cromosomi umani

CROMOSOMI UMANI
Tuesday, June 12, 12
GRANDEZZA DEL GENOMA UMANO
•
•
•
•
3,2 miliardi di unità (basi): A, G, C, T
Lunghezza se srotolato: circa due metri
30,0000 - 50,0000 geni
Funzione conosciuta solo per il 5% dei geni
Tuesday, June 12, 12
LE MOLECOLE DI DNA SONO IN GENERE
TROPPO GRