirus (Strack et al., 2003).
Fig. 1.9.1 Biogenesi dei MVB nel lievito e composizione dei componenti ESCRT (da Slagsvold
et al., 2006).
I virus ad RNA dotati di envelope acquisiscono quest’ultima struttura, gemmando
attraverso membrane cellulari di varia origine (membrana plasmatica, TGN).
Un’infezione produttiva richiede che tutti i componenti che rendono la particella
virale infettiva si localizzino in modo coordinato nel sito della membrana dove
avverrà la gemmazione. Per i retrovirus questi componenti includono le
glicoproteine virali dell’envelope (Env), la poliproteina Gag, gli enzimi (proteasi,
trascrittasi inversa ed integrasi), il genoma ad RNA e altre proteine accessorie. La
poliproteina Gag è l’unica proteina virale necessaria e sufficiente a guidare il
rilascio delle particelle virali, in quanto, anche in assenza di altri fattori virali, è in
grado formare particelle extracellulari virus-simili (VLP) (Göttlinger, 2001).
Esistono due meccanismi che mediano il reclutamento delle proteine virali, così
come di quelle cellulari, ai MVB. Il primo meccanismo è basato sulla loro
interazione fisica con componenti dei complessi ESCRT, mentre il secondo
meccanismo è rappresentato dalla loro ubiquitinazione (Piper and Katzmann,
2004).
Per quanto riguarda il primo meccanismo, le interazioni sono mediate da domini
tetra-aminoacidici altamente conservati e ricchi in prolina contenuti a livello di
molte proteine strutturali virali e coinvolti nell’assemblaggio e nelle fasi tardive
del ciclo di replicazione virale e per questo detti late (L-)domain (Morita and
47
_______________________________________________________________________________
Sundquist, 2004; Demirov and Freed, 2004). Questi motivi, se mutati, portano
all’arresto dell’assemblaggio delle particelle negli stadi tardivi. Ne sono stati
identificati almeno 3 tipi: P(T/S)AP, YP(x)nL e PPxY. Il motivo P(T/S)AP è stato
identificato in tutti i lentivirus dei primati, come HIV-1 (Göttlinger et al., 1991), e
dei non primati, fatta eccezione per EIAV (virus dell’anemia infettiva equina),
dove è stato mappato il motivo YPxL. La sequenza PPxY è stata identificata negli
oncoretrovirus e, all’esterno della famiglia dei retrovirus, in filovirus (Ebola) e
arenavirus. L’identificazione di uno stesso L-domain in varie famiglie retrovirali è
significativo, perché porta ad ipotizzare che virus diversi dotati di envelope
gemmino attraverso meccanismi simili. A sostegno di questo è stato dimostrato
che i L-domain sono interscambiabili (Strack et al., 2000; Martin-Serrano et al.,
2001).
Per quanto riguarda il secondo meccanismo che controlla il corretto sorting delle
proteine riveste un ruolo molto importante l’ubiquitina (Ubi). L’ubiquitina è una
piccola molecola di 76 aminoacidi che interviene in numerosi fenomeni cellulari
fondamentali. L’ubiquitinazione viene definita come la formazione di un legame
isopeptidico tra il residuo di glicina C-terminale dell’ubiquitina e il gruppo
amminico ε di un residuo di lisina della proteina target o di un’altra molecola di
ubiquitina. Esistono vari pattern di ubiquitinazione: la multi-monoubiquitinazione
è definita come l’addizione di ubiquitina a vari residui di lisina di una proteina
target, mentre la poli-ubiquitinazione rappresenta il legame di lunghe catene di
ubiquitina ad un singolo residuo di lisina di una proteina. Le proteine destinate
alla degradazione nel proteosoma vengono poli- ubiquitinate attraverso i residui di
Lys48 o Lys29 dell’ubiquitina. Diversamente la mono- o oligo-ubiquitinazione
(principalmente attraverso i residui Lys63) determina la degradazione delle
proteine nel pathway dei MVB/lisosomi. Se questo è vero per le proteine cellulari
è altrettanto vero per molte proteine strutturali virali, che subiscono, pertanto cicli
di ubiquitinazione e deubiquitinazione che ne regolano il reclutamento. Numerosi
dati suggeriscono una connessione tra l’ubiquitina e il rilascio dei retrovirus: (1)
molti retrovirus, inclusi RSV, HIV, SIV e MLV, incorporano elevati livelli di
ubiquitina nelle loro particelle; (2) le proteine Gag di HIV-1 e MLV sono monoubiquitinate in molteplici siti; (3) i livelli di ubiquitinazione di Gag sono alterati
dalla presenza o assenza di un L-domain funzionale (Strack et al., 2000; MartinSerrano, 2004); (4) inibitori del proteosoma che esauriscono i pool di ubiquitina
48
_________________________________________________________________Introduzione
libera portano all’arresto della gemmazione del virus in stadi tardivi (Strack et al.,
2002); e (5) mutazioni dell’ubiquitina possono inibire la gemmazione di HIV ed
Ebola (Strack et al., 2002). Sembra, quindi, che l’attacco dell’ubiquitina al Gag
funga da segnale endocitico e che questa proteina vada incontro a cicli di
ubiquitinazione/deubiquitinazione durante la gemmazione virale (Martin-Serrano
et al., 2001).
Alcune proteine Vps presentano un’attività di legame all’ubiquitina ben
caratterizzata. Queste sono: Hrs (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine
kinase substrate) e Tsg101 (tumor susceptibiliy gene 101). La prima è una
proteina solubile e rappresenta la subunità principale del complesso HRS, di cui
fanno parte anche altre proteine di classe E. Viene reclutata alla membrana
endosomiale e, in questa sede, prende contatto con l’ubiquitina delle proteine qui
presenti attraverso uno specifico dominio (ubiquitin-interacting motif, UIM). Una
volta in membrana Hrs è in grado di reclutare il complesso solubile ESCRT-I
mediante interazioni dirette con uno dei suoi componenti, la proteina Tsg101.
Questa proteina è costituita da 390 residui aminoacidici e contiene a partire dal Nterminale il dominio UEV (ubiquitin E2 variant, 1-145), un dominio ricco in
prolina (PRO) (146-215), un putativo dominio coiled-coil (CC) (240-311) e,
infine, il dominio steadiness box (S-Box) (330-390). Inoltre tra i domini CC e Sbox (residui 320-323) è presente il motivo PTAP (Figura 1.9.2). Il dominio UEV è
omologo al dominio caratteristico delle E2 ubiquitino ligasi, ma è privo
dell’attività catalitica, poichè non è presente il residuo di cisteina nel sito attivo
necessario per l’attività enzimatica di trasferimento dell’ubiquitina (Morita and
Sundquist, 2004). Il dominio UEV media l’interazione di Tsg101 sia con residui
di ubiquitina sia con il L-domain P(T/S)AP di Hrs e di Gag. I residui aminoacidici
che
influenzano
maggiormente
l’affinità
delle
due
interazioni
sono
rispettivamente i residui N45 e M95 (Pornillos et al., 2003).
Fig. 1.9.2 Domini in cui è organizzata la proteina Tsg101 (modificato da Stuchell et al.,
2004).
49
_______________________________________________________________________________
Molte evidenze in letteratura dimostrato che le proteine strutturali di HIV-1 e 2 ed
Ebola si sono evolute per mimare la proteina cellulare Hrs nella sua normale
funzione di reclutamento, allo scopo di dirottare il macchinario che catalizza la
formazione
e
la
gemmazione
di
vescicole
dei
MVB.
Infatti,
sia
nell’organizzazione strutturale che nelle proprietà biochimiche, Hrs e la proteina
Gag di HIV presentano delle somiglianze (Pornillos et al., 2003): entrambe 1)
presentano dei motivi aminoacidici che ne permettono il reclutamento in
membrana; 2) contengono il motivo P(S/T)AP in una regione ricca in prolina; 3)
tale motivo è il sito di interazione con Tsg101; 4) sono mono-ubiquinate. Si
ipotizza che dopo essere stato reclutato in membrana dalle proteine virali, Tsg101
scambi queste come proteine da incorporare in vescicole e recluti il restante
macchinario dei MVB necessario a completare il processo di gemmazione. Questo
evento è dimostrato dal blocco del rilascio delle particelle nella fase di fissione
dalla membrana in assenza di Tsg101.
Una volta attivato, Tsg101 recluta in membrana un altro complesso solubile di
proteine di classe E detto ESCRT-II, il quale a sua volta è richiesto per iniziare
l’assemblaggio del complesso ESCRT-III sulle membrane endosomiali (Babst et
al., 2002). ESCRT-III nelle cellule di mammifero è costituito dalle proteine
CHMP. Tra queste CHMP4 interagisce con la proteina AIP1 (ALG-2 interacting
protein 1) (o Alix, ALG-2 interacting protein x), la quale sembra funzionare nelle
tappe finali del pathway dei MVB, collegando ESCRT-I ad ESCRT-III.
AIP1/Alix interagisce con Tsg101, e rappresenta il principale partner cellulare
delle proteine Gag che contengono come L-domain il motivo YP(x)nL. Questa
sequenza aminoacidica è presente nel dominio p9 della proteina Gag di EIAV e
nel dominio p6 della proteina Gag di HIV-1 (Strack et al., 2003). Il dominante
negativo di AIP1/Alix inibisce la gemmazione sia di HIV-1 che di EIAV.
Il meccanismo che controlla la coniugazione delle proteine all’ubiquitina prevede
tre eventi: l’attivazione dell’ubiquitina in modo ATP-dipendente da parte della
classe di enzimi ubiquitin-activating enzymes o enzymes-1 (E1), che legano il
residuo C-terminale dell’ubiquitina; il trasferimento dell’ubiquitina al gruppo
tiolico del residuo di cisteina degli ubiquitin-conjugating enzymes (E2), che
rappresentano le proteine carrier dell’ubiquitina; infine, il legame dell’ubiquitina
alla proteina target da parte delle ubiquitin-ligase proteins (E3) attraverso il
gruppo amminico ε di un residuo di lisina. Tra le E3 ubiquitino ligasi che
50
_________________________________________________________________Introduzione
svolgono un ruolo fondamentale nell’ubiquitinazione delle proteine destinate ai
MVB vi sono quelle della famiglia Nedd4 (neural precursor cell expressed
developmentally down-regulated) (Nedd4, Itch/AIP4 (atrophin-1 interacting
protein 4), WWP1 e WWP2) (Blot et al., 2004). Questa famiglia è composta
nell’uomo da nove membri, che condividono una struttura simile con un dominio
N-terminale C2 che lega i lipidi di membrana, seguito da multipli domini WW e
da un dominio C-terminale HECT (homologous to E6-AP C terminus), che
contiene il residuo di cisteina catalitico. I domini WW ne mediano l’interazione
con i motivi PPxY delle proteine Gag di alcuni retrovirus o delle proteine
strutturali di altri virus a RNA dotati di envelope (filovirus). Il fatto che la loro
ubiquitinazione Nedd4-mediata ne promuova l’entrata nel pathway dei MVB è
confermato dal fatto che gli inibitori dei proteosomi interferiscono con il rilascio
delle particelle virali.
Una volta reclutate attraverso l’ubiquitinazione, prima di entrare nei MVB, le
proteine subiscono uno step di deubiquitinazione ad opera di deubiquitinasi. A
tale livello svolgono un ruolo centrale UBPY (ubiquitin-specific processing
protease Y)/USP8 e AMSH (associated molecule with the Src homology 3 domain
of STAM). Entrambi gli enzimi legano il dominio SH3 di STAM, componente
dell’ESCRT-0. Nonostante entrambi deubiquitinino le proteine target a cui si
legano, gli effetti sui cargo e la loro deplezione mostrano risultati opposti. Per
spiegare tali effetti è stato, pertanto, proposto un modello di funzionamento delle
due deubiquitinasi (Welchman et al., 2005; Clague and Urbe, 2006; McCullough
et al., 2008). Questo modello prevede che AMSH deubiquini le proteine cargo (ad
esempio EGFR) per permetterne il reciclo e determini pertanto l’accumulo delle
proteine deubiquitinate e di ubiquitina libera a livello endosomiale (Welchman et
al., 2005; McCullough et al., 2008). Inoltre, l’enzima trasforma CHMP3 in un
potente inibitore del rilascio di HIV-1. La forma dominante negativa AMSHD348A,
che contiene una mutazione del residuo conservato di acido aspartico contenuto
nel dominio JAMM (JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme), intensifica gli effetti
della proteina wt, mentre siRNA di AMSH ha opposti effetti, determinando la
degradazione del cargo e incrementando la gemmazione virale (Zamborlini et al.,
2006; Agromayor and Martin Serrano, 2006). UBPY, invece, interviene nella
deubiquitinazione delle proteine bersaglio per permetterne la degradazione sia nel
pathway dei MVB sia nel proteosoma, con un ruolo analogo a quello proposto per
51
_______________________________________________________________________________
Doa4 in lievito. Il mutante a livello della cisteina catalitica (UBPYC786S) e siRNA
di UBPY hanno simili effetti, determinando l’accumulo dei cargo ubiquitinati
(Mizuno et al., 2005; Alwan et al., 2006; Row et al., 2007; Komada, 2008).
Sono state identificate molte proteine di sorting (Eps15, Epsin, CIN85, Tom,
Tollip, Vps36/Eap45, STAM, GGA, SH3, GAT, CUE, NZF, GLUE) che
riconoscono cargo ubiquitinati e che per la maggior parte sono esse stesse
ubiquitinate. Esse potrebbero agire semplicemente riconoscendo la proteina
ubiquitinata o avvicinando al complesso le ubiquitino ligasi. Sono localizzate in
membrana, TGN ed endosomi, per cui a seconda della loro localizzazione
mediano:
1
internalizzazione dalla membrana plasmatica
2
sorting dal TGN agli endosomi
3
sorting ai MVB
Tra i trasportatori più importanti coinvolti nel sorting dal TGN e dagli endosomi
in CCV ricche di AP-1 verso i MVB/LE vi sono le proteine GGA (GGA1, 2 e 3) e
le proteine Tom (Tom1, Tom1L1 e Tom1L2).
Le proteine GGA riconoscono il motivo DXXLL nelle proteine target e le
isoforme 1 e 3 contengono un motivo DXXLL con cui legano il loro stesso
dominio VHS, autoinibendosi. Sono attivate e legano le proteine target
defosforilate (al contrario di PACS-1) mentre CKII, fosforilandole, trasferisce la
proteina cargo ad AP-1. Tutte tre le isoforme (la 3 con maggiore avidità) sono
mono-ubiquitinate da Nedd4 nel dominio GAT (GGA and TOM). Tramite questo
dominio, inoltre, legano Radaptina 5, Tsg101 (competendo con Gag di HIV, Yuko
Yanagida-Ishizaki et al., 2008) e l’ubiquitina.
I trasportatori Tom1, Tom1L1 e Tom1L2 legano proteine prive del motivo
DXXLL e sono anch’esse mono-ubiquitinate.
Sia le proteine GAG sia le Tom legano la catena pesante della clatrina e Hrs
mediante il dominio VHS. Nelle Tom il legame a Tsg101 non è mediato dal
dominio GAT ma dai due L-domain PTAP e PSAP.
Alcune evidenze supportano l’ipotesi che entrambe queste famiglie di
trasportatori medino il sorting ai MVB senza il bisogno di riconoscere particolari
domini ma solo attraverso l’ubiquitinazione delle proteine cargo (Puertollano and
Bonifacino, 2004). Sembra, quindi, che tali molecole abbiano un ruolo analogo a
52
_________________________________________________________________Introduzione
Hrs come “adattatori endosomiali all’ubiquitina”, che legano cioè proteine
ubiquitinate per poi trasferirle a Tsg101 e ai complessi ESCRT.
Complex
ESCRT-0
Human
Protein
protein
length
Hrs
777
Motifs
VHS, (UIM),
Other names
HGS
NCBI locus
Yeast
link ID#
ortholog
9146
Vps27p
8027
Hse1p
10254
Hse1p
7251
Vps23p
FYVE, coiled-coil,
PSAP
STAM1
540
STAM2
525
VHS, UIM, SH3,
HBP/EAST
coiled-coil
ESCRT-I
Tsg101
390
UEV, coiled-coil,
PSAP
VPS28
221
VPS37Aa
397
coiled-coil, Mod_r, HCRP1/FLJ32642
51160
Vps28p
137492
Vps37p
79720
Vps37p
UEV
VPS37B
285
a
coiled-coil, Mod_r, FLJ12750
PTAP
VPS37Ca
523
coiled-coil, Mod_r FLJ20847
55048
Vps37p
VPS37D
397
coiled-coil, Mod_r WBSCR24/FLJ32642
137492
Vps37p
EAP20
176
84313
Vps25p
EAP30
258
11267
Vps22p
EAP45
386
CGI-145
51028
Vps36p
CHMP1A
196
PCOLN3/CHMP1
5119
Did2p
CHMP1B
199
CHMP1.5
57132
Did2p
CHMP2A
222
BC-2
27243
Vps2p/Did4p
CHMP2B
213
CHMP2.5/CGI-84
25978
Vps2p/Did4p
CHMP3
222
CGI-149/NEDF
51652
Vps24p
CAC14088/C20orf178
128866
Vps32p/Snf7p
a
ESCRT-II
ESCRT-III
hVPS25/MGC10540
Altamente carico,
coiled-coil,
Vps4
Altre
CHMP4Ab
224
CHMP4B
265
CDA04/HSPC134
29082
Vps32p/Snf7p
CHMP4C
233
MGC22825
92421
Vps32p/Snf7p
CHMP5
219
HSPC177/CGI-34
51510
Vps60p/Mos10p
CHMP6
201
FLJ11749
79643
Vps20p
Vps4A
437
Vps4
27183
Vps4p
Vps4B
444
AAA-ATPase
SKD1
9525
Vps4p
AIP1
868
Bro1, coiled-coil,
HP95/ALIX
10015
Vps31p/Bro1p
C6orf55/DRG1/My012
51534
Vta1p
NHE6/KIAA0267
10479
Vps44p/Nhx1p
b
SNF7 domain
PTAP
proteine
LIP5
SLC9A6
307
c
669
Sodium/proton
exchanger
Tabella 1.9.1 Le proteine di classe E umane (Morita and Sundquist, 2004). Le proteine
rilevanti per questo lavoro sono evidenziate in rosso.
53
_______________________________________________________________________________
1.10
Ruolo dei multivesicular body nella gemmazione di virus a DNA
Un’attuale oggetto di indagine mira a capire se il modello ormai consolidato ed
accettato per la gemmazione dei virus dotati di genoma ad RNA attraverso le
membrane dei MVB, sia applicabile anche a famiglie virali con genoma a DNA.
Nel nostro laboratorio ed in altri gruppi è stato dimostrato che HSV-1 utilizza le
membrane dei MVB per acquisire l’envelope e gemmare e che l’espressione di
forme dominanti negative di Vps4 e delle proteine del complesso ESCRT-III
causa una notevole riduzione del rilascio di particelle virali infettive, mentre non
sono influenzate infezione, trascrizione genica e sintesi proteica (Calistri et al.,
2007; Crump et al., 2007; Pawliczek and Crump, 2009). Approfondendo i
meccanismi con cui il virus entra in questo pathway, il nostro gruppo di ricerca ha
chiarito come la gB di HSV-1 svolge un ruolo critico. Questa glicoproteina non
contiene motivi sovrapponibili ad una sequenza consenso di un L-domain, ma
entra nei MVB e colocalizza con il marker LAMP-1 grazie alla sua monoubiquitinazione. In cellule umane esprimenti le forme dominanti negative di Vps4
e Vps24 sono alterati la maturazione ed il trafficking di gB. La parziale delezione
a livello della coda citoplasmatica di gB (gB867) comporta una drammatica
riduzione dell’ubiquitinazione e del rilascio di progenie infettiva a livello
extracellulare (Calistri et al., 2007).
Un altro virus a DNA che sfrutta il macchinario dei MVB è il virus dell’epatite B
(HBV). Le proteine dell’envelope di HBV colocalizzano con AIP1/Alix e Vps4B.
Inoltre AIP11-702, una forma dominante negativa di AIP1, inibisce la produzione e
il rilascio di virus, senza significativi effetti sulla formazione dei nucleocapsidi,
mentre Vps4BE235Q inibisce sia la produzione di nucleocapsidi sia la gemmazione.
Queste forme dominanti negative non compromettono, invece, il rilascio di
particelle sub-virali provviste di pericapside ma prive di nucleocapside e
aumentano il rilascio di nucleocapsidi nudi (Lambert et al., 2007; Watanabe et al.,
2007).
Più recentemente l’analisi strutturale mediante microscopia elettronica ha
permesso di osservare che HHV-6 gemma a livello dei MVB e in vescicole
derivate dal TGN positive per CD63 e TGN46 e che CD63 è incorporata nel
virioni (Mori et al., 2008). Gli autori suggeriscono che le membrane che
54
_________________________________________________________________Introduzione
avvolgono HHV-6 abbiano caratteristiche intermedie tra quelle del TGN e quelle
endosomiali.
Una simile conclusione è quella attualmente avvalorata anche per HCMV in base
al modello proposto da Das e colleghi sulla struttura e composizione dell’AC e su
un lavoro recente di Capeda e colleghi. Nei lavori Sanchez et al., 2000 e
Homman-Loudly et al., 2003 si evidenzia che i marker Rab 7 (LE), LAMP-1 (LE
e lisosomi) e LAMP-2 (lisosomi) non concentrano a livello dell’AC, ma sembra
che alcuni aspetti della via di degradazione lisosomiale siano alterati. In base al
lavoro Capeda et al., 2009 sono reclutati all’AC e incorporati nei virioni di
HCMV marker dei EE, dei MVB/LE e del TGN: EEA-1, il recettore per la
transferrina (TfR, marker dei recycling endosomes che colocalizza con UL33),
l’annessina 1, CI-M6PR (cation indipendent mannose 6-phosphate receptor),
TGN46 e CD63. Analogamente ai due lavori precedenti non si osserva accumulo
all’AC di LAMP-1 e LAMP-2. Inoltre Capeda e colleghi hanno evidenziato una
riduzione significativa nel corso dell’infezione dei livelli sia dei trascritti sia delle
proteine di TGN46, CD63, annessina 1 e CD-M6PR (cation dipendent mannose
6-phosphate receptor) e che i virioni positivi per TGN46 e CD63 sono infettivi
(Capeda et al., 2009). Quale sia il reale apporto dei MVB nella formazione
dell’AC e quali componenti ESCRT ne siano reclutati è ancora oggetto di studio e
la letteratura fino a questo momento appare controversa. Fraile-Ramos e colleghi
mostrano che durante l’infezione i recettori chemochinici virali di HCMV UL33,
US28 e US27 e le glicoproteine gB e gH localizzano ai MVB/LE (Fraile-Ramos
et al., 2002 e 2003). Gli stessi autori, però, hanno osservato che, differentemente
da quanto accade nei retrovirus in cui il blocco del pathway dei MVB determina
un arresto della gemmazione virale, siRNA di Vps4 in cellule infettate con
HCMV incrementa la produzione virale. In base a questi risultati questi autori
suggeriscono che, nonostante molte proteine anche essenziali di HMCV
contengano sequenze riconducibili a L-domain (tra queste, in particolare, due
motivi PTAP in pp150 e UL56 (una proteina non strutturale coinvolta nel
packaging del DNA virale nel nucleo), due motivi PPxY in gB e UL48 e più di 30
motivi YXXL, Figura.1.10.1), il virus non richieda le proteine ESCRT per
completare il suo envelopment (Fraile-Ramos et al., 2007).
55
_______________________________________________________________________________
Figura 1.10.1 Sequenze omologhe a L-domain identificate nelle proteine di HCMV. Le
proteine marcate in rosso sono essenziali per la replicazione virale (Fraile-Ramos et al., 2007).
Un coinvolgimento delle proteine ESCRT nelle fasi finali del ciclo replicativo di
HCMV è, invece, il risultato emerso dal lavoro di Tandom e colleghi, secondo cui
le forme dominanti negative di Vps4 e di CHMP1 inibiscono la replicazione
virale. Al contrario le forme dominante negative di Tsg101, AIP1 e WWP1 non
hanno effetto sulla maturazione del virus. Inoltre sia Vps4 sia CHMP1 sono
reclutati all’AC e colocalizzano con proteine virali come la gM in questo
compartimento.
56
_________________________________________________________________________Scopo
2
SCOPO
Nel corso degli ultimi anni diversi studi hanno permesso di chiarire che non solo
virus dotati di genoma ad RNA ma anche virus a DNA provvisti di envelope
utilizzano l’apparato dei multivesicular body (MVB) per completare correttamente
le fasi di assemblaggio e gemmazione dalla cellula. In particolare, il nostro e altri
laboratori hanno dimostrato che la maturazione del virus dell’herpes simplex di
tipo 1 (HSV-1) richede una corretta biogenesi dei MVB (Calistri et al., 2007;
Crump et al., 2007). Simili risultati sono stati ottenuti anche nel caso del virus
dell’epatite B (HBV) (Lambert et al., 2007; Watanabe et al., 2007) e
dell’herpesvirus umano di tipo 6 (HHV-6) (Mori et al., 2007). Più controverso
appare il ruolo svolto dai MVB nel ciclo relicativo del citomegalovirus umano
(HCMV). Da un lato, alcune evidenze sperimentali sembrano indicare che il virus
non utilizza le proteine necessarie alla biogenesi di questi organelli (ESCRT) nelle
fasi di maturazione del virione (Fraile-Ramos et al., 2007). Al contrario, più
recentemente, Tandom e colleghi hanno dimostrato che la gemmazione di HCMV
risulta significativamente ridotta quando il pathway di biogenesi dei MVB venga
bloccato, tramite l’espressione di forme dominanti negative di proteine chiave
nella biogenesi di questi organelli (Tandom et al., 2009).
Approfondendo i meccanismi molecolari che permettono ad HSV-1 di utilizzare
questo pathway, il nostro gruppo di ricerca ha chiarito come la glicoproteina B
(gB) giochi un ruolo in questo contesto. In particolare, abbiamo dimostrato che la
maturazione, il trafficking intracellulare e la localizzazione di gB richiedono una
corretta biogenesi dei MVB (Calistri et al. 2007). gB viene indirizzata ai MVB
grazie alla mono-ubiquitinazione della sua coda citoplasmatica e mutanti virali
esprimenti forme tronche di gB hanno una capacità ridotta di dare origine a
particelle mature e infettive (Calistri et al. 2007).
Il presente progetto di tesi è nato con l’obiettivo di chiarire se altri virus
appartenenti alla famiglia Herpesviridae utilizzino i MVB durante il proprio ciclo
replicativo. A tale scopo, siamo partiti dal presupposto che, essendo gB una delle
proteine più conservate all’interno della famiglia Herpesviridae, gli omologhi
della stessa in α, β e γ herpesvirus potessero svolgere un ruolo simile a quello da
noi dimostrato nel caso di HSV-1. In particolare, abbiamo focalizzato la nostra
attenzione su UL55, la gB di HCMV. I risultati riportati in questa tesi dimostrano
57
_______________________________________________________________________________
come anche la gB di HCMV rappresenti un link tra il virus e i MVB, ma con un
meccanismo diverso rispetto a quanto precedentemente dimostrato per l’omologo
in HSV-1.
58
____________________________________________________________Materiali
3
3.1
e metodi
MATERIALI E METODI
Linee cellulari
In questo lavoro sono state utilizzate le seguenti linee cellulari:
293T: cellule embrionali di rene umano a morfologia stellata, che esprimono
costitutivamente l'antigene T del virus vacuolante della scimmia (SV40),
garantendo un’efficiente replicazione dei vettori plasmidici che contengono
l'origine di replicazione di tale virus. Le cellule 293T sono state gentilmente
fornite dal Dott. Baltimore (Rockfeller University, New York) (ATTC Number
CRL-11268). Le cellule 293T erano coltivate in terreno di crescita DMEM
(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), addizionato con il 10% (v/v) di FBS,
(fetal bovine serum, Gibco), inattivato a 56°C per 30 minuti, L-glutamina 2 mM e
con gli antibiotici penicillina (100 U/ml) (Sigma) e streptomicina (100 µg/ml)
(Sigma)
COS 7: cellule di rene di scimmia a morfologia simil-fibroblastica, trasformate
con un mutante di SV40 difettivo dell’origine di replicazione e codificante
l’antigene T. Rappresentano, pertanto, un sistema d’ospite particolarmente
favorevole per realizzare trasfezioni in transient con plasmidi contenenti l’origine
di replicazione di SV40. Le cellule Cos7 venivano mantenute in MEM (Eagle’s
minimum essential medium) contenente il 5% (v/v) di FCS (fetal calf serum), Lglutamina, penicillina e streptomicina.
HFF (human foreskin fibroblast): fibroblasti umani, coltivati in MEM addizionato
con il 10% (v/v) di FCS, L-glutamina, penicillina e streptomicina.
MCR5 (human embryonic lung fibroblast): fibroblasti umani, coltivati in DMEM
con il 10% (v/v) di FCS, L-glutamina, penicillina e streptomicina.
Tutte le colture cellulari erano mantenute alla temperatura costante di 37°C in
ambiente umidificato al 5% di CO2 e sottoposte a periodici controlli per escludere
contaminazioni.
59
_______________________________________________________________________________
3.2
Ceppi virali
I ceppi virali utilizzati sono di seguito riportati:
HCMV AD169: questo isolato è il ceppo di laboratorio di HCMV ed è
stato interamente sequenziato nel 1990 (gentilmente fornito dalla Prof.ssa
Loregian, Università di Padova). Numero di riferimento NCBI: X17403.
HCMV TB40-BAC4: ricostituito dal ceppo endotelio-tropico TB40/E
(Sinzger et al., 2008) (fornito dal Dott. von Einem, Institute of Virology,
Uniklinik Ulm, Germany). Numero di riferimento NCBI: EF999921. ll
ceppo TB40/E è stato clonato come BAC in E.coli, come descritto in Hahn
et al., 2002. Brevemente, cellule HFF sono state trasfettate con il plasmide
pEB1097 contenente una cassetta tk-gpt-bac fiancheggiata dalle sequenze
omologhe a US1-US2 da una parte e US6-US7 dall’altra. Il giorno dopo il
monostrato è stato infettato con TB40/E a m.o.i. 5. Dopo 3 cicli di
selezione con xantina e acido micofenolico il DNA è stato estratto ed
elettroporato in E.coli DH10B. I batteri sono stati piastrati in terreno con
cloramfenicolo (CAF) e poi le colonie sono state coltivate in forma
liquida. 18 cloni sono stati usati per ricostituire il virus infettivo in cellule
MRC5 (ceppi TB40E-BAC 1-18). Tra questi il clone TB40(E)-BAC4 è
stato sequenziato, caratterizzato fenotipicamante e usato per la generazione
di mutanti.
3.3
Plasmidi
Di seguito sono descritti i plasmidi utilizzati in questo lavoro sperimentale:
pBJ5: plasmide che consente l’espressione in cellule eucariotiche di
sequenze geniche grazie alla presenza di un promotore ibrido (SRα)
costituito dalla sequenza del promotore precoce di SV40 fusa con la
regione R ed U5 derivata dalla LTR (long terminal repeat) del virus della
leucemia umana tipo 1 (human T-cell leukemia virus type-1, HTLV-1)
(Takebe et al., 1988) (Strack et al., 2003).
pBJ5-5’Flag Vps4: plasmide che deriva da pBJ5, in cui è stato inserito nel
sito di policlonaggio, a livello dei siti di restrizione XhoI ed EcoRI, il gene
che esprime la proteina Vps4A, alla quale è stata fusa in 5’ la sequenza
dell’epitopo Flag (Strack et al., 2003).
60
____________________________________________________________Materiali
e motodi
pBJ5-5’FlagVps4E228Q: plasmide che deriva da pBJ5 5’Flag Vps4, nel
quale il gene che esprime la proteina Vps4 è stato mutagenizzato
sostituendo in posizione 228 della sequenza aminoacidica l’aminoacido
acido glutammico con l’aminoacido glutammina (Strack et al., 2003).
pcDNA3.1 e pcDNA3.1/V5-His/TOPO (Invitrogen): plasmidi dotati del
promotore precocissimo del HCMV, contenenti i geni per la resistenza
all’ampicillina (Amp) e il promotore e l’origine di SV40, seguiti dal gene
per la resistenza alla neomicina per l’espressione in cellule dotate
dell’antigene T di SV40. Rispettivamente a monte e a valle del sito di
policlonaggio sono state inserite le sequenze dei primer universali T7 e
BGH, utili per il sequenziamento. Il plasmide del kit Invitrogen
pcDNA3.1/V5-His/TOPO TA Expression Kit permette l’inserimento del
frammento di PCR poliadenilato per complementarietà con la porzione di
poli-T a singolo filamento alle due estremità del vettore lineare.
pBJ5-5’HA Tsg101: codifica la forma wt della proteina umana Vps23,
fusa in 5’ all’HA (Strack et al., 2003).
pBJ5-5’Flag AIP4, pBJ5-5’Flag WWP1, pBJ5-5’Flag Nedd4-1, pBJ55’Flag Nedd4-2s e le rispettive forme mutate pBJ5-5’Flag AIP4C830S,
pBJ5-5’Flag WWP1C886S, pBJ5-5’Flag Nedd4-1C867S, pBJ5-5’Flag Nedd42sC801S: codificano le forme wt e le forme cataliticamente inattive delle
ubiquitino ligasi AIP4, WWP1, Nedd4-1, Nedd4-2s fuse in 5’ al Flag
(Strack et al., 2000; 2003).
SRα-HA Ubi: esprime l’ubiquitina wt fusa all’HA (Strack et al., 2002).
pgBwt-MTS-HSV-1 gB: codifica la gB di HSV-1 ceppo F (gentilmente
fornito dalla Prof.ssa Campadelli-Fiume, Università di Bologna).
pcDNA3.1-UL27: codifica l’omologo della gB in PRV (UL27)
(gentilmente fornito dalla Prof.ssa Campadelli-Fiume).
pcDNA3.1-5’HA AMSH: codifica la deubiquitinasi AMSH fusa in 5’
all’HA (Zamborlini et al., 2006).
pEGFP C1-UBPY e pEGFP C1-UBPYC786S: codificano la deubiquitinasi
UBPY ed il suo mutante (gentilmente forniti dalla Prof.ssa Urbé,
Physiological Laboratory, School of Biomedical Sciences, University of
Liverpool).
61
_______________________________________________________________________________
pBJ5-5’HA Hrs: esprime la proteina umana Hrs fusa in 5’ all’epitopo HA
(gentilmente fornito dal Prof. Göttlinger, UMass Medical School,
Worcester).
pCR3.1-5’myc GGA1: esprime la proteina umana GGA1 fusa in 5’
all’epitopo myc (gentilmente fornito dalla Prof. Bonifacino, National
Institutes of Health, Bethesda).
pcDNA3HFN-5’Flag Tom1 e pcDNA3HFN-5’Flag Tom1L1: esprimono
le proteine umane Tom1 e Tom1L1 fuse in 5’ all’epitopo Flag
(gentilmente forniti dal Prof. Nakayama, Kyoto University).
pMSCV-5’Flag Tsg101: vettore oncoretrovirale che esprime la proteina
umana Tsg101 fusa al N-termine con l’epitopo Flag. Il vettore contiene le
sequenze LTR 5’ e 3’ del virus del sarcoma mieloproliferativo (pMSCV).
A valle della 5’ LTR è presente il segnale di incapsidazione (Ψ) e il sito di
policlonaggio. E’ inoltre presente, a monte della 3’ LTR, il gene che
conferisce la resistenza alla puromicina sotto il controllo trascrizionale del
promotore della fosfoglicerato chinasi murina; questa resistenza permette
la selezione di cloni cellulari che esprimono stabilmente il costrutto
(gentilmente fornito dal Prof. Göttlinger).
pMSCV-LTR GFP: vettore oncoretrovirale del tutto simile a quello
precedentemente descritto ma che esprime come transgene eterologo il
gene reporter GFP (gentilmente fornito dal Prof. Göttlinger).
MLV Gag-Pol: codifica Gag-Pol di MLV (virus della leucemia murina),
fornendo il packaging alle particelle oncoretrovirali (gentilmente fornito
dal Prof. Göttlinger).
VSV-G: codifica la glicoproteina del virus della stomatite vescicolare,
usata per pseudotipizzare le particelle oncoretrovirali, aumentandone così
il tropismo.
pEF (Invitrogen): plasmide dotato del promotore EF1α, contenenti i geni
per la resistenza all’Amp, il promotore e l’origine di SV40 e il gene per la
resistenza alla neomicina. A monte e a valle del sito di policlonaggio vi
sono le sequenze dei primer universali T7 e BGH usati per il
sequenziamento.
psVT28: vettore che contiene la sequenza Tn10 in grado di codificare in
modo costitutivo il repressore Tet (TetR). Il repressore, legando le
62
____________________________________________________________Materiali
e motodi
sequenze dell’operatore tet (tetO) posto entro il promotore di SV40, sotto
cui è posto il gene di interesse, interferisce con la formazione del
complesso di inizio trascrizione. Il legame di TetR è controllato dalla
tetraciclina o dal suo analogo doxiciclina, che riducendo l’affinità del
repressore
per
l’operatore
permettono
l’avvio
della
trascrizione
(gentilmente fornito dal Dott. von Einem).
psVT28-GFP Vp4 e psVT28-GFP Vp4E228Q: esprimono Vps4 e Vps4E228Q
fuse in 5’ alla GFP (gentilmente concessi dal Dott. von Einem).
BAC 36: cromosoma artificiale batterico contenente il genoma di HHV-8,
il gene reporter GFP e il gene per la resistenza all’igromicina (gentilmente
fornito dal Dott. Gao, University of Texas, San Antonio, USA).
pCMV71, plasmide che codifica la fosfoproteina del tegumento pp71 che
funziona da transattivatore virale ed usato in vitro per incrementare
l’efficienza di trasfezione del DNA virale (gentilmente fornito dal Dott.
von Einem).
Il mantenimento dei plasmidi in cellule procariotiche è consentito dall’origine di
replicazione batterica ColE1 o pUC di E.coli. Per l’amplificazione dei plasmidi in
cellule procariotiche è stato utilizzato il ceppo DH5α di E.coli (Invitrogen)
[endA1 hsdR17 (rK-mK+) glnV44thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 ∆ (laclZYAargF)U169 deoR (φ80dlac∆(lacZ)M15)].
Il ceppo batterico DH5α era coltivato in forma liquida in terreno Luria-Bertani
[LB, Bacto-triptone 1% (p/v), estratto di lievito 0,5% (p/v), NaCl 1% (p/v)] in
condizioni di agitazione a 37°C. Quando necessario, il terreno veniva solidificato
mediante aggiunta di agar 1,5% (p/v). Quando richiesto, era aggiunto l’antibiotico
di selezione, che consente la crescita selezionata di batteri resistenti, e CAF (12,5
µg/ml), che inibisce la sintesi proteica, legando il rRNA 23S della subunità 50S
del ribosoma batterico e inibendo la peptidil-trasferasi e usato per la crescita di
ceppi batterici contenenti il plasmide a basso numero di copie pBJ5.
63
_______________________________________________________________________________
3.4
Oligonucleotidi innesco
Nelle reazioni di amplificazione a catena della polimerasi (PCR), di mutagenesi e
di sequenziamento sono stati utilizzati oligonucleotidi innesco opportunamente
disegnati e riportati nelle tabelle 3.4.1, 3.4.2 e 3.4.3.
UL55 3’ Flag
UL55 F
UL55 3’Flag R
UL55 3’ HA
UL55833 3’Flag
UL55833 3’ HA
UL55 HindIII F
5’ CCC AAG CTT GCC ACC ATG GAA TCC AGG
ATC TGG TGC 3’
UL55 3’HA R
5’ C TAG TCT AGA TCA AGC GTA ATC TGG GAC
GTC GTA TGG GTA GAC GTT CTC TTC TTC GTC
3’
UL55833 F
5’ GAT AAT GCC ACC ATG GAA TCC AGG ATC
TGG TGC 3’
UL55833 3’Flag R 5’ CAT TAT TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT
GTA ATC GAG GTT CTC TTC TTC GTC 3’
UL55 HindIII F
UL55833 3’HA R
UL55 untagged
UL55
BamHIAscI F
UL55
3’HA
SwaI-NotI R
UL55 HindIII F
ORF8 3’Flag
UL55 untagged
NotI-XbaI R
ORF8 F
UL55 3’HA
(pEF, pSVT28)
ORF8 3’Flag R
ORF8787 3’Flag
ORF8787 F
ORF8787 3’Flag R
UL27 3’Flag
UL27 F
UL27 3’Flag R
UL27882 3’Flag
UL27882 F
UL27882 3’Flag R
UL75 3’Flag
UL75 F
UL75 3’ Flag R
64
5’ GAT AAT GCC ACC ATG GAA TCC AGG ATC
TGG TGC 3’
5’ CAT TAT TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT
GTA ATC GAG GTT CTC TTC TTC GTC 3’
5’ CCC AAG CTT GCC ACC ATG GAA TCC AGG
ATC TG GTG C 3’
5’ C TAG TCT AGA TCA AGC GTA ATC TGG GAC
GTC GTA TGG GTA GGA TGC ATC AGA CGA
CGG 3’
5’ CAC CGG ATC CGG CGC GCC ACC ATG GAA
TCC AGG ATC TGG TGC CTG 3’
5’ T CAG CGG CCG CAT TTA AAT TCA AGC GTA
ATC TGG GAC GTC GTA TG 3’
5’ CCC AAG CTT GCC ACC ATG GAA TCC AGG
ATC TG GTG C 3’
5’ CTA GTC TAG AGC GGC CGC TCA GAC GTT
CTC TTC TTC GTC G 3’
5’ GAT AAT GCC ACC ATG ACT CCC AGG TCT
AGA TTG GCC 3’
5’ CAT TAT TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT
GTA ATC CTC CCC CGT TTC CGG AC 3’
5’ GAT AAT GCC ACC ATG ACT CCC AGG TCT
AGA TTG GCC 3’
5’ CAT TAT TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT
GTA ATC GAT TTC CTC CCG TGT TGG GG 3’
5’ TAA GGA TCC GCC GCC ATG CCC GCT GGT
GGC GG 3’
5’ CAT TAT GAA TTC CTA CTT ATC GTC GTC
ATC CTT GTA ATC CAG GGC GTC GGG GTC C
3’
5’ TAA GGA TCC GCC GCC ATG CCC GCT GGT
GGC GG 3’
5’ CAT TAT GAA TTC CTA CTT ATC GTC GTC
ATC CTT GTA ATC CCC GCT GTT CTT CTT GCG
CG 3’
5’ CCC AAG CTT GCC GCC ATG CGG CCC GGC
CTC CCC C 3’
5’ C TAG TCT AGA TCA CTT ATC GTC GTC ATC
CTT GTA ATC GCA TGT CTT GAG CAT GCG GTA
GA 3’
____________________________________________________________Materiali
UL115 3’HA
5’HA Tsg101
UL115 BamHI F
UL115
EagI R
3’HA
5’HA
XhoI F
Tsg101
Tsg101
1-145
EcoRI R
Tsg101
1-215
EcoRI R
5’HA
Tsg101
215-390
XhoI F
Tsg101
390
EcoRI R
5’HA Tsg∆UEV
146-390 XhoI F
5’HA UBPY
5’HA
UBPY
BamHI F
UBPY EagI R
e motodi
5’ CGC GGA TCC GCC GCC ATG TGC CGC CGC
CCG GAT TG 3’
5’ ATAC CGG CCG TTA AGC GTA ATC TGG GAC
GTC GTA TGG GTA GCG AGC ATC CAC TGC TTG
AGG 3’
5’ TAA CTC GAG GCC GCC ATG TAC CCA TAC
GAC GTC CCA GAT TAC GCT GCG GTG TCG
GAG AGC CA 3’
5’ CAT CCG GAA TTC TCA ACG AGA GAA GAC
TGG AGG TTC 3’
5’ CAT CCG GAA TTC TCA GGC TCG GAT GGT
GTC CTC 3’
5’CAT CCG CTC GAG GCC GCC ATG TAC CCA
TAC GAC GTC CCA GAT TAC GCT CTC ATC TCT
GCG GTC AGT 3’
5’ CAT CCG GAA TTC TCA GTA GAG GTC ACT
GAG ACC G 3’
5’ CAT CCG CTC GAG GCC GCC ATG TAC CCA
TAC GAC GTC CCA GAT TAC GCT ATT TCG GCA
TCC TAT CCG CCA 3’
5’ CGC GGA TCC GCC GCC ATG TAC CCA TAC
GAC GTC CCA GAT TAC GCT CCT GCT GTG GCT
TCA GTT 3’
5’A TAC CGG CCG TTA TGT GGC TAC ATC AGT
TAC TC 3’
Tabella 3.4.1 Sequenze dei primer utilizzati per i clonaggi. Si evidenziano la porzione dei
primer contenente la sequenza degli epitopi Flag o HA, la sequenza di Kozak necessaria per
ottimizzare la sintesi proteica, i siti di restrizione degli enzimi usati per i clonaggi, i codoni di
inizio trascrizione ATG e di fine trascrizione CTA, TTA o TCA.
UL55PPSA mut F
UL55PPSA mut R
AMSHD348A mut F
AMSHD348A mut R
Tsg101N45A mut F
Tsg101N45A mut R
Tsg101M95A mut F
Tsg101M95A mut R
5’ CG TCG TTA CAG GCT (CCG CCT TCC [GCC]) GAG GAA
AGT G 3’
5’ C ACT TTC CTC ([GGC] GGA AGG CGG) AGC CTG TAA
CGA CG 3’
5’ CTC TCC AGT GTC [GCC] CTA CAC ACT CAC TGC 3’
5’ GCA GTG AGT GTG TAG [GGC] GAC ACT GGA GAG 3’
5’ TGG GAT TCA TAT GTT TTT[GCC]GAT GGC AGT TCC AGG
GAA 3’
5’ TTC CCT GAA ACT GCC ATC [GGC] AAA AAC ATA TGA
ATC CAA 3’
5’ TTT GTT AAG CCT ACT AGT TCA [GCG] ACT ATT AAA ACA
GGA AAG CAT 3’
5’ ATG CTT TCC TGT TTT AAT AGT [CGC] TGA ACT AGT AGG
CTT AAC AAA A 3’
Tabella 3.4.2 Sequenze dei primer utilizzati per le reazioni di mutagenesi. Tra parentesi tonde
vi è la sequenza PPSY, tra parentesi quadre l’aminoacido mutato e sono sottolineati i nucleotidi
che mutano le sequenze wt.
65
_______________________________________________________________________________
Mut UL55PPSY F
Mut UL55PPSY R
Mut UL55833 F
Mut UL55833 R
Mut UL55∆13-783 F
Mut UL55∆13-783 R
PCR UL55PPSY/UL55833 F
PCR UL55PPSY/UL55833 R
PCR UL55∆13-783 F
PCR H UL55 HEB R
AphAI-seq1
AphAI-seq2
5’ G GGC AGC ACC AAA GAC ACG TCG TTA CAG
GCT (CCG CCT TCC [GCC]) GAG GAA AGT GTT TAT
AAT TAG GAT GAC GAC GAT AAG TAG GG 3´
5´ TCC CGG TCC TTT GCG ACC AGA ATT ATA AAC
ACT TTC CTC ([GGC] GGA AGG CGG) AGC CTG TAA
CAA CCA ATT AAC CAA TTC TGA TTA G 3´
5’ TGG TCG CAA AGG ACC GGG ACC ACC GTC GTC
TGA TGC ATC C [TGA] CGG CGG CTC CGC CTT ACA
CAG GAT GAC GAC GAT AAG TAG GG 3´
5´ TCT GGT AAG CCT GCT CGT TGG TGT AAG GCG
GAG CCG CCG [TCA] GGA TGC ATC AGA CGA CGG
CAA CCA ATT AAC CAA TTC TGA TTA G 3´
5’ AC ATG GAA TCC AGG ATC TGG TGC CTG GTA
GTC TGC GTT AAA ACC TCT TTC CCT ATC TGG TAG
GAT GAC GAC GAT AAG TAG GG 3’
5’ CG GTG GTC CCG TCG GCG GAC ACC AGA TAG
GGA AGA GGT TTT AAC GCA GAC TAC CAG GCA
CAA CCA ATT AAC CAA TTC TGA TTA G 3’
5’ G GTC GAA GGC GTT GCC ACC 3’
5’ TCA GAC GTT CTC TTC TTC GTC AGA GTC 3’
5’ GG AGC CGG ACC GAC TTT GG 3’
5’ G ATC CAG CTT GAT ATC GGA TCC TCA GAC
GTT CGC TTC TTC GTC AGA G 3’
5’ GCA GTT TCA TTT GAT GCT CGA TG 3’
5’ CGT TTC CCG TTG AAT ATG GCT C 3’
Tabella 3.4.3 Sequenze dei primer utilizzati per la mutagenesi col BAC e per il controllo
delle mutagenesi per PCR. Tra parentesi tonde vi è la sequenza PPSY, tra parentesi quadre
l’aminoacido mutato e sono sottolineati i nucleotidi che mutano le sequenze wt. Si evidenzia la
porzione dei primer contenente la sequenza omologa al templato pEPkan-S.
T7
BGH
M13 F
M13 R
Tsg101M95A seq F
Tsg101N45A seq F
gB-112nt F
gB+2219nt F
5’ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3´
5´ TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3´
5’ GTA AAA CGA CGG CCA G 3´
5´ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3´
5’ AAT GTT ATT ACT CTA TAC 3’
5’ GCG GTG TCG GAG AGC CAG 3’
5’ GG AGC CGG ACC GAC TTT GG 3’
5’ G GTC GAA GGC GTT GCC ACC 3’
Tabella 3.4.4 Sequenze dei primer utilizzati per i sequenziamenti.
3.5
Tecniche di biologia molecolare
3.5.1
Purificazione del DNA plasmidico
Sono stati utilizzati diversi protocolli per la purificazione del DNA plasmidico,
che permettono di ottenere rese e gradi di purezza differenti.
Il protocollo della lisi alcalina modificato (Sambrook et al., 1989) permette di
purificare DNA a bassa resa (Mini prep) e ad un basso livello di purezza. I batteri
erano risospesi in una soluzione contenente glucosio 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH
8.0 e EDTA 10mM pH 8.0; la lisi batterica veniva effettuata in una soluzione
66
____________________________________________________________Materiali
e motodi
basica a base di NaOH 0,2 M e SDS 0,1%; infine una soluzione di potassio
acetato 5 M ripristinava il pH fisiologico. Il DNA veniva poi risospeso in buffer
TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8), addizionato di RNAsi
pancreatica (1 mg/ml, Roche).
Le Mini prep e le preparazioni plasmidiche in grande scala (Maxi prep) ad elevato
grado di purezza erano preparate con il metodo della lisi alcalina e purificate
rispettivamente con i kit QIAprep Spin Miniprep Kit o Plasmid Maxi Kit
(Qiagen). Il surnatante, ottenuto tramite centrifugazione delle cellule batteriche
lisate, veniva applicato ad una colonna a scambio anionico capace di legare il
DNA plasmidico. In tal modo era purificato da RNA, proteine ed impurità ad alto
peso molecolare utilizzando tamponi a bassa concentrazione salina. Il DNA
plasmidico era successivamente eluito dalla colonna per mezzo di tamponi ad
aumentata concentrazione salina. L’eluato così ottenuto veniva concentrato e
sottoposto a precipitazione con isopropanolo e, successivamente, ad un lavaggio
con etanolo al 70% (v/v) per rimuovere i sali. Il DNA ottenuto era sottoposto a
controllo mediante restrizione enzimatica (paragrafo 3.5.2) e successiva
migrazione elettroforetica in gel d’agarosio in tampone salino TBE 1X (Trisborato 0,009 M, EDTA 1 mM); inoltre la quantità di acido nucleico era
quantificata mediante lettura allo spettrofotometro (Eppendorf, Biophotometer),
alla lunghezza d’onda di 260 nm, corrispondente al massimo di assorbimento,
utilizzando cuvette di quarzo aventi un cammino ottico di 0,1 cm. La
concentrazione del DNA veniva calcolata tramite la legge di Lambert-Beer (A =
εxCxS, dove A = densità ottica; ε = coefficiente di estinzione molare, che per il
DNA a doppio filamento a 260 nm vale 6600 M-1 cm-1; C = cammino ottico; S =
concentrazione soluzione). La presenza di eventuali contaminazioni proteiche era
rilevata tramite lettura della preparazione alla lunghezza d’onda di 280 nm, alla
quale il legame peptidico ha il picco di assorbimento. Venivano considerate pure
le preparazioni per le quali il rapporto D.O.260/D.O.280 era compreso tra 1,8 e 2. Il
DNA plasmidico così ottenuto, presentando un elevato grado di purezza, poteva
essere utilizzato nelle trasfezioni di cellule eucariotiche.
67
_______________________________________________________________________________
3.5.2
Restrizioni enzimatiche
Le reazioni di restrizione enzimatica del DNA erano effettuate utilizzando gli
opportuni enzimi (Biolabs) nei rispettivi tamponi di reazione. Le reazioni erano
condotte alla temperatura ottimale dell’enzima (in genere 37°C) per il tempo
richiesto, a seconda del tipo di endonuclesi impiegata e della quantità di acido
nucleico da digerire; le unità di enzima impiegate erano proporzionali alla quantità
di DNA da digerire. Al termine della digestione i campioni venivano analizzati
tramite migrazione elettroforetica in gel d’agarosio all’1% addizionato di etidio
bromuro in tampone salino TBE 1X (Tris-borato 9 mM, EDTA 1mM) e
visualizzati al transluminatore a raggi UV. Per verificare la corretta dimensione
dei frammenti erano impiegati opportuni marcatori di peso molecolare noto, quali
il Marker VII (0,25 µg/ml) e il Marker II (0,25 µg/ml) (Roche/Boehringer).
3.5.3
Tecniche di clonaggio
In questo lavoro di tesi sono state utilizzate tre strategie di clonaggio.
Prima tecnica: si basava sull’amplificazione della sequenza genica da clonare
mediante la tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR, paragrafo
3.5.4). A tale scopo sono stati disegnati opportuni oligonucleotidi innesco in grado
di amplificare l’intera sequenza di interesse, addizionati all’estremità 5’ da
sequenze di taglio di opportuni enzimi di restrizione (Tabella 3.4.1). La PCR era
caricata in gel di agarosio e per verificare la corretta dimensione dei frammenti
venivano utilizzati opportuni marcatori di peso molecolare noto. Il frammento di
gel contenente la banda corretta era tagliato mediante l’utilizzo di un bisturi ed il
DNA era eluito grazie all’utilizzo del kit QIAGEN® "QIAquick gel extraction
kit”. Questo sistema è basato sulla solubilizzazione dell'agarosio e sul successivo
legame specifico degli acidi nucleici, in presenza di un tampone ad alta
concentrazione salina, alla membrana di silice-gel di una colonna a scambio
anionico. Le impurità, quali sali, agarosio, etidio bromuro, non sono trattenute
dalla membrana di silice ed il DNA così purificato era eluito con un tampone ad
alta forza ionica. Poi il prodotto di PCR era sottoposto a digestione enzimatica con
gli opportuni enzimi scelti per il clonaggio, i cui siti di restrizione erano contenuti
rispettivamente nei primer F e R. Il vettore eucariotico veniva sottoposto a
digestione con gli stessi enzimi e a defosforilazione con la fosfatasi alcalina ed il
68
____________________________________________________________Materiali
e motodi
suo buffer (Tris-HCl 50mM, MgCl2 10mM, DTT 10mm, ATP 1mM). Entrambi i
prodotti di restrizione erano nuovamente analizzati in gel d’agarosio allo 0,7% per
verificare la corretta dimensione dei frammenti e purificare il DNA dai tamponi
usati nella restrizione enzimatica ed estratti con il kit Quiaquick Gel extraction.
Per inserire il DNA nel vettore erano sfruttate le proprietà enzimatiche della DNA
ligasi del batteriofago T4 (4x105 U/ml) (Biolabs), capace di catalizzare in vitro la
formazione di legami fosfodiesterici tra il residuo di fosfato in 5' ed il gruppo
idrossilico in 3' delle estremità adiacenti. Le reazioni venivano effettuate in un
volume finale di 20 µl impiegando 1 unità di ligasi e incubate per 16 ore a 16°C.
Le quantità dei due frammenti usate nella reazione di ligazione erano calcolate
utilizzando la seguente formula:
X(ng)= Ypb x 50/ pb V
Dove:
X
= ng dell’inserto
Ypb
= paia di basi dell’inserto
50
= 50 ng di vettore
pb V
= dimensioni in paia di basi del vettore plasmidico
Si trattava in tutti i casi di ligazioni direzionate, in quanto le estremità
dell’amplificato e quelle del vettore erano prodotte utilizzando gli stessi enzimi e
quindi la probabilità che il frammento di interesse si inserisse nel vettore con
l’orientamento corretto era molto alta. Inoltre, era improbabile che il vettore si
richiudesse, in quanto le sue estremità risultavano incompatibili.
Seconda tecnica: in seguito all’amplificazione della sequenza genica da clonare
mediante PCR e all’estrazione e purificazione della banda di PCR corretta, il
DNA veniva poliadenilato, aggiungendo a 700 ng di prodotto di PCR 1 µl di Taq
DNA polimerasi gold (pre-attivata per 10 minuti a 95°C), 1 µl di buffer della Taq
gold contenente MgCl2+ e 1 µl di dATP 0,2 mM. Dopo 30 minuti a 70°C al
frammento poliadenilato (400-500 ng) era aggiunto il vettore pcDNA3.1/V5His/TOPO (5 ng) e 1 µl di soluzione salina (NaCl 1,2 M, MgCl2 0,06 M). La
reazione era mantenuta a temperatura ambiente per 30 minuti e poi bloccata in
ghiaccio. Infine per la trasformazione venivano usate le cellule competenti E.coli
TOP10 (paragrafo 3.5.5).
69
_______________________________________________________________________________
Terza tecnica: prevedeva l’ottenimento del frammento di DNA da clonare
mediante restrizione enzimatica di un plasmide contenente la sequenza genica di
interesse. Il frammento purificato da gel d’agarosio come precedentemente
descritto era utilizzato per la reazione di ligazione con l’opportuno plasmide.
Per tutte le tecniche di clonaggio i prodotti di ligazione venivano utilizzati per la
trasformazione dei batteri competenti (come descritto nel paragrafo 3.5.5) e fatti
crescere in terreno selettivo contenente l’antibiotico di selezione. Le colonie
resistenti erano incubate in 5 ml di terreno LB in presenza dell'antibiotico e fatte
crescere in agitazione 12 ore a 37°C. La presenza del DNA plasmidico veniva
verificata eseguendo miniprep con il metodo della lisi alcalina modificato. Il DNA
plasmidico purificato dai cloni così ottenuti era sottoposto a varie restrizioni
enzimatiche ed analizzato in gel d’agarosio all’1% per verificare la presenza
dell’inserto. Dai cloni contenenti la sequenza genica d’interesse il DNA
plasmidico era estratto mediante il kit QIAprep Spin Miniprep kit, per poter essere
controllato mediante sequenziamento. Una volta verificata la correttezza della
sequenza, si ottenevano le preparazioni plasmidiche ad alta resa con il kit Plasmid
Maxi.
3.5.4
Reazione di amplificazione a catena della polimerasi
Per amplificare la sequenza genica da clonare sono state eseguite reazioni di PCR
a partire da DNA plasmidico o genomico. Per amplificare i geni di HCMV è stato
utilizzato come templato il DNA genomico virale di HCMV ceppo AD169
estratto medinate il kit “QIAmp MinUlute Virus Spin, Qiagen”.
Nelle reazioni di PCR sono stati utilizzati i seguenti enzimi:
iProof High-Fidelity DNA Polymerase, il suo buffer iProof GC Buffer
(Bio-Rad), particolarmente adatto per amplificare templati ricchi in GC;
I- PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase (Biolabs).
La mix di PCR era preparata aggiungendo una miscela di dNTPs 0,2 mM, primer
forward (F) e reverse (R) 0,5 µM, l’enzima 1 U/µl, il suo buffer e 100 ng di
templato. Quando la sequenza da amplificare conteneva un’alta percentuale di
basi GC, alla miscela di reazione era aggiunto dimetilsulfossido al 2% (DMSO,
Sigma) per facilitare la denaturazione della sequenza genica di interesse. Il ciclo
70
____________________________________________________________Materiali
e motodi
di PCR prevedeva uno step iniziale di denaturazione del DNA e attivazione della
polimerasi a 98°C per 60 secondi; un ciclo di denaturazione a 98°C per 10
secondi; l’annealing ad una temperatura superiore di 3°C rispetto a quella più
bassa tra i due primer per 30 secondi; l’elongazione a 72°C per 30 secondi/Kb. In
genere, venivano effettuati 35 cicli di amplificazione in termociclatore
(Mastercycler personal, Eppendorf), seguiti dall’estensione finale a 72°C per 7
minuti.
3.5.5
Competenza e trasformazione batterica
I plasmidi ed i prodotti delle reazioni di ligazione sono stati trasformati in tre tipi
di cellule competenti a seconda del tipo di plasmide utilizzato.
La maggior parte venivano trasformati in cellule di E.coli, ceppo DH5α, rese
artificialmente competenti mediante la tecnica del cloruro di calcio. Le colonie
batteriche erano fatte crescere a 37°C in 3 ml di terreno liquido LB contenente
MgCl2 15 mM, in assenza di antibiotico per circa 12 ore, fino a raggiungere una
densità ottica pari a 0,4 alla lunghezza d'onda di 600 nm. In seguito, l'inoculo era
trasferito in 400 ml dello stesso terreno. Una volta raggiunta la densità ottica pari
a 0,4 alla lunghezza d'onda di 600 nm, si raffreddava rapidamente la coltura in
ghiaccio per interrompere la crescita batterica; i batteri erano quindi sedimentati
per centrifugazione a 3500 rpm a 4°C per 15 minuti e risospesi in una soluzione
fredda
contenente
MnCl2-4H2O
10
mM,
CaCl2
50
mM,
MES
[2-
(Nmorpholino)ethanesulfonic acid] 10 mM pH 6.3. I batteri venivano poi
centrifugati, delicatamente risospesi in 10 ml della stessa soluzione fredda
addizionata di glicerolo al 15% (v/v) e, quindi, aliquotati e conservati a -80°C. La
trasformazione di questo tipo di cellule competenti avveniva con il metodo
chimico mediante shock termico. Veniva cioè addizionato a 50 µl di cellule
batteriche competenti il DNA plasmidico (50-300 ng) o i prodotti delle reazioni di
ligazione, e la miscela era lasciata ad incubare in ghiaccio per 30 minuti. In
seguito era praticato lo shock termico a 37°C per 2 minuti. I batteri erano poi
raffreddati in ghiaccio qualche istante ed incubati a a 37°C per un'ora in 200 µl di
LB, consentendo così l’espressione e la sintesi della proteina che conferisce la
resistenza all'antibiotico di selezione. In seguito, tutta la sospensione era seminata
in piastre Petri contenenti LB-agar addizionato con l’antibiotico di selezione
71
_______________________________________________________________________________
(Amp 100 µg/ml o kanamicina (Kan) 50 µg/ml ed incubata 12 ore a 37°C al fine
di selezionare i batteri trasformati.
Le ligazioni dei kit pcDNA3.1/V5-His/TOPO TA Expression Kit erano
trasformate nel ceppo E.coli TOP10 (Invitrogen). Le cellule scongelate in
ghiaccio venivano addizionate con il vettore contenente l’inserto sottoposto a
poliadenilazione e TA-cloning. Si procedeva con lo shock termico di 2 minuti a
42°C seguito da incubazione in ghiaccio. Dopo l’aggiunta di 200 µl di terreno LB
senza antibiotico si incubava la miscela per un’ora a 37°C e infine la sospensione
era seminata in piastre Petri contenenti LB-agar addizionato con l’antibiotico di
selezione ed incubata 12 ore a 37°C.
Le ligazioni del vettore psVT28 venivano trasformate per elettroporazione nelle
cellule competeneti PIR1. La preparazione delle cellule elettrocompetenti era
eseguita come segue: i batteri erano fatti crescere in 200 ml di LB. Quando la
coltura raggiungeva un’OD600 di circa 0,5-0,7 era trasferita in ghiaccio per 5
minuti e poi sedimentata per centrifugazione a 6000 rpm per 10 minuti a 4°C. Poi
con risospensione e centrifugazioni successive i batteri venivano lavati 3 volte con
una soluzione fredda di glicerolo 10%. Dopo l’ultimo lavaggio a 6000 rpm per 5
minuti a 4°C erano risospesi in un piccolo volume di glicerolo 10% e le aliquote
erano conservate a -80°C. La trasformazione di plasmidi e ligazioni contenenti il
vettore psVT28 era eseguita aggiungendo 300 ng di DNA ad ogni aliquota di 50
µl di batteri. L’elettroporazione veniva eseguita a 1,25 kV, 3 µF, 200 Ohm in
cuvette da 1 mm (Biotechnologie GmbH). Poi si aggiungevano ai batteri 900 µl di
SOC-Medium pre-riscaldato e la miscela era lasciata per un’ora a 37°C, prima di
essere seminata in piastre di LB-agar addizionate dell’opportuno antibiotico (per
il vettore psVT28 era utilizzata zeocina 30 µg/ml).
3.5.6
Mutagenesi sito specifica
Le mutagenesi sito specifiche sono state ottenute utilizzando il kit QuickChange II
Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) ed i primer opportunamente disegnati
(Tabella 3.4.2). Il kit prevedeva l’utilizzo della polimerasi ad alta fedeltà
PfuUltra™ per la sintesi del DNA con la mutazione desiderata. I primer, utilizzati
alla concentrazione finale di 0,25 µM, erano complementari ai filamenti opposti
del vettore, contenevano entrambi la mutazione desiderata e avevano un contenuto
in GC superiore al 40% e una temperatura di annealing superiore a 78°C. Ogni
72
____________________________________________________________Materiali
e motodi
ciclo (95°C per 30 secondi, 55°C per 1 minuto e 68°C per 1minuto/Kb di
lunghezza del plasmide) era ripetuto per 16 cicli di amplificazione (se si
desiderava, come nel nostro caso, la mutazione di un singolo residuo
aminoacidico). A questi cicli era aggiunto un ultimo ciclo a 94°C per 1 minuto,
55°C per 1 minuto e 72°C per 10 minuti. Al termine della reazione i campioni
venivano mantenuti 2 minuti in ghiaccio ed in seguito sottoposti a restrizione con
l’enzima DpnI, che digerisce il DNA parentale metilato e il filamento
emimetilato. Il prodotto di mutagenesi era poi utilizzato per la trasformazione di
batteri competenti E.coli DH5α. Le mutagenesi erano controllate per digestione
enzimatica e sequenziamento.
3.5.7
Sequenziamento dei plasmidi e purificazione delle sequenze
Oltre all’analisi mediante restrizione enzimatica, i clonaggi e le mutagenesi sono
stati controllati tramite sequenziamento impiegando il kit “Big Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction” (Applied Biosystem), basato sul metodo di
Sanger modificato (Sanger et al., 1997). Il principio del sequenziamento di
Sanger, o metodo a terminazione di catena, prevede che la PCR venga effettuata
oltre che in presenza di dNTPs anche con ddNTPs coniugati con un fluoroforo
(dideossinucleotidi delle quattro basi azotate, privi del gruppo ossidrilico in
posizione C3). La DNA polimerasi permette la sintesi del filamento
complementare a quello stampo utilizzando i vari nucleotidi (dNTPs e ddNTPs).
Quando viene incorporato casualmente il ddNTP la catena è terminata, perché il
ddNTP non possiede il gruppo ossidrilico al 3’ necessario per la continuazione
della catena. In tal modo si ottengono frammenti di lunghezza diversa che si
differenziano tra di loro anche per una singola base. I frammenti di DNA vengono
separati per elettroforesi su gel capillare ed analizzati da un rivelatore, che
converte la diversa fluorescenza emessa dai cromofori eccitati (corrispondente ai
diversi ddNTPs terminatori) in un picco di colore diverso. Il risultato di un
sequenziamento automatico corrisponde ad un profilo densitometrico di picchi
fluorescenti. Il rilevatore permette di captare le emissioni fluorescenti, che
vengono integrate e rappresentate come picchi di altezza diversa, dove l’area
sottesa a ciascun picco è proporzionale all’intensità d’emissione. La sequenza può
essere così letta nell’elettroforetogramma. La reazione era allestita in un volume
finale di 10 µl, comprendenti il reagente Big Dye, il buffer (Tris-HCl 200 mM pH
73
_______________________________________________________________________________
9.0, MgCl2 5 mM), l’opportuno primer 0,1 µM e 200-500 ng di templato. Per i
vettori pcDNA3.1 e pcDNA3.1/V5-His/TOPO sono stati utilizzati i primer
universali T7 (in senso) e BGH (non senso), mentre per gli altri plasmidi i primer
per il sequenziamento sono stati disegnati opportunamente (Tabella 3.4.4). La
PCR di sequenza veniva condotta in un termociclatore (Mastercycler personal,
Eppendorf) e prevedeva 30 cicli di amplificazione. Dopo uno step iniziale a 95°C
per 5 minuti ogni ciclo era composto da: 95°C per 30 secondi, 50°C per 10
secondi, 60°C per 4 minuti. Prima di essere caricato nel sequenziatore automatico
(ABI PRISMA 3100, Applied Biosystem) il DNA della mix di reazione veniva
precipitato, purificato dai sali e denaturato. La PCR era, pertanto, risospesa in
sodio acetato 3M
pH 5.2 ed etanolo al 96%. Il DNA veniva sedimentato
centrifugando a 13200 rpm per 20 minuti a 4°C, lavato in etanolo al 70%,
risospeso in formammide e, infine, denaturato a 95°C per 5 minuti.
3.5.8
BAC mutagenesi
La mutagenesi basata sul Cromosoma Artificiale Batterico (BAC)-plasmide mini
F, nel quale può essere clonata una porzione di DNA superiore alle 300 Kb, ha
reso possibile la rapida ed efficiente mutagenesi di larghe sequenze in cellule di
E.coli. La Red ricombination è una delle più comuni ed efficienti tecniche di
mutagenesi di lunghe sequenze di DNA, che utilizza marker di selezione
amplificati per PCR. In particolare, il protocollo che abbiamo utilizzato
costuituisce una strategia modificata (Markeless two step Red-mediated
recombination, Tishet et al., 2006), che utilizza il gene per la resistenza alla Kan
fiancheggiato ad un sito di cleavage per l’endonucleasi endogena di E.coli I-SceI
per introdurre la mutazione desiderata nella sequenza target e per una prima
selezione positiva. Nel successivo step il taglio da parte di I-SceI a livello del suo
sito di riconoscimento rimuove la cassetta di selezione e permette la seconda
ricombinazione, che utilizza come substrato le sequenze del gene target introdotte
in duplicato (Figura 3.5.8.1). La ricombinazione è stata effettuata nel ceppo E.coli
GS1783 che contiene un clone del BAC infettivo del ceppo endotelio-tropico
TB40-BAC4. Questo ceppo di E.coli contiene un promotore inducibile che
esprime dopo lo shock termico le proteine Red recombination, necessarie per
entrambi gli step di ricombinazione, ed un promotore arabinosio(Ara)-inducibile
74
____________________________________________________________Materiali
e motodi
per l’espressione di I-SceI, enzima necessario per il taglio proteolitico prima della
seconda ricombinazione.
I primer utilizzati per le due mutagenesi e per la delezione del gene UL55 sono
riportati in tabella 3.4.3. I primer sono stati opportunamente costruiti in modo da
contenere a partire dall’estremità 5’ una sequenza omologa al gene UL55 40 nt a
monte del sito di mutazione o delezione e 20 nt a valle. In seguito è stata posta la
sequenza di 25 o 22 nt omologa al plasmide pEPkan-S, contenente il gene della
resistenza alla Kan fiancheggiato dal sito di taglio per I-SceI.
Con questi primer sono state effettuate le reazioni di PCR a partire dal templato
pEPkan-S, in modo da ottenere amplificati contenenti la sequenza di interesse con
la mutazione desiderata, il gene per la resistenza alla Kan, il sito di taglio per ISceI e una piccola duplicazione della sequenza di interesse. I batteri E.coli
GS1783 erano lasciati crescere a 32°C fino ad una OD600 di circa 0,5-0,7 e poi resi
elettrocompetenti mediante shock termico in agitazione a 42°C per 20 minuti.
Dopo lo shock la coltura era trasferita in ghiaccio per 20 minuti. In seguito i
batteri venivano sedimentati a 6000 rpm per 10 minuti a 4°C e poi lavati varie
volte con una soluzione fredda di glicerolo 10%. Dopo l’ultimo lavaggio a 6000
rpm per 5 minuti a 4°C i batteri erano risospesi in un piccolo volume di glicerolo
10% e le aliquote erano conservate a -80°C. 100 ng dei prodotti di PCR venivano
elettroporati in 50 µl dei batteri elettro-competenti a 1,25 kV, 25 µF, 200 Ohm,
poi incubati con 900 µl di SOC-Medium pre-riscaldato per un’ora a 32°C e infine
seminati in piastre di LB-agar contenenti CAF e Kan. Dopo 24 ore a 32°C le
colonie erano risospese in terreno liquido e poi il DNA era estratto dai batteri
mediante Mini prep (paragrafo 3.5.1). Il controllo dell’avvenuta integrazione del
prodotto di PCR nel BAC dei batteri, in seguito alla prima Red ricombination, è
stato eseguito mediante PCR con gli opportuni primer (Tabella 3.4.3). I cloni
corretti sono stati sottoposti al secondo step. Venivano, pertanto, fatti crescere in
terreno LB contenente CAF a cui dopo 1-2 ore a 32°C era aggiunto Ara 2% per
indurre l’espressione di I-SceI. Dopo un’ora a 32°C la coltura era sottoposta a
shock termico in agitazione a 42°C per 30 minuti e poi era nuovamente incubata a
42°C per 2-3 ore prima di essere seminata in piastre di LB-agar in presenza di
CAF e Ara 1%. In seguito le colonie cresciute venivano piccate in doppio in
piastre contenenti CAF o CAF/Kan. Solo i cloni CAF resistenti e Kan sensibili,
che cioè hanno rimosso la cassetta della selezione positiva, sono stati controllati
75
_______________________________________________________________________________
mediante PCR con gli stessi primer utilizzati per controllare la prima
ricombinazione. Le PCR dei corrispondenti cloni corretti sono state sottoposte a
sequenziamento per controllare l’inserimento delle mutazioni desiderate, mentre il
DNA bacmidico è stato sottoposto a restrizione enzimatica e gel elettroforesi per
essere confrontato con il BAC parentale. Poi il DNA è stato utilizzato per la
ricostituzione dei virus mediante elettroporazione di cellule MRC5 (paragrafo
3.6.1).
Figura 3.5.8.1 BAC mutagenesi mediante Markeless two step Red-mediated recombination. La
cassetta I-SceI-aphAI è stata amplificata per PCR per aggiungere circa 40 pb di sequenza target
(rosso e azzurro o giallo e verde), in cui è stata inserita la mutazione desiderata (X). Le linee
colorate simboleggiano sequenze identiche, mentre le linee tratteggiate indicano singoli eventi di
ricombinazione omologa. psm, positive selelction marker; X, nuova sequenza; triangolo, sequenza
originaria, S, sito di restrizione per I-SceI (Tishet et al., 2006).
3.6
Tecniche di biologia cellulare
3.6.1
Tecniche di trasfezione
In questo lavoro di tesi sono state utilizzate tre tecniche di trasfezione:
due tecniche si basavano sull’utilizzo di liposomi: il reagente Jet PEJ™
(Celbio) era usato per la valutazione dell’espressione proteica dei costrutti
clonati e per le immunoprecipitazioni (IP) e Lipofectamine™ 2000
(Invitrogen) per gli studi di co-immunoprecipitazione (co-IP). Entrambi
sono stati utilizzati per la trasfezione transiente di cellule 293T e Cos7;
76
____________________________________________________________Materiali
e motodi
il terzo metodo, invece, consisteva nell’elettroporazione ed è stato
utilizzato per le cellule MRC5.
Per quanto riguarda il primo metodo che utilizzava il reagente Jet PEJ™ (Celbio),
il giorno precedente alla trasfezione venivano seminate 6x105 cellule in pozzetti di
10 cm2 (six-well plate, Falcon) in DMEM al 10% di FBS in un volume finale di 2
ml. Dopo 24 ore, raggiunta una confluenza dell'80%, le cellule erano trasfettate
con Jet PEJ™, un reagente a base di polimeri sintetici altamente idrosolubile e
derivato da polietilenimina lineare, che, inglobando il DNA in particelle cariche
positivamente capaci di interagire con proteoglicani anionici alla superficie
cellulare, ne media l’ingresso nella cellula tramite endocitosi. Venivano preparate
due diverse miscele di reazione, la prima contenente 4 µg di DNA in 100 µl di
soluzione NaCl 150 mM; la seconda contenente 6 µl di reagente Jet PEJ disciolto
in 100 µl di NaCl 150 mM. La soluzione di Jet PEJ era aggiunta a quella
contenente il DNA e la miscela unica era incubata a temperatura ambiente per 30
minuti e poi aggiunta alle cellule goccia a goccia. Le cellule trasfettate venivano
incubate a 37°C al 5% CO2 per 48 ore e, successivamente, lisate e utilizzate per
l’analisi dell’espressione proteica in SDS-PAGE.
Per gli esperimenti di co-IP, il giorno precedente alla trasfezione 1,5x106 cellule
293T erano seminate in fiasche aventi superficie di 25 cm2 (T25) in DMEM,
addizionato con il 10% (v/v) di FBS in un volume finale di 5 ml. Dopo 24 ore a
confluenza cellulare del 80% si effettuava il protocollo di trasfezione. Le cellule
erano trasfettate con Lipofectamine™ 2000, complessi liposomici di lipidi
cationici. Al momento della trasfezione venivano preparate due miscele, di cui
una contenente 500 µl di DMEM privo di FBS e 20 µl di reagente
Lipofectamine™, l’altra contenente 500 µl di DMEM privo di FBS ed il DNA
(per una quantità totale di 8 µg). Le due miscele erano poi unite e la miscela unica
era incubata a temperatura ambiente per 20 minuti e poi aggiunta goccia a goccia
al monostrato cellulare. Le cellule venivano incubate a 37°C in CO2 per un
intervallo di tempo adatto al saggio di espressione genica da effettuare.
Per analizzare il pathway di degradazione proteico è stato utilizzato l’inibitore dei
lisosomi bafilomicina A1 alla concentrazione finale di 10 nM (Sigma). Cellule
293T erano trasfettate in doppio con Jet PEJ™ o Lipofectamine™ 2000. 6 ore
dopo la trasfezione nel primo gruppo di cellule veniva aggiunto al terreno DMSO,
77
_______________________________________________________________________________
mentre nel secondo era aggiunto l’inibitore. Le cellule venivano incubate a 37°C
in CO2 per 24 ore prima di effettuare la lisi.
Le cellule MRC5, invece, sono state trasfettate per elettroporazione. Una fiasca da
75 cm2 alla confluenza del 90% era usata per due trasfezioni. Le cellule venivano
lavate due volte con PBS-EDTA, tripsinizzate e risospese in 10 ml di DMEM
10% FCS. Dopo l’aggiunta di 20 ml di PBS erano centrifugate 5 minuti a 1200
rpm a temperatura ambiente, e poi risospese in un adeguato volume di Optimem
senza siero. Per ogni elettroporazione 250 µl della sospensione erano aggiunti al
DNA da trasfettare, diluto in un volume finale di 40 µl di Optimem addizionato
con il 5% (v/v) di FCS, e trasferiti in una cuvetta. Per le trasfezioni con il vettore
inducibile erano usati 5 µg di DNA, mentre per la ricostituzione del virus dal
BAC erano usati 2-3 µg del DNA bacmidico e 1 µg di pCMV71.
L’elettroporazione era effettuata a 260 V, 1050 µF, 335 R in cuvette da 4 mm
(Biotechnologie GmbH). Poi le cellule venivano risospese in terreno completo
pre-riscaldato. La trasfezione con il vettore psVT28 richiedeva che l’espressione
della proteina clonata nel vettore fosse indotta in presenza di doxiciclina 1 µg/ml.
3.6.2
Trasduzione delle cellule HFF
Cellule 293T (3,5x106 per condizione in fiasche di superficie di 75 cm2) erano
seminate in DMEM 10% FCS in un volume finale di 10 ml. Dopo 24 ore veniva
effettuato il normale protocollo di trasfezione usando Lipofectamine™ 2000.
Nella prima miscela contenente 1,5 ml di DMEM privo di siero erano aggiunti 40
µl di Lipofectamine™, nella seconda contenente lo stesso volume di DMEM era
aggiunto il DNA: il vettore oncoretrovirale pMSCV che esprime la proteina di
interesse, il costrutto MLV Gag-Pol, che fornisce il packaging, e il plasmide che
codifica VSV-G, che fornisce l’envelope al provirus pseudotipizzato. I tre costrutti
erano aggiunti in proporzione 5:5:1 per una quantità totale di 24 µg. Si univano
poi le due miscele e la miscela unica era incubata a temperatura ambiente per 20
minuti e poi aggiunta goccia a goccia al monostrato cellulare. Dopo 48 ore dalla
trasfezione i surnatanti delle cellule trasfettate contenenti le particelle virali
ricombinanti venivano raccolti, centrifugati a 5000 rpm 10 minuti e filtrati con un
filtro da 0,45 mm per rimuovere eventuali cellule presenti nel surnatante. Le
particelle virali erano, quindi, concentrate centrifugando il surnatante a 23000 rpm
per un’ora a 4°C in un rotore Beckman SW40.1 e risospendendo il pellet in 500 µl
78
____________________________________________________________Materiali
e motodi
di MEM. Le cellule HFF venivano seminate, il giorno dopo infettate con HMCV e
24 ore dopo trasdotte con il virus raccolto. L’efficienza di trasduzione è stata
controllata mediante analisi citofluorimetrica di cellule HFF trasdotte con il virus
di controllo che esprime la GFP (pMSCV-LTR-GFP).
3.6.3
Infezione delle colture cellulari con HCMV
MCR5 o HFF ad una confluenza del 80-100% venivano incubate 2 ore a 37°C con
HCMV ceppo TB40 utilizzando una m.o.i. da 0,5 a 3 PFU/ml. Durante
l’incubazione era utilizzato il terreno specifico per il tipo cellulare scelto
(rispettivamente DMEM o MEM) privo di siero. Trascorse le 2 ore il terreno era
rimosso e sostituito con terreno completo e le cellule venivano incubate a 37°C
fino ai tempi richiesti dall’esperimento.
3.6.4
Lisi cellulare
Le cellule trasfettate o infettate venivano lisate per effetto osmotico in tamponi
opportuni a seconda del tipo di esperimento. Per valutare l’espressione proteica o
per le IP la lisi era effettuata nel Buffer di lisi RIPA1X (NaCl 150 mM, IGEPAL
CA-63 1%), mentre negli esperimenti di co-IP era usato il tampone più blando
Np40 1X (2,5% IGEPAL CA-63, Tris-HCl pH 7.4 100 mM, NaCl 750 mM),
capace di preservare le eventuali interazioni proteiche. I tamponi di lisi erano
addizionati di una miscela di inibitori delle proteasi 1X (N-p-tosyl-L-lysine
chloromethyl ketone 0,1 mM –tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone 0,1
mM, Roche). Le cellule venivano staccate dalla fiasca, risospese in PBS 1X e
centrifugate a 1100 rpm a 4°C per 5 minuti. Al termine si eliminava il surnatante e
si effettuavano due lavaggi in PBS 1X freddo. Successivamente erano risospese in
un adeguato volume del buffer di lisi addizionato di inibitori delle proteasi ed
erano incubate in ghiaccio per 20 minuti. In seguito venivano centrifugate a 13000
rpm per 20 minuti a 4°C per separare i surnatanti (citoplasma) da nuclei,
membrana plasmatica e compartimenti membranosi della cellula. Terminata la
centrifugazione il surnatante era raccolto e i lisati erano diluiti 1:2 nel tampone di
caricamento Loading Buffer (LB) 2X (Tris-HCl 100 mM pH 6,8, SDS 4%,
glicerolo 20%, blu di bromofenolo 0,2%, DTT 200 mM, β mercaptoetanolo 20%)
ed in seguito bolliti per 10 minuti prima di essere analizzati in SDS-PAGE. Se si
79
_______________________________________________________________________________
desiderava analizzare anche i compartimenti membranosi, il pellet era lisato con
50 µl di LB 2X e risospeso con cicli di vortex e bollitura.
Per IP e co-IP, invece, i lisati erano posti a contatto con le biglie legate
all’anticorpo (Ab) di interesse (vedi paragrafo 3.6.5). Tutti i campioni venivano
analizzati in SDS-PAGE e Immunoblot (paragrafi 3.6.6 e 3.6.7).
3.6.5
Immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione
Per IP e co-IP biglie G-sepharose (GE Healthcare) venivano sottoposte a 3
lavaggi nel tampone di lisi a 1200 rpm, per 2 minuti a 4°C e successivamente
incubate con l’Ab opportuno per 3 ore a temperatura ambiente in agitazione.
Dopo 4 ulteriori lavaggi nel tampone di lisi a 1200 rpm per 2 minuti a 4°C le
biglie erano incubate con i lisati cellulari a 4°C per 2 ore in agitazione. In seguito
a vari lavaggi a 1200 rpm per 2 minuti a 4°C i campioni venivano risospesi in LB
2X e bolliti per 10 minuti prima di essere analizzati in SDS-PAGE.
3.6.6
SDS-gel elettroforesi
Lisati, IP e co-IP erano analizzati in SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate poly
acrylamide gel electrophoresis) (gel ProteaII, Bio-rad). In questo lavoro sono stati
preparati minigel di acrilammide dello spessore di 1,5 mm o gel ProteaII (Bio-rad)
dello spessore di 1 mm come da ricetta:
• Gel di impaccamento al 4,5% (p/v), costituito da 4 ml di Tris-HCl 0,5 M, pH
6.8, 2,4 ml della soluzione acrilammide/bis 37,5:1 al 30% (p/v), 160 µl di SDS
10% (p/v), 20 µl di N, N, N’, N’-tetra-metil-etilenediammina (TEMED), 80 µl
di ammonio persolfato (APS) 10% (p/v) e portato al volume finale di 16,06 ml
con acqua deionizzata;
• Gel di corsa all’8,5 o al 10% (p/v), costituito da 12,5 ml di Tris-HCl 1.5 M,
pH 8.8, 14,2 ml (o 16,6 ml per gel al 10%) della soluzione acrilammide/bisacrilammide 37,5:1 al 30% (p/v), 500 µl di SDS 10% (p/v), 40 µl di TEMED e
200 µl di APS 10% (p/v) e portato al volume finale di 50 ml con acqua
deionizzata.
La migrazione elettroforetica era effettuata con un’intensità di corrente costante
(100 V per 2 ore o 70 V per tutta la notte) in presenza di un tampone di corsa
(3,02 g di Tris, 14,4 g di glicina, 10 ml di SDS 10% (p/v) e acqua distillata per
80
____________________________________________________________Materiali
e motodi
raggiungere il volume di 1 litro, Bio-Rad). Per verificare la dimensione delle
bande era utilizzato il marker Page Ruler™ Prestained Protein ladder (Fermentas)
costituito da una miscela di proteine di peso molecolare noto e compreso tra 10 e
170 KDa.
3.6.7
Immunoblotting
Le proteine separate in gel elettroforesi venivano trasferite elettricamente su di
una membrana di nitrocellulosa (PROTRAN®, PerkinElmer), precedentemente
idratata in acqua deionizzata ed equilibrata in tampone di trasferimento (tampone
di corsa addizionato con metanolo al 20%). Il trasferimento era effettuato a 50V
per 2 ore. Successivamente, per saturare i siti aspecifici, la membrana di
nitrocellulosa era incubata in una soluzione costituita da latte scremato 5% (p/v)
(Biorad), Tween-20 0,1% (v/v) (Sigma) e PBS1X. Le membrane usate per
l’immunoblotting per l’ubiquitina erano autoclavate a 120°C in acqua deionizzata
per 20 minuti per esporre i siti antigenici riconosciuti dal PAb anti-Ubi (Strack et
al., 2000). In seguito la membrana veniva incubata con l’Ab primario specifico
per le proteine oggetto di analisi opportunamente diluito nella soluzione di
saturazione per una notte a 4°C o per 2 ore a temperatura ambiente in agitazione.
Dopo il trattamento con l’Ab primario la membrana era sottoposta a tre lavaggi
con PBS-T [PBS 1X, Tween-20 0,1%(v/v)] e poi incubata per un’ora con l’Ab
secondario anti-IgG di coniglio o anti-IgG di topo HRP, coniugato con l’enzima
perossidasi di rafano (GE Healthcare), diluito 1:5000 in latte scremato 5% (p/v) e
PBS-T. Di seguito sono riportate due tabelle (Tabelle 3.6.8.1 e 3.6.8.2) che
riassumono gli Ab primari e secondari impiegati in questo lavoro e le modalità di
utilizzo. Il caricamento era controllato con un PAb anti-tubulina.
Infine la membrana era immersa in una soluzione di sviluppo utilizzando il kit per
la rilevazione della chemioluminescenza “ECL plus Western Blotting Detection
System” (Amersham Biosciences) e successivamente esposta su lastra fotografica
(Kodak Biomax Mr Film). Il principio della rivelazione con ECL (enhanced
chemiluminescence)
sfrutta
la
reazione
di
chemiluminescenza
prodotta
dall’ossidazione del luminolo da parte della perossidasi in condizioni alcaline,
resa più accentuata dalla presenza di catalizzatori chimici come il fenolo. In
seguito all’ossidazione il luminolo si trova in uno stato eccitato, da cui torna allo
81
_______________________________________________________________________________
stato
fondamentale
tramite
emissione
di
energia
sotto
forma
di
chemiluminescenza, che raggiunge un picco dopo 5-20 minuti.
Il gel di poliacrilamide era colorato con Coomassie Blue (0,05 g di Comassie Blue
(Sigma), 40 ml di Metanolo, 10 ml di Acido Acetico e acqua distillata per
raggiungere il volume di 100 ml) e decolorato con una soluzione di metanolo 40%
e acido acetico glaciale 10%.
3.6.8
Saggi di immunofluorescenza indiretta
Il giorno precedente la trasfezione o l’infezione le cellule venivano seminate su
una piastra da 24 pozzetti (Costar) sul cui fondo erano deposti vetrini portaoggetto
sterili o su piastre da 8 pozzetti Ibidi. Trascorse 24 ore, quando le cellule
risultavano ad una confluenza del 60-80%, si procedeva alla trasfezione
(paragrafo 3.6.1) o all’infezione (paragrafo 3.6.3). Dopo l’opportuno intervallo di
tempo a seconda del tipo di esperimento si procedeva con il saggio di
immunofluorescenza (IF). Le cellule erano lavate in PBS 0,01 mM e in seguito
fissate in paraformaldeide (PFA) al 4% (p/v) (PBS 0,01 M, NaOH a pH 7,2) per
10 minuti a 4°C e e dopo 3 lavaggi in PBS 0,01 mM permeabilizzate con una
soluzione di Triton X-100 0,1% (v/v) in PBS 0,01 mM per 10 minuti a
temperatura ambiente. In seguito venivano seguiti due protocolli diversi per
cellule trasfettate e infettate. Nel caso delle cellule trasfettate dopo 3 lavaggi in
PBS 0,01 mM i vetrini erano incubati in una soluzione di saturazione contenente
FCS 5% in PBS 0,01 mM per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente
le cellule venivano incubate con il primo Ab primario diluito nella stessa
soluzione di bloccaggio per 45 minuti a temperatura ambiente. Dopo 3 lavaggi in
PBS 0,01 mM i vetrini erano incubati con il secondo Ab primario diluito nella
soluzione di saturazione per 45 minuti a temperatura ambiente. Nel caso delle
cellule infettate, invece, veniva utilizzata una soluzione di bloccaggio più forte
contenente siero umano 6% e BSA 1% in PBS. I campioni erano incubati nella
soluzione per 30 minuti ed in seguito con gli Ab primari diluiti nella stessa
soluzione per 45 minuti a temperatura ambiente. I lavaggi degli Ab primari erano
effettuati in una soluzione di lavaggio contenente BSA 1% e Triton X-100 0,1%
in PBS/BSA 1%. In seguito per entrambi i protocolli si procedeva allo stesso
modo incubando le cellule al buio con l’Ab secondario diluito in PBS 0,01 mM
per 45 minuti a temperatura ambiente. Infine dopo altri 3 lavaggi i campioni
82
____________________________________________________________Materiali
e motodi
venivano incubati con una soluzione di DAPI (Diamidinophenylindol; 1 µg/ml)
diluito in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo altri 3 lavaggi in PBS
0,01 mM i vetrini erano coperti con una goccia di soluzione di montaggio (Pro
Long® Gold antifade reagent, Invitrogen) ed analizzati al microscopio a confocale
Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo 63X ad immersione ed apotoma. Le
immagini erano analizzate con il Software Axiovision 4.6.
Di seguito sono riportate due tabelle (Tabelle 3.6.7.1 e 3.6.7.2) che riassumono gli
Ab primari e secondari impiegati in WB e in IF in questo lavoro e le modalità di
utilizzo.
Nome
Anti-tubulina
Anti-γ adaptina
Anti-EEA1
Anti-c-Myc 9E10
Ditta
Sigma
Sigma
BD Bioscence
Santa
Cruz
Biotechnology
Covance
Anti-Flag M2
Sigma
Mouse
Anti-Flag
Sigma
Rabbit
Anti-HA.11
Covance
Mouse
Anti-HA
Anti-Ubi
Sigma
Sigma
Rabbit
Rabbit
Anti-HCMV gB 2F12
Virusys
Mouse
Anti-HSV-1
Dako
Dott.
von
Einem lab
Rabbit
WB
IF
WB
IF
IF
WB
IF
WB
WB
IF
WB
Rabbit
IF
Anti-CD63 H-193
Anti-UL71
Mouse
Mouse
Mouse
Utilizzo
WB
IF
IF
Diluizione
1:5000
1:1000
1:100
Rabbit
IF
1:50
Mouse
1:500
1:500
1:2500
1:200
1:500
1:2000
1:200
1:100
1:500
1:50
1:1000
1:250
Tabella 3.6.7.1 Anticorpi primari utilizzati in WB e IF e loro principali caratteristiche.
Nome
Alexa Fluor® 488 goat antimouse IgG (H+L)
Alexa Fluor® 488 F(ab’)2
Fragment of goat anti-rabbit IgG
Alexa Fluor® 555 F(ab’)2
fragment of goat anti-mouse IgG
(H+L)
Alexa Fluor® 555 F(ab’)2
fragment of goat anti-rabbit IgG
Anti-Mouse HRP-Coniugated
Anti-Rabbit HRP-Coniugated
Ditta
Utilizzo
Diluizione
Invitrogen
Goat
IF
1:1000
Invitrogen
Goat
IF
1:1000
Invitrogen
Goat
IF
1:1000
Invitrogen
Goat
IF
1:1000
Goat
WB
1:5000
Goat
WB
1:5000
GE
Healthcare
GE
Healthcare
Tabella 3.6.7.2 Anticorpi secondari utilizzati in WB e IF e loro principali caratteristiche.
83
______________________________________________________________________Risultati
4
RISULTATI
PREMESSA
Il pathway cellulare dei MVB svolge un ruolo fondamentale nella gemmazione di
numerose famiglie di virus dotati di envelope, non solo ad RNA ma anche a DNA
e tra questi in particolare HSV-1, HHV-6 e HCMV. Nel tentativo di studiare i
meccanismi molecolari e le proteine virali coinvolte nell’utilizzo da parte di questi
virus di questo pathway cellulare abbiamo focalizzato la nostra attenzione sul
ruolo della glicoproteina B (gB). Questa scelta nasce dai risultati ottenuti nel
nostro laboratorio che dimostrano il ruolo della gB di HSV-1 per permettere al
virus di sfruttare il pathway dei MVB durante il proprio ciclo replicativo. La gB di
HSV-1, infatti, localizza a livello dei MVB ed il blocco di questo pathway
comporta un'alterazione della sua maturazione e localizzazione intracellulare. La
capacità di gB di accumularsi a livello delle membrane dei MVB è correlata
all'ubiquitinazione della sua regione C-terminale, mediante interazioni tra residui
di lisina (K63) nell’ubiquitina e residui presenti nella coda citoplasmatica di gB.
Inoltre, la parziale delezione della sua coda citoplasmatica (gB867) comporta una
riduzione dell’ubiquitinazione e del rilascio di progenie virale infettiva (Calistri et
al., 2007). A partire da questi dati e dal momento che questa glicoproteina è una
delle più conservate all’interno della famiglia Herpesviridae, questo progetto è
partito con l’intenzione di analizzare gli omologhi della gB di HSV-1 in PRV
(UL27), HCMV (UL55) e HHV-8 (ORF8), tre virus prototipo rispettivamente di
un α, β e γ herpesvirus, per capire se questi omologhi condividono una funzione
simile per l’ingresso nel pathway dei MVB. Dopo i primi risultati il progetto si è
focalizzato sulla gB di HCMV.
4.1
Ottenimento dei costrutti esprimenti l’omologo della gB di HSV-1 in
HCMV (UL55) in forma wt e in una forma parzialmente tronca a
livello della coda citoplasmatica
La sequenza genica codificante l’omologo della gB di HSV-1 in HCMV è stata
clonata in un vettore d'espressione priva di tag o fusa al C-terminale con gli
epitopi Flag o HA (pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55). Inoltre per mezzo
dell’inserimento di un codone di stop prematuro è stata ottenuta anche la rispettiva
forma tronca fusa in 3’ a Flag o HA contenente una parziale delezione a livello
85
_______________________________________________________________________________
della coda citoplasmatica, omologa alla forma tronca della gB di HSV-1 (gB867),
per verificarne gli effetti in termini di ubiquitinazione e rilascio di progenie virale
infettiva a livello extracellulare (pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55833). I cloni
corretti sono stati trasfettati in cellule 293T, 48 ore dopo le cellule sono state lisate
in opportuno tampone di lisi e l’espressione delle proteine di interesse è stata
rivelata mediante western blotting (WB), utilizzando opportuni anticorpi (Ab).
Abbiamo, pertanto, confermato che, come riportato in letteratura (Wells et al.,
1990) e diversamente da quanto accade nel caso della gB di HSV-1, la gB di
HCMV è prodotta come precursore, che viene processato proteoliticamente ad
opera dell’enzima furina, che agisce a livello di specifici motivi RX(R/L)R,
generando eterodimeri che rimangono legati attraverso ponti disolfuro. Clonaggi e
risultati analoghi sono stati ottenuti anche per le gB di PRV e HHV8 sia in forma
full lenght (pcDNA3.1-UL27 e pcDNA3.1/V5-His/TOPO-ORF8) sia in forma
tronca (pcDNA3.1-UL27882 e pcDNA3.1/V5-His/TOPO-ORF8787). Come già
accennato, tuttavia, abbiamo concentrato la nostra attenzione su UL55 di HCMV.
4.2
UL55 è ubiquitinata in cellule trasfettate ed infettate
Dal momento che uno dei segnali di sorting più importanti per l’entrata delle
proteine nel pathway dei MVB è la loro ubiquitinazione, abbiamo analizzato
l’ubiquitinazione della gB di HCMV. Il saggio è effettuato mediante WB in
seguito ad immunoprecipitazione (IP) specifica.
In particolare, il costrutto esprimente la glicoproteina wt fusa all’epitopo Flag è
stata trasfettata in cellule 293T in presenza (+) o assenza (-) di un plasmide
esprimente l’ubiquitina fusa in 3’ all’epitopo HA (pBJ5-HA Ubi). 48 ore dopo, le
cellule sono state lisate in opportuno buffer di lisi e la gB è stata
immunoprecipitata dai lisati. I risultati ottenuti dimostrano che la gB di HCMV è
altamente ubiquitinata. Inoltre, analizzando il pattern di ubiquitinazione, è
possibile ipotizzare che, diversamente da quanto accade per la gB di HSV-1 che è
mono-ubiquitinata (Calistri et al., 2007), la gB di HCMV sia poli-ubiquitinata
(Figura 4.2.1 B). Essendo noto che nella gB di HSV-1 i residui coinvolti
nell’ubiquitinazione sono localizzati a livello della coda C-terminale, abbiamo
analizzato, in maniera analoga a quanto già descritto per la forma full lenght, il
livello di ubiquitinazione della forma tronca UL55833. I nostri dati dimostrano che
86
______________________________________________________________________Risultati
la parziale delezione a livello della coda citoplasmatica abroga parzialmente ma
non completamente il fenomeno (Figura 4.2.1 B). Tuttavia, l’analisi del livello
intracellulare di gB, effettuato in parallelo alla valutazione dei livelli di
ubiquitinazione, sembra indicare che questa riduzione sia legata alla quantità
significativamente ridotta della forma matura della gB tronca rispetto alla relativa
full-lenght (Figura 4.2.1 A). Quest’ultimo fenomeno potrebbe essere imputato a
difetti di processamento proteolitico o a prematura degradazione della proteina
mutante. Lo stesso esperimento e gli stessi risultati sono stati ottenuti anche per i
due omologhi di gB in PRV e HHV8 (figura non mostrata).
Figura 4.2.1 UL55 è ubiquitinata in cellule trasfettate. (A e B) Elettroforesi e WB delle IP
effettuate dai lisati di cellule 293T trasfettate con i plasmidi pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55
3’Flag o la rispettiva forma parzialmente deleta al C-terminale (pcDNA3.1/V5-HisTOPO-UL55833
3’Flag), insieme ad un costrutto esprimente l’ubiquitina fusa all’epitopo HA (pBJ5-HA Ubi), o al
corrispondente vettore vuoto pBJ5, (HA Ubi + o HA Ubi –). 48 h dopo la trasfezione la
glicoproteina è IP con il MAb M2 anti-Flag. I WB sono sviluppati con il MAb anti-Flag o il PAb
anti-HA, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
Al fine di analizzare la specificità dell’ubiquitinazione di UL55, abbiamo
effettuato lo stesso esperimento impiegando in questo caso un costrutto
esprimente la glicoproteina H di HCMV (UL75). Poiché i corretti folding e
localizzazione di questa glicoproteina necessitano la co-espressione di gL
(UL115), abbiamo innanzitutto clonato entrambe le sequenze codificanti fuse in
frame al 3’ con due diversi epitopi (pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL75 3’Flag e
pcDNA3.1-UL115 3’HA). Abbiamo, quindi, cotrasfettato cellule 293T con
87
_______________________________________________________________________________
entrambi i costrutti in presenza (+) o meno (-) di pBJ5-HA Ubi. 48 ore dopo la
trasfezione i lisati cellulari sono stati immunoprecipitati con l’Ab specifico per
l’epitopo Flag e i campioni sono stati opportunamente analizzati in WB (Figura
4.2.2).
Il risultato mostra che UL75 di HCMV, così come la gH di HSV-1, non è
ubiquitinata in cellule trasfettate (Figura 4.2.2 B e C). Inoltre in questo
esperimento abbiamo confermato l’ubiquitinazione specifica di UL55 anche con
un Ab diretto contro l’ubiquitina (Figura 4.2.2 B).
Figura 4.2.2 UL75 di HCMV (gH) non è ubiquitinata in cellule trasfettate. (A e B)
Elettroforesi e WB delle IP effettuate dai lisati di cellule 293T cotrasfettate con pcDNA3.1/V5His/TOPO-UL55 3’Flag, o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL75 3’Flag/pcDNA3.1-UL115 3’HA, che
esprimono rispettivamente le glicoproteine gH e gL di HCMV. 48 h dopo la trasfezione le
glicoproteine sono state immunoprecipitate con il MAb M2 anti-Flag. Le proteine separate sono
state analizzate in WB con il MAb anti-Flag o il PAb anti-Ubi. (C) Le cellule sono state trasfettate
con gli stessi costrutti insieme a pBJ5-5’HA Ubi o al corrispondente vettore vuoto pBJ5 (HA Ubi
+ o HA Ubi –). 48 h dopo la trasfezione UL55 o UL75/UL115 sono immunoprecipitate con il
MAb M2 anti-Flag. Le IP sono state separate in SDS-PAGE, seguita da WB con il PAb anti-Ubi.
Sulla sinistra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
Al fine di valutare la rilevanza dell’ubiquitinazione di gB nel contesto della
replicazione virale, cellule HFF sono state infettate a m.o.i. 2 con il virus wt. 120
ore dopo l’infezione gB è stata immunoprecipitata utilizzando un Ab specifico. I
campioni sono stati analizzati in WB, impiegando il PAb anti-Ubi (Figura 4.2.3
88
______________________________________________________________________Risultati
B). Con questo esperimento abbiamo dimostrato che UL55 è ubiquitinata anche in
cellule infettate (Figura 4.2.3 B).
Figura 4.2.3 UL55 è ubiquitinata in cellule infettate. (A e B) Elettroforesi e WB delle IP
effettuate dai lisati di cellule HFF infettate con HCMV a m.o.i. 2 (+) o non infettate (–). 120 h
dopo l’infezione la glicoproteina è stata immunoprecipitata dai lisati con il MAb anti-UL55. I WB
sono stati sviluppati con il MAb anti-HA o il PAb anti-Ubi, come indicato. Le frecce indicano le
bande di ubiquitinazione. Sulla sinistra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
4.3
UL55 colocalizza con le membrane dei MVB ed il suo trafficking
intracellulare richiede la corretta biogenesi dei MVB
Poiché, come precedentemente accennato, l’ubiquitinazione rappresenta uno dei
segnali attraverso i quali le proteine sono indirizzate ai MVB, e vista la nostra
esperienza con HSV-1, abbiamo voluto analizzare, attraverso saggi di
immunofluorescenza (IF), se anche UL55 colocalizza con le membrane dei MVB.
A tale scopo, cellule Cos7 sono state trasfettate con il costrutto esprimente UL55
3’HA. 24 ore dopo le cellule sono state fissate con paraformaldeide (PFA) al 4%
(v/v) e permeabilizzate con Triton X-100 0,1%. Come controllo positivo alcuni
campioni sono stati marcati con il PAb (anticorpo policlonale) anti-HA e con il
MAb (anticorpo monoclonale) anti-γ adaptina, marker del TGN, dove è noto dalla
letteratura UL55 subisce le modificazioni post-traduzionali e il processamento
proteolitico (Figura 4.3.1 da A a F). Altri campioni, invece, sono stati incubati con
il MAb anti-HA e con il PAb anti-CD63, marker dei MVB (Figura 4.3.1 da G a
L). Questi ultimi pannelli mostrano che la glicoproteina virale colocalizza in parte
anche con le membrane dei MVB.
89
_______________________________________________________________________________
Figura 4.3.1 UL55 accumula in parte a livello delle membrane dei MVB in cellule trasfettate.
Cellule Cos7 sono state trasfettate con un costrutto esprimente pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55
3’HA. (Da A a F) Come controllo di colocalizzazione 24 h dopo le cellule sono state incubate con
il PAb anti-HA e con il MAb anti-γ adaptina. (Da G a L) I campioni sono stati marcati con il MAb
anti-HA e con il PAb anti-CD63. Successivamente tutti i vetrini sono stati incubati con gli
opportuni Ab secondari. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. Le cellule sono state
analizzate al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo 63X ad immersione
ed apotoma.
Al fine di valutare in maggior dettaglio il coinvolgimento dei MVB nella
maturazione e nel trafficking di UL55 e più in generale, negli esperimenti
successivi, nella maturazione virale, abbiamo valutato gli effetti del blocco del
pathway di biogenesi dei MVB a questo livello. A tale scopo, abbiamo utilizzato
la forma dominante negativa di Vps4, una proteina cellulare, avente un ruolo
essenziale nella biogenesi dei MVB. Questa ATP-asi agisce, infatti, nelle fasi
terminali che portano alla formazione delle vescicole intraluminali caratteristiche
90
______________________________________________________________________Risultati
dei MVB, disassemblando i complessi ESCRT nel sito di invaginazione della
membrana. La forma dominante negativa di Vps4 utilizzata in questo lavoro è
stata ottenuta con l’introduzione della mutazione puntiforme E228Q nella proteina
di fusione Flag Vps4; il risultato è la perdita dell’attività ATPasica necessaria per
il suo funzionamento (Strack et al., 2003). Il blocco dell’intero pathway ottenuto
utilizzando questa forma dominante negativa è unanimamente considerato il test
per eccellenza per valutare se e in che misura i MVB siano coinvolti in un
determinato fenomeno (Strack et al., 2003; Calistri et al., 2007; Crump et al.,
2007; Tandom et al., 2009). Le cellule 293T sono state trasfettate con il costrutto
esprimente UL55 3’Flag o la sua forma tronca UL55833, insieme al vettore vuoto o
ai plasmidi esprimenti 5’Flag Vps4 o 5’Flag Vps4E228Q. 48 ore dopo i lisati e i
pellet cellulari sono stati analizzati in SDS-PAGE e in WB con un MAb diretto
verso l’epitopo Flag (Figura 4.3.2 A e B). Il caricamento della stessa quantità
proteica è stato controllato mediante WB specifico per la proteina cellulare
tubulina (Figura 4.3.2 C).
I risultati mostrano che, in presenza di Vps4E228Q, sia UL55wt sia la sua forma
tronca si accumulano nella cellula, probabilmente a livello di compartimenti
membranosi (Figura 4.3.1). Questo dato avvalora l’ipotesi di un coinvolgimento
dei MVB e la necessità della loro corretta biogenesi per il corretto trafficking di
UL55, similmente a quanto dimostrato per la gB di HSV-1 (Calistri et al., 2007).
Un risultato analogo è stato ottenuto anche con la gB di PRV (UL27).
91
_______________________________________________________________________________
Figura 4.3.2 UL55 e UL55833 si accumulano sia nel citoplasma sia in compartimenti
membranosi in cellule trasfettate con la forma dominante negativa di Vps4. (A e C) Analisi
elettroforetica e WB dei lisati di cellule 293T cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPOUL553’Flag, o pcDNA3.1/V5-HisTOPO-UL55833 3’Flag, insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ55’Flag Vps4, o a pBJ5-5’Flag Vps4E228Q. Le proteine separate in SDS-PAGE sono state analizzate
in WB con il MAb anti-Flag o con il MAb anti-tubulina. (B) Analisi elettroforetica e WB dei pellet
di cellule 293T cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag, o pcDNA3.1/V5HisTOPO-UL55833 3’Flag, e il vettore vuoto pBJ5, o pBJ5-5’Flag Vps4, o pBJ5-5’Flag Vps4E228Q.
L’analisi di WB è stata effettuata con il MAb anti-Flag. Sulla sinistra sono riportati i pesi
molecolari di riferimento.
Successivamente si è valutato in IF se l’espressione di Vps4E228Q avesse effetto
sulla localizzazione intracellulare di gB. A tale scopo, cellule Cos7 sono state
cotrasfettate con il costrutto esprimente UL55wt 3’HA insieme a 5’Flag Vps4E228Q
o al corrispondente vettore vuoto. 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state
fissate e permeabilizzate. In seguito sono state incubate con il PAb anti-HA e con
il MAb contro il Flag (Figura 4.3.3) e analizzate al microscopio confocale.
Nelle cellule esprimenti Vps4E228Q, UL55 si ridistribuisce, accumulandosi a livello
di vescicole intracitoplasmatiche allargate (Figura 4.3.3 da C a H).
92
______________________________________________________________________Risultati
Figura 4.3.3 Localizzazione di gB in presenza del dominante negativo di Vps4 in cellule
trasfettate. Cellule Cos7 sono state cotrasfettate rispettivamente con il vettore vuoto (A e B), o
con il plasmide pBJ5-5’Flag Vps4E228Q (da C a H), insieme al vettore pcDNA3.1/V5-His/TOPOUL55 3’Flag. I campioni dopo fissazione con PFA4% (p/v) e permeabilizzazione con Triton X100 0,1% (v/v) sono stati incubati con il PAb anti-HA e con il MAb anti-Flag e successivamente
con gli oppurtuni Ab secondari. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I campioni sono
stati analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo 63X ad
immersione ed apotoma.
Per valutare la rilevanza biologica dei dati ottenuti è stato valutato l’effetto del
dominante negativo di Vps4 sulla localizzazione di gB anche nel contesto
dell’infezione virale. A tale scopo, cellule MRC5 sono state elettroporate con i
costrutti GFP-Vps4 o GFP Vps4E228Q, espressi nel vettore inducibile psVT28, che
ha mostrato una buona efficienza di trasfezione nei fibroblasti. L’impiego di
vettori inducibili è stato scelto per ottenere l’espressione della proteina dominante
negativa solo quando voluto durante l’infezione virale e per minimizzare gli effetti
tossici della stessa. A tale scopo, 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state
infettate a m.o.i. 1 con il virus wt e il giorno dopo (36 ore prima della fissazione)
le cellule sono state incubate con doxiciclina 1 µg/ml, in modo da permettere
l’espressione di Vps4 o Vps4E228Q. 4 giorni dopo l’infezione (4 d.p.i.) le cellule
sono state fissate, permeabilizzate e incubate con il MAb anti-HA (Figura 4.3.4).
93
_______________________________________________________________________________
I dati permettono innanzitutto di osservare che Vps4 è reclutata a livello dei siti di
assemblaggio virale (AC), mentre Vps4E228Q rimane nella periferia dell’AC
(pannelli D e G). E’ noto che durante l’infezione anche UL55 è reclutata all’AC,
ed in particolare a livello dell’anello dove si accumulano le particelle virali,
marcate dalle proteine virali pp28 e pp150 (Sanchez et al., 2000). Anche i nostri
risultati confermano queste osservazioni (pannelli A e B). Inoltre, è possibile
osservare che, in presenza di Vps4E228Q, ma non di Vps4, UL55 presenta un
difetto di accumulo all’AC e la sua localizzazione appare distribuita nel
citoplasma delle cellule infettate (da F a H).
Figura 4.3.4 Effetto del blocco dei MVB sulla localizzazione di gB in cellule infettate. Cellule
MRC5 sono state elettroporate con il vettore vuoto psVT28 (A e B), o con i costrutti psVT28-GFP
Vps4 (da C a E), o psVT28-GFP Vps4E228Q (da F aH). 24 h dopo la trasfezione le cellule sono
state infettate con HCMV a m.o.i. 1. 24 h dopo sono state incubate con doxiciclina 1 µg/ml e 36 h
dopo fissate e permeabilizzate. Lo staining è stato eseguito con il MAb anti-UL55 2F12 e
successivamente con l’opportuno Ab secondario. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I
campioni sono stati analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo
63X ad immersione ed apotoma.
94
______________________________________________________________________Risultati
4.4
Le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 sono coinvolte
nell’ubiquitinazione e degradazione di UL55 ed interagiscono con la
glicoproteina attraverso il suo motivo PPSY
Con lo scopo di chiarire il ruolo funzionale dell’ubiquitinazione di UL55,
abbiamo osservato la presenza, a livello della sua sequenza aminoacidica, di un
motivo PPSY (AA 810-813), che è sovrapponibile alla sequenza consenso PPxY
che media il legame con proteine caratterizzate da domini WW, quali le ubiquitino
ligasi della famiglia Nedd4 (Strack et al., 2000). Inoltre, significativamente, e
come descritto in dettaglio nell’introduzione (paragrafo 1.9), il dominio PPxY è
una delle tre sequenze ricche in prolina note come L-domain, che mediano il
legame di proteine strutturali virali con fattori cellulari importanti nella biogenesi
e nel funzionamento del pathway dei MVB, come appunto le ubiquitino ligasi
della famiglia Nedd4.
Abbiamo, pertanto, analizzato un possibile coinvolgimento di queste ligasi
nell’ubiquitinazione di UL55. A tale scopo i plasmidi codificanti UL55wt 3’Flag e
5’HA Ubi sono stati trasfettati insieme al vettore vuoto o ai costrutti esprimenti le
ubiquitino ligasi wt o le stesse mutate a livello di una cisteina essenziale per
l’attività enzimatica e presente a livello del sito attivo (C→S) (Strack et al., 2000).
UL55 è stata immunoprecipitata dai lisati cellulari utilizzando un MAb diretto
verso l’epitopo Flag e analizzata in WB impiegando un MAb anti-HA. I rispettivi
lisati sono stati incubati con un MAb anti-Flag
Il pattern di ubiquitinazione mostra che le ubiquitino ligasi di questa famiglia
hanno un ruolo nell’ubiquitinazione di UL55 (Figura 4.4.1 A). Infatti, in presenza
delle forme cataliticamente attive delle ubiquitino ligasi, l’ubiquitinazione di gB
aumenta (Figura 4.4.1 A) e i corrispondenti lisati mostrano che la glicoproteina
viene degradata (Figura 4.4.1 B); al contrario, in presenza delle ubiquitino ligasi
funzionalmente inattive i livelli della glicoproteina non risultano diminuiti (Figura
4.4.1 B).
95
_______________________________________________________________________________
Figura 4.4.1 Le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 sono coinvolte nell’ubiquitinazione e
nella degradazione di UL55. (A) Analisi elettroforetica e WB dei lisati di cellule 293T
cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag e pBJ5 HA-Ubi insieme al vettore vuoto
pBJ5, o a pBJ5-5’Flag AIP4, Nedd4-1, Nedd4-2s or WWP1. Il WB è stato sviluppato per il MAb
anti-HA. (B e C). Cellule 293T sono state cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55
3’Flag insieme a pBJ5, o pBJ5-5’Flag- AIP4, Nedd4-1, Nedd4-2s o WWP1, o agli stessi costrutti
codificanti le ubiquitino ligasi mutate a livello della cisteina catalitica (C→S). I rispettivi lisati
cellulari sono stati analizzati in WB con il MAb anti-Flag o con il MAb anti-tubulina. Sulla destra
sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
A conferma di questa conclusione, mediante saggi di coimmunoprecipitazione
(co-IP), siamo stati in gradi di dimostrare:
i)
che UL55 interagisce con vari membri di questa famiglia di ubiquitino
ligasi (Nedd4-1, Nedd4-2s, AIP4 e WWP1) (Figura 4.4.2 A);
ii)
che il sito di legame è rappresentato proprio dal dominio PPSY (Figura
4.4.2 A).
E’ da notare che nei saggi di co-IP sono state impiegate le forme cataliticamente
inattive delle ubiquitino ligasi al fine di evitare che UL55 fosse degradata e per
stabilizzare l’eventuale interazione.
96
______________________________________________________________________Risultati
Figura 4.4.2 UL55 interagisce con membri delle ubiquitino ligasi E3 della famiglia Nedd4
attraverso il suo motivo PPSY. (A e B) Cellule 293T sono state cotrasfettate con pcDNA3.1/V5His/TOPO-UL55 3’HA, o la forma mutata di UL55 a livello del motivo PPSY (pcDNA3.1/V5His/TOPO-UL55PPSA 3’HA) insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-5’Flag AIP4C830S, Nedd41C867S, Nedd4-2sC801S o WWP1C886S. I campioni sono stati immunoprecipitati con il MAb M2 antiFlag e analizzati in WB con il MAb anti-HA o il MAb anti-Flag, come indicato. Sulla destra sono
riportati i pesi molecolari di riferimento.
Ad ulteriore conferma del fatto che il dominio PPxY è fondamentale per il legame
tra UL55 e le ubiquitino ligasi, abbiamo verificato che l’interazione tre le due
proteine viene mantenuta anche nel caso in cui la gB sia privata di una porzione
della coda citoplasmatica (UL55833). Il risultato era atteso in quanto UL55833
contiene ancora il dominio PPSY (Figura 4.4.3 A).
97
_______________________________________________________________________________
Figura 4.4.3 UL55833 continua ad interagire con le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4. (A
e B) Analisi elettroforetica e WB delle co-IP tra le ubiquitino ligasi Nedd4 e UL55833. Cellule
293T sono state cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55833 3’HA (o pcDNA3.1/V5His/TOPO-UL55 3’HA come controllo di co-IP) insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-5’Flag
AIP4C830S, Nedd4-1C867S, Nedd4-2sC801S o WWP1C886S. Le ubiquitino ligasi sono
state
immunoprecipitate dai lisati cellulari con il MAb anti-Flag e i campioni sono stati analizzati in
WB con il MAb anti-HA o il MAb anti-Flag, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi
molecolari di riferimento.
Infine, coerentemente con quest’ultimo risultato, quando le cellule 293T sono
state trasfettate con UL55PPSA 3’Flag insieme a 5’Flag AIP4 o 5’Flag AIP4C830S e i
lisati analizzati in WB, il mutante UL55PPSA non è risultato degradato dalle
ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 funzionali (Figura 4.4.4).
98
______________________________________________________________________Risultati
Figura 4.4.4 Le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 degradano UL55wt e UL55833, ma non
UL55PPSA. (A e B) Analisi elettroforetica e WB dei lisati di cellule 293T cotrasfettate con
pcDNA3.1/V5-His/TOPO
UL55
3’Flag,
pcDNA3.1/V5-His/TOPO
UL55833
3’Flag
o
pcDNA3.1/V5-His/TOPO UL55PPSA insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-5’Flag AIP4, o a
pBJ5-5’Flag AIP4C830S. L’analisi di WB è stata effettuata con il MAb anti-Flag o il MAb antitubulina. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
4.5
UL55PPSA mostra una differente localizzazione rispetto a UL55wt e
UL55833 in cellule trasfettate
Ad ulteriore conferma di questa conclusione sono i risultati ottenuti dall’analisi
della localizzazione intracellulare delle tre forme di gB. Cellule Cos7 sono state
cotrasfettate con UL55wt, UL55833 o UL55PPSA fuse in 3’ all’epitopo HA. 24 ore
dopo le cellule sono state fissate, permeabilizzate, incubate con il PAb anti-HA ed
analizzate al microscopio confocale (Figura 4.5.1). I pannelli da A a C mostrano
la normale distribuzione di UL55wt a livello della membrana nucleare e in
vescicole discrete a livello citoplasmatico. La localizzazione di UL55833 non
appare significativamente diversa (da D a F). UL55PPSA, invece, sembra
accumulare a livello di vescicole citoplasmatiche ingrossate (da G a I). Lo stesso
risultato è stato ottenuto anche confrontando UL55wt e UL55PPSA prive di tag, a
dimostrazione che l’effetto è attribuibile in modo specifico alla mutazione del
motivo PPSY (figura non mostrata). Una possibile interpretazione dei dati, in
linea con i risultati del WB (Figura 4.4.4), è che, non essendo UL55PPSA degradata
in maniera corretta, si accumuli all’interno della cellula determinando
l’allargamento delle vescicole.
99
_______________________________________________________________________________
Figura 4.5.1 UL55PPSA presenta una localizzazione differente rispetto a UL55wt e UL55833 in
cellule trasfettate. Cellule Cos7 sono state trasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’HA
(da A a C), o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55833 3’HA (da D a F), o pcDNA3.1/V5-His/TOPOUL55PPSA 3’HA (da G a I). 24 h dopo le cellule sono state incubate con il MAb anti-HA e
successivamente con l’opportuno Ab secondario. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I
vetrini sono stati analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo
63X ad immersione ed apotoma.
4.6
UL55PPSA e la forma wt in presenza di Vps4E228Q rilocalizzano a livello
delle membrane degli endosomi precoci
Sulla base dei risultati dei WB in figure 4.4.4 e 4.3.2 che mostrano che sia
UL55PPSA sia UL55wt in presenza di VpsE228Q accumulano e allo scopo di capire la
natura delle vescicole ingossate che abbiamo visto nelle successive analisi di IF
per entrambe le condizioni (Figure 4.5.1 e 4.3.3), abbiamo eseguito dei saggi di
colocalizzazione con noti marker di diversi organelli cellulari. In modo
significativo l’analisi ha mostrato come in entrambe i casi la glicoproteina virale
colocalizza con il marcatore degli endosomi precoci EEA-1 e che, pertanto, le
vescicole ingrossate che abbiamo notato corrispondono ad endosomi precoci (EE)
aberranti (Figura 4.6.1). La colocalizzazione di UL55PPSA con la γ adaptina (TGN)
è, invece, del tutto simile a quella osservata per la forma wt, né vi sono alterazioni
a carico delle membrane del TGN, quindi l’effetto del mutante è specifico per gli
EE (figura non mostrata).
100
______________________________________________________________________Risultati
Figura 4.6.1 Sia UL55PPSA sia UL55wt in presenza di VpsE228Q rilocalizzano in vescicole
endosomiali aberranti. Cellule Cos7 sono state trasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55
3’HA (da A a C), o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55PPSA 3’HA (da D a F), o pcDNA3.1/V5His/TOPO-UL55 3’HA insieme a pBJ5-5’Flag Vps4E228Q (da G a I). 24 h dopo le cellule sono
state incubate con il PAb anti-HA e il Mab anti-EEA-1 e successivamente con l’opportuno Ab
secondario. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I vetrini sono stati analizzati al
microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo 63X ad immersione ed apotoma.
4.7
UL55 segue la via dei MVB/lisosomi
Per confermare che UL55 durante il trafficking intracellulare entra in contatto con
la via dei MVB/lisosomi abbiamo condotto degli esperimenti in presenza di
bafilomicina A1, un inibitore che, prevenendo l’acidificazione degli endosomi,
blocca la maturazione dei lisosomi. I livelli di UL55 (sia il precursore sia la forma
processata) aumentano in presenza dell’inibitore. Inoltre, in maniera più evidente,
in presenza di bafilomicina e di AIP4 si può osservare un parziale rescue dei
livelli di glicoproteina (Figura 4.7.1 A).
Questo risultato evidenzia che i MVB/lisosomi sono coinvolti nella degradazione
di UL55. Normalmente la forma matura della glicoproteina (vale per tutti tre gli
omologhi analizzati) è caratterizzata da due bande di peso molecolare leggermente
diverso. Non abbiamo analizzato la natura delle bande, ma è possibile supporre si
tratti di due forme a diverso grado di glicosilazione, fosforilazione o di
101
_______________________________________________________________________________
ubiquitinazione di gB. In presenza dell’inibitore bafilomicina, invece, si può
osservare la presenza di un’unica banda (Figura 4.7.1 A).
Figura 4.7.1 UL55 è degradata attraverso il pathway MVB/lisosomi. (A e B) Analisi
elettroforetica e WB dei lisati di cellule 293T cotrasfettate in doppio con pcDNA3.1/V5His/TOPO-UL55 3’Flag insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-5’Flag AIP4 o a pBJ5-5’Flag
AIP4C830S. 6 h dopo la trasfezione ad uno dei due gruppi di cellule è stata aggiunta bafilomicina A1
10 nM (A) A 24 h dalla trasfezione i lisati sono stati analizzati con il MAb anti-Flag. (B) Il
caricamento è stato controllato con un PAb anti-tubulina. Sulla destra sono riportati i pesi
molecolari di riferimento.
4.8
Localizzazione dei mutanti di UL55 nel contesto dell’infezione virale
Al fine di analizzare la localizzazione dei tre mutanti di gB anche nel contesto
dell’infezione virale, abbiamo clonato le tre forme della glicoproteina fuse in 3’
all’HA nel vettore inducibile psVT28. Cellule MRC5 sono state elettroporate con
il vettore vuoto o con i costrutti esprimenti gB. 24 ore dopo la trasfezione le
cellule sono state infettate a m.o.i. 3 con il virus wt e 48 ore dopo incubate con
doxiciclina 1 µg/ml, in modo da permettere l’espressione delle gB. 3 giorni dopo
l’infezione (3 d.p.i.) le cellule sono state fissate, permeabilizzate e incubate con il
MAb anti-UL55 o il MAb anti-HA (Fig 4.8.1). L’analisi dei risultati ottenuti
conferma in linea generale quanto osservato in cellule trasfettate, in particolare
per il mutante gBPPSA, che accumula in vescicle aberranti e presenta un difetto di
102
______________________________________________________________________Risultati
accumulo all’AC (da J a M). Per gB833, invece, si osserva in molti campi un
ritardo di accumulo all’AC (da G a I).
Figura 4.8.1 Localizzazione delle tre forme di gB nel contesto dell’infezione virale. Cellule
MRC5 sono state elettroporate con il vettore vuoto psVT28 (da A a C), o con i costrutti psVT28UL55 3’HA (da D a F), o psVT28-UL55833 3’HA (da G a I), o psVT28-UL55PPSA 3’HA (da J a
M). 24 h dopo la trasfezione le cellule sono state infettate con HCMV a m.o.i. 3. 48 h dopo sono
state incubate con doxiciclina 1 µg/ml e 36 h dopo fissate e permeabilizzate. Lo staining è stato
eseguito con il MAb anti-UL55 2F12 o con il MAb anti-HA e con il PAb anti-UL71 e
successivamente con l’opportuno Ab secondario. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I
campioni sono stati analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo
63X ad immersione ed apotoma.
103
_______________________________________________________________________________
4.9
Ruolo delle deubiquitinasi AMSH e UBPY
Essendo gB bersaglio di ubiquitino ligasi ed essendo chiaro il ruolo svolto dai
MVB/lisosomi durante il trafficking della proteina, abbiamo voluto valutare il
ruolo svolto dagli enzimi a funzione de-ubiquitinasica UBPY/USP8 e AMSH, che
cooperano con le proteine della famiglia Nedd4-like a determinare il complesso
equilibrio tra ubiquitinazione/de-ubiquitinazione delle proteine cargo all’interno
del sistema endo-esocitico della cellula (paragrafo 1.9 dell’introduzione).
A tale scopo, la sequenza codificante UBPY è stata clonata nel vettore pcDNA3.1
fusa in frame al 5’ con l’epitopo HA. E’ stata anche inserita, mediante mutagenesi
sito specifica, a livello del sito catalitico dell’enzima la mutazione C786S
(Mizuno et al., 2005; Alwan et al., 2006; Row et al., 2007; Komada, 2008) che lo
inattiva. Analogamente, la sequenza codificante AMSH, già disponibile nel nostro
laboratorio fusa in 5’ all’epitopo HA, è stata mutagenizzata al fine di ottenere la
forma dominante negativa dell’enzima, contenente la mutazione D348A
(Zamborlini et al., 2006). Quest’ultima mutazione mappa a livello del dominio
JAMM e abolisce l’attività isopeptidasica di AMSH, determinando l’accumulo di
ubiquitina a livello endosomiale (paragrafo 1.9 dell’introduzione).
La figura 4.9.1 A mostra che in presenza di entrambe le isopeptidasi
l’ubiquitinazione di gB diminuisce, mentre viene ripristinata in presenza delle due
isopeptidasi cataliticamente inattive. Analizzando i lisati cellulari è possibile
osservare che sovraesprimendo AMSH i livelli di UL55 aumentano (Figura 4.9.1
B). Questo risultato è in accordo con il ruolo proposto in letteratura per AMSH
(Welchman et al., 2005; Clague M. J. and Urbe S. 2006; McCullough et al.,
2008). Infatti, AMSH avrebbe la funzione di deubiquitinare le proteine cargo
prima che queste vengano portate nel lume dell’endosoma durante la formazione
dei MVB, promuovendo, così, il loro reciclo verso la membrana plasmatica.
Inoltre, l’accumulo di gB appare ancora più marcato in presenza della mutazione
puntiforme D348A (Figura 4.9.1 B), anche questo in accordo con i dati in
letteratura che indicano come la forma dominante negativa AMSHD348A amplifica
l’effetto della proteina wt (Zamborlini et al., 2006). L’espressione di UBPY,
invece, determina la diminuzione dei livelli di UL55, coerentemente al ruolo
proposto per questa deubiquitinasi di rimuovere l’ubiquitina dalle proteine target
appena prima della loro entrata e degradazione attraverso le ILV (Welchman et
104
______________________________________________________________________Risultati
al., 2005; Clague M. J. and Urbe S. 2006; McCullough et al., 2008). Al contrario,
come atteso, UBPYC786S determina l’accumulo della glicoproteina (Figura 4.9.1
B).
Figura 4.9.1 AMSH e UBPY deubiquitinano UL55. (A e B) Analisi elettroforetica e WB delle
IP e dei lisati di cellule 293T cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag e pBJ55’HA Ubi insieme al vettore vuoto pcDNA3.1, o a pcDNA3.1-5’HA AMSH, o pcDNA3.1-5’HA
AMSHD348A, o pcDNA3.1-5’HA UBPY, o pcDNA3.1-5’HA UBPYC786S. UL55 è stata
immunoprecipitata con il MAb anti-Flag e il WB è stato sviluppato per il MAb anti-HA. I
rispettivi lisati cellulari sono stati analizzati con il MAb anti-Flag. Sulla destra sono riportati i pesi
molecolari di riferimento.
4.10
UL55, ma non UL55833, interagisce con Tsg101
Essendo UL55 altamente ubiquitinata abbiamo cercato di approfondire i
meccanismi che ne possano determinare il reclutamento ai MVB, analizzandone
l’interazione con varie proteine di sorting che legano e reclutano proteine
ubiquitinate (Puertollano and Bonifacino, 2004). Abbiamo innanzitutto escluso
mediante co-IP l’interazione di UL55 con Hrs (Figura 4.10.1 A e B), GGA1
(Figura 4.10.1 C e D) e le proteine Tom1 e Tom1L1 (Figura 4.10.1 E e F).
105
_______________________________________________________________________________
Figura 4.10.1 UL55 non interagisce con Hrs, GGA1 o le proteine Tom (A e B) Cellule 293T
sono state cotrasfettate con i pBJ5-5’HA Hrs e pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag. I
campioni sono stati immunoprecipitati con il MAb M2 anti-Flag e analizzati con il MAb anti-HA
o il MAb anti-Flag. (C e D) Cellule 293T sono state cotrasfettate con il plasmide pCR3.1-5’myc
GGA1 insieme al vettore vuoto pcDNA 3.1, o a pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag, o a
pBJ5-5’Flag Nedd4-1, come controllo positivo di co-IP. I campioni sono stati immunoprecipitati
con il MAb M2 anti-Flag e analizzati con il MAb anti-myc o il MAb anti-Flag. (E e F) Cellule
293T sono state cotrasfettate con i plasmidi pcDNA3HFN-5’Flag Tom1, o pcDNA3HFN-5’Flag
Tom1L1, o con il vettore vuoto pcDNA3.1, insieme a pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’HA. I
lisati sono stati immunoprecipitati con il MAb M2 anti-Flag e il WB è stato sviluppato con il MAb
anti-HA o il MAb anti-Flag. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
A questo punto abbiamo spostato la nostra attenzione su proteine appartenenti al
complesso ESCRT-I, che intervengono nel pathway più a valle rispetto alle
proteine cellulari precedentemente analizzate. In particolare, abbiamo ipotizzato
che UL55 potesse essere reclutata da una proteina con un ruolo essenziale e
precoce nel pathway dei MVB e quindi abbiamo focalizzato la nostra attenzione
su Tsg101. È noto che le proteine che interagicono con tale componente del
complesso ESCRT-I contengono un L-domain di tipo P(T/S)AP. Nonostante
UL55 non contenga nella sua struttura primaria una sequenza consenso
sovrapponibile a tale motivo, abbiamo verificato mediante co-IP che UL55
interagisce con Tsg101 (Figura 4.10.2 A). Per dimostrare la specificità
dell’interazione e il fatto che Tsg101 non interagisce con tutte le proteine
ubiquitinate abbiamo dimostrato che non co-immunoprecipita né con la gB di
HSV-1 né con UL27 (gB di PRV) (Figura 4.10.2 A).
106
______________________________________________________________________Risultati
Figura 4.10.2 UL55, ma non la gB di HSV-1 né UL27 di PRV, interagisce con Tsg101. (A, B,
C) Analisi elettroforetica e WB delle CO-IP tra UL55, la gB di HSV-1 e UL27 con Tsg101.
Cellule 293T sono state cotrasfettate con il vettore vuoto pcDNA 3.1, o con pcDNA3.1/V5His/TOPO-UL55 3’Flag, o con pgBwtMTS-HSV-1 gB, o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL27
3’Flag, insieme a pBJ5-5’HA Tsg101. (A e B) UL55 e UL27 sono state immunoprecipitate dai
lisati cellulari con il MAb anti-Flag. (A e C) La gB di HSV-1 è stata immunoprecipitata con il PAb
anti-HSV-1. I campioni sono stati analizzati in WB con il MAb anti-HA, il MAb anti-Flag o il
PAb anti-HSV-1, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
Allo scopo di mappare il sito di legame di UL55 con Tsg101 abbiamo ripetuto il
saggio di co-IP usando UL55833 3’Flag (e UL55 3’Flag come controllo positivo di
co-IP). In questo modo siamo stati in grado di dimostrare che l’interazione non è
mantenuta per la forma tronca di UL55 e che, pertanto, il dominio responsabile
dell’interazione è contenuto a livello della coda citoplasmatica entro gli ultimi 73
aminoacidi della glicoproteina (Figura 4.10.3 A).
107
_______________________________________________________________________________
Figura 4.10.3 UL55833 non interagisce con Tsg101. (A e B) Analisi elettroforetica e WB delle
co-IP tra UL55833 e Tsg101. Cellule 293T sono state cotrasfettate con il vettore vuoto pcDNA 3.1,
o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55833 3’Flag (o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO UL55 3’Flag
come controllo positivo di co-IP) insieme a pBJ5-5’HA Tsg101. UL55 è stata immunoprecipitata
dai lisati cellulari con il MAb anti-Flag e i campioni sono stati analizzati in WB con il MAb antiHA o il MAb anti-Flag, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
Poiché UL55 non contiene un dominio P(S/T)AP, abbiamo formulato alcune
ipotesi di meccanismo per questa interazione, che abbiamo in parte analizzato
sperimentalmente:
•
Interazione indiretta mediata dalle ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4.
•
Interazione indiretta attraverso l’ubiquitina.
•
Interazione diretta attraverso una sequenza non convenzionale analoga
funzionalmente a P(T/S)AP.
Per quanto riguarda il primo meccanismo è noto che le proteine del complesso
ESCRT-I vengono ubiquitinate dalle ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4
(Chung et al., 2008). Inoltre, è stato dimostrato che una ubiquitino ligasi aviaria
con il 93% di omologia a Nedd4-2s (HA-LDI-1) associa con Tsg101 (Medina et
al., 2005). Abbiamo, quindi, analizzato mediante co-IP se Tsg101 è in grado di
interagire con le isoforme umane delle ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4. I
nostri dati dimostrano che questo è in effetti il caso (Figura 4.10.4 A). Tuttavia,
abbiamo dimostrato che il mutante di UL55 che non interagisce più con le
ubiquitino ligasi Nedd4 (UL55PPSA) continua ad interagire con Tsg101 (Figura
4.10.4 C).
108
______________________________________________________________________Risultati
Figura 4.10.4 L’interazione tra UL55 e Tsg101 non è mediata dalle ubiquitino ligasi della
famiglia Nedd4. (A e B) Cellule 293T sono state trasfettate con pBJ5, o pBJ5-5’Flag AIP4C830S,
Nedd4-1C867S, Nedd4-2sC801S o WWP1C886S, insieme a pBJ5-5’HA Tsg101. I campioni sono stati
immunoprecipitatati con il MAb M2 anti-Flag e analizzati in WB con il MAb anti-HA o il MAb
anti-Flag, come indicato. (C e D) Cellule 293T sono state trasfettate con pcDNA3.1/V5His/TOPO-UL55 3’Flag, o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55PPSA 3’Flag, insieme a pBJ5-5’HA
Tsg101. La glicoproteina è stata immunoprecipitata con il MAb M2 anti-Flag e il WB è stato
sviluppato con il MAb anti-HA o il MAb anti-Flag.
Per analizzare gli altri due meccanismi proposti, abbiamo mutagenizzato due siti
del dominio N-terminale UEV (ubiquitin E2 variant) di Tsg101, responsabili con
maggiore affinità, come riportato nel lavoro Pornillos et al., 2003, delle
interazioni con l’ubiquitina (residuo N45) e con il L-domain PTAP contenuto nel
dominio p6 di Gag di HIV-1 (residuo M95). Il nostro risultato, riportato in figura
4.10.5 A, mostra che i due mutanti Tsg101N45A e Tsg101M95A continuano ad
interagire con la glicoproteina virale, per cui, verosimilmente, l’interazione tra le
due proteine non è mediata né dall’ubiquitina, né, in prima approssimazione, dal
legame con motivi analoghi a P(T/S)AP. Tuttavia, quest’ultimo aspetto non può
essere escluso completamente e stiamo attualmente saggiando altri mutanti a
livello di regioni ricche in prolina che potrebbero mimare il P(T/S)AP. Resta,
inoltre, da testare l’effetto della combinazione di entrambe le mutazioni sul
legame tra UL55 e Tsg101.
109
_______________________________________________________________________________
Figura 4.10.5 L’interazione tra UL55 e Tsg101 non è mediata né dall’ubiquitina né dal
motivo P(T/S)AP. (A e B) Analisi elettroforetica e WB delle co-IP tra UL55 e i due mutanti di
Tsg101 Tsg101N45A e Tsg101M95A. Cellule 293T sono state cotrasfettate con il vettore vuoto
pcDNA 3.1, o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag, insieme a pBJ5-5’HA Tsg101 (come
controllo positivo di co-IP), o a pBJ5-5’HA Tsg101N45A, o a pBJ5-5’HA Tsg101M95A. UL55 è stata
immunoprecipitata dai lisati cellulari con il MAb anti-Flag. Le IP sono state analizzate in WB con
il MAb anti-HA e il MAb anti-Flag, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di
riferimento.
Analogamente, per mappare il sito di legame tra le due proteine anche in Tsg101,
abbiamo costruito varie forme delete della proteina basate sulla sua
organizzazione strutturale (Figura 1.9.2 dell’introduzione) e sull’espressione di
forme tronche già riportate in letteratura (Demirov et al., 2001; Bouamr et al.,
2006; Johnson et al., 2004). La figura 4.10.6 mostra l’elenco delle forme tronche
di Tsg101 (insieme ai due mutanti nell’UEV Tsg101N45A e Tsg101M95A), clonate
tutte nel vettore pBJ5 fuse al N-termine all’epitopo HA.
Figura 4.10.6 Forme tronche e mutanti della proteina dei MVB Tsg101. I costrutti sono stati
clonati nel vettore pBJ5 fusi al N-termine all’epitopo HA.
110
______________________________________________________________________Risultati
La corretta espressione di tutte queste forme mutate è stata verificata nei lisati di
cellule 293T trasfettate con questi costrutti, sviluppando un WB contro l’HA
(figura non mostrata).
L’analisi di co-IP ha rivelato come il dominio responsabile dell’interazione con
UL55 sia il dominio UEV, compreso nei primi 145 aminoacidi della proteina. La
figura 4.10.7 A mostra, infatti, che la co-IP con UL55 è mantenuta solo per i
costrutti di Tsg101 che contengono il dominio UEV 5’HA Tsg1011-145 e 5’HA
Tsg1011-215 (che contiene il dominio UEV e quello PRO). Non è osservata,
invece, co-IP con UL55 per le forme tronche che non contengono l’UEV 5’HA
Tsg101215-390 (che codifica i domini CC e S-Box, incluso il motivo PTAP) e 5’HA
Tsg101146-390 (che contiene i motivi PRO, CC e S-Box).
Figura 4.10.7 L’interazione tra UL55 e Tsg101 è mediata dal dominio UEV di Tsg101. (A e
B) Analisi elettroforetica e WB delle co-IP tra UL55 e le forme tronche di Tsg101. Cellule 293T
sono state cotrasfettate con il vettore vuoto pcDNA 3.1, o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO UL55
3’Flag, insieme a pBJ5-5’HA Tsg1011-145, o a pBJ5-5’HA Tsg1011-215, o a pBJ5 5’HA Tsg101215390,
o a pBJ5-5’HA Tsg101146-390. UL55 è stata immunoprecipitata dai lisati cellulari con il MAb
anti-Flag. Le IP sono state analizzate in WB con il MAb anti-HA e il MAb anti-Flag, come
indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.
4.11
La proteina dei MVB Tsg101 è reclutata all’assembly compartment
Al fine di valutare se altre proteine appartententi al pathway dei MVB oltre a
Vps4 sono reclutate all’assemby compartment (AC) durante l’infezione da HCMV
e dal momento che gB interagisce con Tsg101, abbiamo utilizzato un vettore
oncoretrovirale che esprime Tsg101 fusa al N-termine al Flag (pMSCV-5’Flag
111
_______________________________________________________________________________
Tsg101), già disponibile nel nostro laboratorio, per trasdurre cellule HFF. Infatti
queste cellule non sono facilmente trasfettabili e la trasduzione con vettori virali
rappresenta una buona alternativa. Il retrovirus ricombinante viene prodotto
trasfettando in cellule 293T il vettore oncoretrovirale esprimente la proteina di
interesse, pMSCV-5’Flag Tsg101, contemporaneamente ai costrutti MLV GagPol, che fornisce le proteine strutturali ed enzimatiche necessarie alla formazione
della particelle retrovirali, e VSV-G, che fornisce alle particelle l’envelope del
virus della stomatite vescicolare, dotato di ampio tropismo. Dopo 48 ore dalla
trasfezione i surnatanti delle cellule trasfettate sono centrifugati a 23000 rpm per
un’ora e il pellet è risospeso in 500 µl di MEM, in modo da concentrare il virus in
questo piccolo volume, che viene utilizzato per trasdurre le cellule HFF.
L’efficienza di trasduzione è stata controllata mediante analisi citofluorimetrica di
cellule HFF trasdotte con il virus di controllo che esprime la GFP (trasfettando
pMSCV-LTR GFP al posto di pMSCV-5’Flag Tsg101) e infettate 72 ore dopo la
trasduzione. L’analisi effettuata 96 ore dopo l’infezione ha mostrato come il 66%
delle cellule risultino positive per l’espressione della GFP (Figura 4.11.1).
Figura 4.11.1 Analisi citofluorimetrica dell’efficienza di trasduzione di cellule HFF con il
vettore oncoretrovirale pMSCV-LTR GFP. Cellule HFF sono state trasdotte con pMSCV-LTR
GFP e 72 h dopo la trasduzione sono state infettate con HCMV a m.o.i. 1. L’analisi al FACS è
stata effettuata 96 h.p.i.
Il giorno dopo la trasduzione le cellule sono state infettate a m.o.i. 1 con il virus
wt e osservate al microscopio confocale 4 giorni dopo l’infezione (4 d.p.i.) in
seguito a fissazione, permeabilizzazione e marcatura. La figura 4.11.2 mostra lo
staining con il PAb anti-Flag per marcare Tsg101 e con il MAb anti-UL55 per
visualizzare la glicoproteina. Il pannelli A e D mostrano che la proteina Tsg101 è
reclutata all’AC ma non colocalizza nell’anello positivo per la gB (C e F). Lo
staining effettuato con il MAb anti-Flag e con il PAb anti-UL71, invece, mostra
112
______________________________________________________________________Risultati
che Tsg101 colocalizza con la proteina del tegumento UL71, che si distribuisce in
tutto l’AC (Figura 4.11.3).
Figura 4.11.2 Tsg101 è reclutato all’AC in cellule infettate ma non colocalizza con gB. Cellule
HFF sono state trasdotte con il vettore pMSCV-5’Flag Tsg101. 24 h dopo la trasduzione le cellule
sono state infettate con HCMV a m.o.i. 1. 96 h dopo sono state fissate e permeabilizzate. Lo
staining è stato eseguito con il PAb anti-Flag e con il MAb anti-UL55 2F12 e successivamente con
gli opportuni Ab secondari. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I campioni sono stati
analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con apotoma.
Figura 4.11.3 Tsg101 colocalizza con UL71 durante l’infezione. Cellule HFF sono state
trasdotte con il vettore pMSCV-5’Flag Tsg101. 24 h dopo la trasduzione le cellule sono state
infettate con HCMV a m.o.i. 1. 96 h dopo sono state fissate e permeabilizzate. Lo staining è stato
eseguito con il MAb M2 anti-Flag e con il PAb anti-UL71 e successivamente con gli opportuni Ab
secondari. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I campioni sono stati analizzati al
microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con apotoma .
113
_______________________________________________________________________________
Questi dati forniscono un’evidenza sperimentale del ruolo svolto da proteine dei
MVB nell’assemblaggio di HCMV. Infatti Tsg101 è chiaramente reclutata a
questo livello. Dall’altro, risulta evidente che, nonostante UL55 interagisca
fisicamente con Tsg101, non localizza con questa proteina cellulare a livello degli
AC, indicando che, con tutta probabilità, la loro interazione avviene prima della
formazione degli AC e forse serve al virus proprio per condurre Tsg101 nel sito di
assemblaggio. Esperimenti condotti con virus caratterizzati da mutazioni a livello
di gB che abrogano l’interazione con Tsg101 o privi di questa glicoproteina
(descritti nel paragrafo 4.12), ci permetteranno di chiarire questo aspetto. Inoltre
resta da analizzare la localizzazione delle ubiquitino ligasi Nedd4 nelle cellule
infettate.
4.12
Costruzione di virus ricombinanti mediante tecnologia BAC
Allo scopo di caratterizzare le interazioni precedentemente descritte tra UL55 e le
proteine ESCRT nel contesto dell’infezione virale e, quindi, capire se tali
interazioni hanno un ruolo nel ciclo replicativo di HCMV e sono importanti per la
localizzazione intracellulare della glicoproteina, abbiamo introdotto le mutazioni
già descritte (UL55PPSA e UL55833) nel genoma virale. Attraverso la tecnica di
mutagenesi basata sul Cromosoma artificiale batterico (BAC) Markeless two step
Red-mediated recombination (Tishet et al., 2006), in collaborazione con il
laboratorio del Prof. Mertens, (Institute of Virology, Uniklinik Ulm, Germany),
sono stati costruiti, a partire dal virus parentale TB40-BAC4, tre virus mutanti:
1.
vUL55PPSA, in cui attraverso una mutazione puntiforme il motivo PPSY
è stato mutato a PPSA.
2.
vUL55833, che per introduzione di un codone di stop in posizione 834
esprime la forma tronca di gB a livello della coda C-terminale.
3.
v∆UL55, che non codifica più la glicoproteina. La delezione inserita
ricopre la sequenza aminoacidica 13-783 per evitare la delezione del
promotore di UL54, come accade, invece, per il virus deleto di UL55 del
lavoro Isaacson and Compton, 2009.
I mutanti sono stati sequenziati ed il DNA bacmidico è stato sottoposto a
restrizione enzimatica per confrontare il pattern di digestione ottenuto per i
mutanti rispetto al virus parentale (Figura 4.12.1). Come previsto, i mutanti
114
______________________________________________________________________Risultati
UL55PPSA e UL55833 presentano un pattern identico a quello del virus wt poiché
l’introduzione della mutazione puntiforme e del codone di stop non alterano siti di
restrizione per i tre enzimi che abbiamo usato, mentre la delezione 13-783 nel
mutante v∆UL55 comporta la distruzione di alcuni siti di restrizione (*),
determinando un pattern di bande differente (Figura 4.12.1).
Figura 4.12.1 Controllo dei mutanti virali ottenuti mediante mutagenesi con il BAC
attraverso digestione enzimatica. Le restrizioni del DNA bacmidico wt e di quello di vUL55PPSA,
vUL55833 e v∆UL55 sono state effettuate rispettivamente con HindIII, EcoRI e EcoRV. Le bande
scomparse nelle lane del mutante v∆UL55, a causa della distruzione di alcuni siti di restrizione,
sono segnate con *. M, marker dei pesi molecolari. A sinistra è riportata la dimensione delle
bande.
Attualmente è in corso la caratterizzazione dei tre mutanti valutando le proprietà
di crescita dei virus ricostituiti ed in futuro ci proponiamo di utilizzarli per saggi
di IF e di microscopia elettronica. La ricostituzione a partire dal DNA bacmidico è
effettuata per elettroporazione di cellule MRC5 (paragrafo 3.6.1). Insieme al DNA
bacmidico è elettroporato anche il plasmide codificante la fosfoproteina del
tegumento pp71 che funziona da transattivatore virale ed incrementa in vitro
l’efficienza di trasfezione. Attraverso il mutante virale v∆UL55 ci proponiamo di
valutare l’effetto della totale mancanza della glicoproteina sul ciclo replicativo di
HCMV. Per poter effettuare i saggi di complementazione con questo mutante
stiamo ricostituendo il virus wt trasfettando cellule MRC5 con il DNA virale
insieme a UL55wt, che abbiamo clonato fusa in 3’all’epitopo HA nel vettore pEF,
privo del promotore forte del HCMV.
115
___________________________________________________________________Discussione
5
DISCUSSIONE
I virus dotati di envelope acquisiscono il pericapside gemmando attraverso
membrane cellulari di varia natura, da quella plasmatica, a quella nucleare, a
quella di organelli citoplasmatici. Un’infezione produttiva richiede che tutti i
componenti che rendono la particella virale infettiva si localizzino in modo
coordinato nel sito della membrana dove avverrà la gemmazione. I virus sono
parassiti intracellulari obbligati e come tali sfruttano diversi pathway cellulari
durante la propria replicazione. Ad esempio è ormai ampiamente dimostrato che i
virus rivestiti di envelope e dotati di genoma ad RNA sono in grado di utilizzare il
pathway di biogenesi dei multivesicular body (MVB) durante le fasi finali del
ciclo replicativo, ed in particolare maturazione e gemmazione (Calistri et al.,
2008). I MVB rappresentano l’organello a livello del quale viene deciso il destino
delle proteine di membrana ovvero la loro degradazione attraverso il lisosoma o il
loro ritorno in membrana dopo l’endocitosi. L’evento chiave è la formazione di
vescicole intraluminali (ILV) che si formano a livello degli endosomi tardivi,
nelle quali vengono incorporate le proteine transmembranarie destinate alla
degradazione. La genesi e la gemmazione delle ILV, un fenomeno
topologicamente identico alla fuoriuscita di particelle virali dalla cellula, richiede
l’intervento di numerose proteine, che normalmente sono presenti nel citoplasma
della cellula e che vengono reclutate ciclicamente in complessi (ESCRT,
endosomal sorting complex required for transport) a livello della membrana
dell’endosoma.
Sono due i meccanismi principali che i virus ad RNA utilizzano per sfuttare i
MVB nelle fasi conclusive del ciclo replicativo: i) il legame diretto delle proteine
strutturali con componenti essenziali per la biogenesi dell’organello, mediato da
corti motivi aminoacidici ricchi in prolina definiti late (L-)domain; ii)
l’ubiquitinazione/de-ubiquitinazione di proteine strutturali (Calistri et al., 2008).
Il coinvolgimento dei MVB nel ciclo replicativo di virus rivestiti di envelope e
dotati di genoma a DNA è ad oggi meno chiaro, forse anche per la maggior
complessità che, in generale, li caratterizza. Dati recenti suggeriscono che anche
virus a DNA, quali gli herpesvirus, potrebbero reclutare le proteine del pathway
dei MVB non solo per facilitare la fase di gemmazione dalla cellula, ma anche
quella di assemblaggio, garantendo la corretta localizzazione intracellulare sia
117
_______________________________________________________________________________
delle proteine dell’envelope sia di quelle del tegumento e di conseguenza, visto il
ruolo fondamentale del tegumento, di quelle capsidiche e dell’envelope (Calistri et
al., 2007; Crump et al, 2007; Lambert et al., 2007; Watanabe et al., 2007 ; Mori et
al., 2007; Tandom et al., 2009).
In particolare, analizzando la sequenza aminoacidica delle proteine del tegumento
e dell’envelope degli herpesvirus sono state identificate sequenze sovrapponibili
alla sequenza consenso dei L-domain dei virus ad RNA. La presenza di tali
sequenze in proteine virali, alcune delle quali essenziali nell’assemblaggio delle
particelle mature, è stata una delle basi di partenza per valutare il coinvolgimento
dei MVB nelle fasi tardive del ciclo replicativo di questi virus. In particolare, in
HCMV sono stati identificati, da noi come da altri gruppi (Fraile-Ramos et al.,
2007) i seguenti motivi: pp150 e UL56, rispettivamante la maggiore proteina del
tegumento essenziale nella maturazione, e una proteina non strutturale coinvolta
nel packaging del DNA virale nel nucleo, contengono la sequenza PTAP (ProThr-Ala-Pro), che costituisce il sito di binding, come già dimostrato in numerosi
lentivirus dei primati (Garrus et al., 2001; Martin-Serrano et al., 2001), per la
proteina Tsg101. gB e la proteina del tegumento UL48 contengono, invece, il
motivo aminoacidico PPxY (Pro-Pro-x-Tyr), presente in oncoretrovirus
(Göttlinger et al., 1991), filovirus (Strack et al., 2000) e arenavirus, che media il
legame con le proteine cellulari appartenenti alla famiglia Nedd4 delle ubiquitinoligasi E3, che, ubiquitinando le proteine target, ne promuovono l’entrata nel
pathway dei MVB.
Nel nostro laboratorio abbiamo recentemente dimostrato che la gB di HSV-1
accumula a livello delle membrane dei MVB e che il corretto traffico
intracellulare della glicoproteina necessita di una corretta biogenesi dei MVB
(Calistri et al., 2007). Significativamente, gB non contiene sequenze
sovrapponibili a quelle di un L-domain, né fino a questo momento sono state
messe in luce sue interazioni con proteine dei complessi ESCRT, ma il segnale
che ne permette l’incorporazione nei MVB è la mono-ubiquitinazione a livello
della coda C-terminale (Calistri et al., 2007).
Partendo da questi risultati, con questo lavoro di tesi abbiamo voluto contribuire
al chiarimento del ruolo dei MVB nel ciclo replicativo degli herpesvirus
focalizzando la nostra attenzione sulla gB di rappresentanti di α-, β- e γ118
___________________________________________________________________Discussione
herpesvirus. Il razionale è fornito dal fatto che questa proteina è una delle più
conservate a livello della famiglia Herpesviridae ed, in particolare, altamente
conservati sono i motivi della coda citoplasmatica (YXXΦ, LL ed un cluster
acido), coinvolti in endocitosi e trafficking intracellulare. Ad eccezione della gB
di HSV-1 e di quella di VZV, gli omologhi in tutti gli altri herpesvirus sono
prodotti come precursori, che vengono processati proteoliticamente dalla
endoproteasi furina, a livello del TGN. In questo modo si generano due subunità
che rimangono legate attraverso ponti disolfuro e la gB viene incorporata in
questa forma nell’envelope del virus maturo (Wells et al., 1990). Non si conosce
il significato funzionale del processamento da parte della furina, anche perché
questo evento non sembra essenziale nè per l’inglobamento delle gB nel virione
né per l’infettività virale (Brücher et al., 1990).
La nostra attenzione si è focalizzata, in particolare, su UL55, la gB di HCMV, in
quanto, a differenza della gB di HSV-1, è caratterizzata dalla presenza di una
sequenza PPSY che si sovrappone perfettamente a L-domain di tipo PPxY. I
nostri esperimenti hanno dimostrato che questo corto motivo aminoacidico anche
nel contesto della gB di HCMV, come già dimostrato per altre proteine virali
(Strack et al., 2000), costituisce il sito di interazione con le ubiquitino ligasi E3
della famiglia Nedd4 (Figura 4.4.2). Non solo gB interagisce con queste proteine
virali, ma viene anche da queste ubiquitinata in maniera specifica (Figura 4.4.1).
Mutanti a livello di PPSY (UL55PPSA) non interagiscono più con le ubiquitino
ligasi (Figura 4.4.2), mentre il mutante della proteina parzialmente privo della
coda citoplasmatica (UL55833), ma contenente ancora il motivo aminoacidico,
continua ad interagire (Figura 4.4.3). Questi risultati suggeriscono l’interazione
diretta e funzionalmente rilevante tra una proteina di un virus con genoma a DNA
e una proteina coinvolta nella biogenesi dei MVB. Recentemente, è stato riportato
in lettaratura che anche UL56, una proteina di membrana di tipo II di HSV-2, di
non chiara funzione ma che è stato predetto essere incorporata nell’envelope
virale, interagisce sia in trasfezione sia in infezione con i membri della famiglia
Nedd4, tramite tre motivi PPxY (Ushijima et al., 2008; 2009). Il comportamento
di UL56 è, però, diverso da quello di UL55, poiché la proteina di HSV-2 non è un
substrato di ubiquitinazione da parte delle ubiquitino ligasi. Inoltre, non è stato
chiarito il contributo dell’interazione tra UL56 e le ubiquitino ligasi Nedd4 nel
contesto della replicazione virale, in particolare nelle fasi tardive. Nel nostro caso,
119
_______________________________________________________________________________
invece, è chiaro che UL55 di HCMV viene ubiquitinata dalle ubiquitino ligasi
Nedd4 (Figura 4.4.1). Questa modificazione post-traduzionale è peculiare per gB
non verificandosi nel caso di altre glicoproteine, quali gH (Figura 4.2.2). Inoltre,
essendo osservata sia in cellule infettate (Figura 4.2.3) sia in cellule trasfettate,
può essere considerata una proprietà intrinseca della glicoproteina. Basandoci
anche sui dati relativi alla gB di HSV-1, abbiamo voluto analizzare se
l’ubiquitinazione di UL55 avesse un ruolo nell’indirizzamento della proteina ai
MVB. I nostri risultati mostrano che UL55 colocalizza in cellule trasfettate con il
marcatore dei lisosomi tardivi CD63 (Figura 4.3.1).
Come già accennato, il test per eccellenza per valutare il coinvolgimento dei MVB
in specifici fenomeni, quali l’assemblaggio e la gemmazione virali consiste
nell’utilizzare forme dominanti negative di proteine chiave nella biogenesi di
questo organelli ed in particolare Vps4E228Q, l’ATPasi che media il rilascio dei
componenti ESCRT, dopo la gemmazione delle ILV (Strack et al., 2003). Gli
studi eseguiti nel caso dei virus ad RNA hanno chiarito che l’espressione di
Vps4E228Q inibisce il rilascio di HIV-1 e di altri retrovirus, lasciando le particelle
virali immature legate alla superficie esterna della membrana cellulare (Garrus et
al., 2001; Strack et al., 2003). Analogamente, il nostro gruppo di ricerca e il
lavoro di Crump e colleghi hanno chiarito come anche assemblaggio e
gemmazione di HSV-1 sono significativamente ridotti in presenza di Vps4E228Q
(Calistri et al., 2007; Crump et al., 2007). Più recentemente un risultato simile è
stato osservato anche nel caso di HCMV (Tandom et al., 2009), avvalorando
l’ipotesi del coinvolgimento dei MVB nel ciclo replicativo del virus. In questo
lavoro di tesi abbiamo dimostrato che, in presenza di Vps4E228Q, UL55 accumula a
livello intracellulare, probabilmente in compartimenti membranosi (Figura 4.3.2).
Per la gB di HSV-1, in condizioni analoghe, era stato osservato l’accumulo di
forme immature della proteina non completamente glicosilate (Calistri et al.,
2007). Al contrario, nel caso di UL55 non si riscontra un difetto di maturazione e
il processamento proteolitico mediato dalla furina non risulta compromesso.
Accumulano, infatti, nella stessa misura sia il precursore sia la forma processata
(Figura 4.3.2). Saggi di microscopia confocale hanno mostrato che il blocco dei
MVB comporta la rilocalizzazione della gB di HSV-1 in siti che corrispondono in
parte alla distribuzione della calreticulina, una marker endosomiale (Calistri et al.,
2007). I nostri saggi dimostrano che, nelle stesse condizioni, la gB di HCMV si
120
___________________________________________________________________Discussione
accumula a livello di vescicole intracitoplasmatiche ingrossate positive per EEA1, marker degli endosomi precoci (EE) (Figura 4.6.1). Lo stesso fenotipo si
osserva nel caso di UL55 mutante non più in grado di legare le ubiquitino ligasi
della famiglia Nedd4, UL55PPSA (Figura 4.6.1). UL55PPSA continua a colocalizzare
con la γ adaptina (figura non mostrata), coerentemente al fatto che questa forma
matura correttamente a livello del TGN, ma le membrane di questo organello non
risultano modificate dalla sua espressione, quindi l’effetto è specifico per gli EE.
E’ possibile supporre che, sia in presenza di VpsE228Q sia della mutazione di
PPSY, il normale trafficking di UL55 lungo il pathway endocitico fino a
MVB/lisosomi sia compromesso e che la glicoproteina accumuli, pertanto, in
organelli a monte dello stesso pathway come possono essere gli EE. I nostri dati,
nel loro complesso, suggeriscono, quindi la necessità della corretta biogenesi dei
MVB per il corretto trafficking di UL55.
Anche la forma tronca di UL55, UL55833, si accumula in presenza di Vps4E228Q
(figura 4.3.2). In generale, l’analisi dei livelli di UL55833 ci hanno permesso di
osservare un accumulo del precursore, mentre le bande relative alla forma matura
della proteina (~55 KDa) appaiano di intensità significativamente ridotta, rispetto
alla proteina wt (Figura 4.2.1), indicando o un difetto di processamento da parte
della furina o una prematura degradazione della forma matura da parte della
cellula.
La forma tronca della gB di HSV-1 (gB867) è significativamente meno
ubiquitinata della glicoproteina wt, indicando che i residui ubiquitinati sono
contenuti principalmente nella coda citoplasmatica. Inoltre, un mutante virale
contenente la forma deleta di gB determina una drammatica riduzione dei livelli di
progenie virale rilasciata (Calistri et al., 2007). La forma tronca UL55833 presenta
ugualmente un segnale di ubiquitinazione ridotto, ma il dato è inficiato dal fatto
che le forme processate, come detto, sono presenti in quantità molto ridotta
(Figura 4.2.1). Inoltre, il motivo PPSY è mantenuto a livello di questo mutante di
gB. Alcuni lavori riportano che forme tronche di gB a livello della coda ne
compromettono l’endocitosi e ne determinano, pertanto, l’accumulo a livello della
membrana plasmatica (Radsak et al., 1996; Tugizov et al., 1999; Nixdorf et al.,
2001). Più recentemente, però, è stato chiarito che i motivi conservati presenti
della coda sono coinvolti non solo nell’endocitosi ma anche nel trafficking
intracellulare tra endosomi, ERC (endocytic recycling compartment) e lisosomi
121
_______________________________________________________________________________
(Jarvis et al., 2002; Fraile-Ramos et al., 2002 e 2003). gB, infatti, rimane solo
temporaneamente nella membrana cellulare e allo steady state è espressa nella
membrana nucleare e soprattutto a livello del TGN, come confermato anche dai
nostri esperimenti eseguiti utilizzando il marker γ adaptina (Figura 4.3.1). Questo
spiegherebbe perché, sebbene un certo livello di glicoproteine endocitate sia
incorporata nei virioni, il recupero dalla membrana, come è stato dimostrato per
UL55 e UL27, ma anche per la gE del PRV, non sia necessario per la formazione
dei virioni maturi (Jarvis et al., 2002). Le nostre immagini di IF non mostrano
differenze di localizzazione per UL55833 rispetto alla forma wt in cellule trasfettate
(Figura 4.5.1). Tuttavia nel contesto dell’infezione virale gB833 mostra un ritardo
di reclutamento agli AC (Figura 4.8.1), in modo simile a quanto visto da
Krzyzaniak e colleghi nel caso di mutanti di gM di HCMV parzialmente deleti
nella coda citoplasmatica (Krzyzaniak et al., 2007).
Come nelle cellule trasfettate, invece, anche nel contesto dell’infezione virale
gBPPSA accumula a livello di vescicole allargate (Figura 4.8.1)
Il ruolo importante giocato dall’ubiquitinazione nel corretto trafficking di gB, che
le consente di entrare in contatto con i componenti dei MVB, è avvalorato anche
dai risultati da noi ottenuti impiegando i costrutti che esprimono AMSH e UBPY,
due enzimi a funzione de-ubiquitinasica. Le proteine ubiquitinate destinate
all’incorporazione nei MVB subiscono prima della degradazione uno step di
deubiquitinazione. Tra le deubiquitinasi che sembrano avere un ruolo importante
nell’ambito del pathway dei MVB vi sono per l’appunto AMSH e UBPY (Clague
and Urbe S., 2006), anche se in letteratura il loro ruolo rimane controverso. In
alcuni lavori recenti è stato ipotizzato un modello in cui le due deubiquitinasi
sarebbero coinvolte in due differenti eventi e con due ruoli diversi lungo il
pathway dei MVB: AMSH sarebbe coinvolta nella deubiquitinazione delle
proteine destinate al reciclo, mentre UBPY deubiquitinerebbe le proteine cargo
prima della loro incorporazione nei MVB (Welchman et al., 2005; Clague and
Urbe S., 2006; McCullough et al., 2008). In questo lavoro abbiamo dimostrato che
in presenza di AMSH e UBPY il livello di ubiquitinazione di UL55 diminuisce,
mentre la forma dominante negativa AMSHD348A e il mutante UBPYC786S ne
aumentano l’ubiquitinazione. Inoltre AMSH, e in misura ancora più marcata
AMSHD348A,
causano
l’accumulo
intracellulare
di
UL55,
mentre
la
sovraespressione di UBPY ne determina la degradazione, coerentemente al ruolo
122
___________________________________________________________________Discussione
proposto per questa deubiquitinasi di rimuovere l’ubiquitina dalle proteine target
prima della loro entrata e degradazione attraverso le ILV. Al contrario in presenza
di UBPYC786S vi è un rescue della glicoproteina (Figura 4.9.1). Questi risultati
sono, pertanto, coerenti con il modello prevalente in letteratura relativo alla
funzione delle due proteine e ribadiscono ancora una volta che l’ubiquitinazione
di gB mediata dalle ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 indirizza la proteina
virale verso i MVB.
I nostri dati, quindi, supportano l’ipotesi che effettivamente vi sia un legame tra
HCMV e i MVB durante il ciclo replicativo e che gB possa essere uno degli anelli
di congiunzione, come nel caso di HSV-1. Anche in questo caso l’ubiquitinazione
della proteina sarebbe uno dei meccanismi attraverso i quali gB viene direzionata
ai MVB. A questo punto è possibile ipotizzare, vista anche la localizzazione di gB
durante il ciclo replicativo virale, ovvero nei siti di assemblaggio noti come
assembly compartment (AC), già dimostrata in letteratura e da noi confermata
(Sanchez et al., 2000), che diversi componenti dei MVB siano reclutati a questo
livello, proprio grazie ad interazioni con proteine virali. Questa conclusione è
supportata dal lavoro di altri gruppi di ricerca ed in particolare da Fraile-Ramos e
colleghi che hanno dimostrato, attraverso immunogold-labelling e microscopia
elettronica che CD63, un tipico marker dei MVB, è incorporato nell’envelope di
HCMV (Fraile-Ramos et al., 2003), dato confermato anche più recentemente
(Capeda et al., 2009). In quest’ultimo lavoro viene anche dimostrato che il livello
del trascritto e della proteina di CD63 diminuiscono durante l’infezione virale e
che i virioni positivi per CD63 sono infettivi. Questi dati nel complesso
suggeriscono che componenti endosomiali e tra questi le membrane dei MVB si
localizzano nei siti intracellulari in cui il virus si assembla durante l’infezione
(AC). Più significativamente lavori recenti stanno cercando di capire quali
proteine dei complessi ESCRT siano reclutate a questo livello e se siano coinvolte
con ruoli strutturali. In questo contesto, Tandom e colleghi hanno riportato che sia
le forme wt sia quelle dominanti negative di CHMP1 e di Vps4, entrambe proteine
coinvolte nella biogenesi dei MVB, localizzano all’AC durante l’infezione e
colocalizzano con la glicoproteina di HCMV gM. I nostri dati e quelli di altri
gruppi ancora in corso di pubblicazione, confermano il reclutamento di Vps4 ma
non quello della sua forma dominante negativa (Figura 4.3.4). Inoltre, i risultati di
123
_______________________________________________________________________________
Tandom e colleghi sembrano suggerire che il blocco dei MVB, ottenuto tramite
l’espressione della forma dominante negativa Vps4E228Q, non comprometta la
formazione dell’AC. Al contrario, nei nostri esperimenti in queste condizioni gB
rimane dispersa nel citoplasma delle cellule infettate (Figura 4.3.4). Stiamo
attualmente valutando se anche le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4
localizzino all’AC durante l’infezione, magari proprio grazie all’interazione con
gB. Significativamente, invece, i nostri risultati dimostrano chiaramente che
Tsg101 è una delle proteine ESCRT reclutata all’AC (Figure 4.11.2 e 4.11.3).
Abbiamo anche dimostrato che Tsg101 interagisce fisicamente con gB. Tuttavia,
se il suo reclutamento dipenda da questa interazione è tuttora in corso di
valutazione. L’analisi della sequenza aminoacidica di UL55 rivela l’assenza di un
motivo amminoacidico di tipo P(T/S)AP, che tradizionalmente si ritrova nelle
proteine virali e in alcune proteine cellulari che interagiscono con Tsg101.
Abbiamo anche potuto escludere che questa interazione sia mediata indirettamente
dalle ubiquitino ligasi Nedd4, che oltre gB legano anche Tsg101 (Figura 4.10.4).
Inoltre, nessuno degli adattatori molecolari che interagiscono con Tsg101 e che
reclutano cargo ubiquitinati ai MVB da noi testato (Hrs, GGA1 o Tom)
interagisce con UL55 (Figura 4.10.1). Attraverso specifiche mutazioni puntiformi
(N45A e M95A) a livello del dominio ubiquitin E2 variant (UEV) abbiamo anche
valutato la possibilità che il legame sia mediato dall’ubiquitina legata a gB o da
analoghi del motivo P(T/S)AP. I risultati ottenuti sembrerebbero indicare che né
l’ubiquitina né motivi amminoacidici reminiscenti del P(T/S)AP siano coinvolti
nel legame (Figura 4.10.5). Nonostante questo, però, bisogna, sottolineare che i
due residui del UEV da noi mutati sono quelli a più alta affinità ma non gli unici
coinvolti nell’interazione rispettivamente con l’ubiquitina e con il P(T/S)AP
(Pornillos et al., 2003). Inoltre, non possiamo escludere che il legame possa
dipendere da una sequenza ricca in prolina in grado di sostituire il motivo
P(T/S)AP. In questo contesto, la sequenza aminoacidica di UL55, infatti, contiene
entro gli ultimi 73 aminoacidi che abbiamo deleto e responsabili dell’interazione
con Tsg101, un sito ricco in prolina (PPY, residui 837-839), che potrebbe
rappresentare un L-domain non convenzionale, capace di svolgere una funzione
analoga al L-domain canonico P(T/S)AP per il reclutamento di Tsg101. Per
verificarlo abbiamo mutagenizzato questo sito in AAY e AAA e sono attualmente
in corso esperimenti di co-IP con questi due mutanti. In alternativa a questo, altri
124
___________________________________________________________________Discussione
residui potrebbero costituire un nuovo dominio di interazione non ancora
identificato. E’ interessante notare, in questo contesto, che UL55833 non
interagisce più con Tsg101 (Figura 4.10.3), ma l’ubiquitinazione di questo
mutante non è totalmente compromessa e UL55833 continua ad interagire con le
ubiquitino ligasi Nedd4-like, la sua localizzazione in trasfezione non appare
visibilmente diversa da quella della glicoproteina wt e rimane sensibile alla
presenza di Vps4E228Q. Questi risultati farebbe pensare che la parziale delezione
della coda non comprometta l’entrata della forma tronca di gB nel pathway dei
MVB. Questa analisi è coerente col nostro risultato che mostra che il mutante
gBPPSA continua ad interagire con Tsg101 (Figura 4.10.4 C) ed è, inoltre,
supportata dall’osservazione recente, riportata nel lavoro di Tandom e colleghi,
che Tsg101 e le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 agiscano in modo
indipendente e con un meccanismo compensatorio nel mediare l’ingresso di
proteine virali, quali gB, nel pathway dei MVB. Nel lavoro di Tandom e
collaboratori si dimostra che nè il dominante negativo di Tsg101 né il mutante a
livello del PTAP di pp150 (pp150EFAP) influenzano il livello di progenie rilasciata,
suggerendo che HCMV sfrutti il macchinario ESCRT in modo Tsg101
indipendente. Un simile risultato è stato ottenuto utilizzando le forme dominanti
negative di AIP1 e di WWP1. Nel lavoro si dimostra che la distruzione degli
ESCRT coinvolti nel reclutamento delle proteine cargo (attraverso i dominanti
negativi di Tsg101, AIP1 o WWP1) non ha effetto sulla maturazione virale,
mentre la distruzione di proteine ESCRT coinvolte in assemblaggio (CHMP1) o
recycling dei complessi (Vps4) mostrano un marcato effetto. Nel complesso i dati
di letteratura (Hurley and X. Ren., 2009) e i nostri indicano che mentre le proteine
che intervengono precocemente nel pathway di biogenesi dei MVB sembrano
lavorare in parallelo, compensandosi l’una con l’altra, quelle a valle (come Vps4)
lavorano in serie.
E’ chiaro che la rilevanza biologica delle interazioni tra UL55 e ubiquitino
ligasi/Tsg101 potrà essere avvalorata solo da esperimenti condotti in cellule
infettate. A questo scopo sono stati ottenuti attraverso la tecnologia BAC HCMV
ricombinanti caratterizzati dalle mutazioni già descritte a livello di gB, o privi
delle sequenze codificanti la glicoproteina virale. Con questi virus ci proponiamo
di analizzare l’effetto dell’interruzione delle interazioni nel contesto del ciclo
replicativo virale.
125
_______________________________________________________________________________
Dobbiamo dire, tuttavia, che abbiamo già ottenuto dati in infezione a supporto
dell’effettivo ruolo di UL55 nel mediare l’ingresso di HCMV nel pathway dei
MVB. In particolare sono significativi i risultati che dimostrano la localizzazione
agli AC di Tsg101 e la perturbazione dei siti di assemblaggio virale in presenza
del blocco dei MVB o quando UL55 non sia più in grado di interagire con le
ubiquitino ligasi Nedd4. Recentemente Moorman e colleghi hanno mostrato che la
proteina del tegumento pp28 colocalizza con l’ubiquitina e con Hrs e Tsg101 a
livello dell’AC (Moorman et al., 2009). Gli autori approfondiscono l’analisi della
formazione dell’AC, in modo coerente al modello di Pellet (descitto nel paragrafo
1.4 dell’introduzione). Prendendo come riferimento tre proteine di HCMV (pp28,
pp150 e gB), il lavoro dimostra che a stadi precoci di infezione le tre proteine
localizzano distintamente, utilizzando nel trafficking intracellulare vescicole di
natura diversa, mentre man mano che l’infezione procede i loro segnali via via si
sovrappongono fino a convergere nell’AC. Pertanto, questo compartimento
nascerebbe dal contributo di almeno tre o forse più vie di trafficking distinte, che
utilizzerebbero sistemi diversi di trasporto vescicolare quali clatrina o proteine
ESCRT, e gB potrebbe rientrare in quest’ultimo.
In conclusione, l’analisi dei meccanismi molecolari che permettono a HCMV di
sfruttare il pathway dei MVB e la caratterizzazione di UL55 ha portato fino a
questo momento all’ottenimento dei seguenti risultati:
UL55 è ubiquitinata in cellule trasfettate ed infettate
UL55 colocalizza con le membrane dei MVB
il corretto trafficking di UL55 richiede la corretta biogenesi dei MVB
forme funzionali delle ubiquitino ligasi E3 della famiglia Nedd4 sono
coinvolte nell’ubiquitinazione e nella degradazione di UL55 attraverso la
via MVB/lisosomi ed interagiscono con la glicoproteina attraverso il suo
dominio PPSY.
UL55PPSA accumula a livello di endosomi precoci aberranti
le deubiquitinasi AMSH e UBPY rimuovono l’ubiquitina da UL55 per
permetterne, rispettivamante, reciclo o degradazione
UL55wt, ma non la forma parzialmente deleta a livello della coda
citoplasmatica UL55833, interagisce con Tsg101
la proteina Tsg101 è reclutata al AC.
126
___________________________________________________________________Discussione
Attualmente stiamo valutando la rilevanza biologica e funzionale delle interazioni
di gB con le ubiquitino ligasi Nedd4 e con Tsg101 mediante i due virus
ricombinanti vUL55PPSA e vUL55833, ottenuti attraverso la tecnologia del BAC.
Verranno, pertanto, analizzati, mediante titolazione su coltura cellulare e nuove
tecniche di microscopia elettronica, gli effetti di queste mutazioni su
assemblaggio e gemmazione virali. Abbiamo ottenuto, inoltre, anche un virus
ricombinante privo di gB (v∆UL55), che stiamo utilizzando in saggi di
complementazione per analizzare gli effetti della totale assenza di UL55.
Saranno, inoltre, necessarie ulteriori evidenze sperimentali che chiariscano il ruolo
dei MVB nella formazione dell’AC e quali altri proteine ESCRT ne siano
reclutate. Nel caso in cui l’AC si formi anche senza una biogenesi dei MVB
funzionale, rimane comunque da valutare se vi siano delle alterazioni nella sua
formazione e nell’accumulo di proteine del tegumento e dell’envelope. Inoltre,
rimane da chiarire in modo più completo quali siano le modificazioni indotte dal
blocco dei MVB sulla gemmazione virale, per esempio analizzando mediante la
microscopia elettronica se il virus rilasciato acquisisca o meno l’envelope o se e in
che misura sia infettivo.
127
____________________________________________________________________Biblografia
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RINGRAZIAMENTI
Questo lavoro è veramente dedicato a tutte le persone che in questi tre
anni…e molte anche prima…mi sono state vicine e mi hanno aiutata. Senza
tutti voi non ci sarebbe stato tutto questo… Alcune lo hanno letteralmente
visto formarsi insieme a me, passo dopo passo, e tra queste soprattutto Enrico.
Grazie di cuore!
Sono stati tre anni molto intensi grazie ai quali ho iniziato a capire cosa
significa fare scienza, ma soprattutto ho capito quanto mi piace farla!
Per queste ragioni desidero ringraziare il Prof. Palù, per avermi dato la
possibilità di svolgere il mio dottorato presso il Dipartimento di Istologia,
Microbiologia e Biotecnologie Mediche.
Il mio grazie va soprattutto alla Dott.ssa Calistri, che mi ha seguito
costantemente nel mio percorso e che ha creduto in me prima ancora che
cominciassi a farlo io! Grazie per ogni parola e ogni insegnamento.
Grazie alla Prof.ssa Parolin, per il suo sostegno e i suoi incoraggiamenti.
Un ringraziamento va a tutte le persone che ho conosciuto nel
Dipartimento…alcune le desidero ringraziare per il loro aiuto lavorativo, altre
per il loro sostegno morale, altre per le risate e le chiacchere, altre…per tante
altre cose.
Inoltre vorrei ringraziare il Prof. Mertens e il Dott. von Einem per avermi dato
la preziosa possibilità di proseguire il mio progetto nel loro laboratorio e tutte
le persone che ho incontrato e che mi sono state vicine nella mia esperienza a
Ulm.
Un grazie particolare va ai miei genitori., alle nonne e a tutti i parenti per
avermi sempre sostenuto ed incoraggiato e a tutti gli amici vecchi e nuovi!
Grazie di cuore a tutti!
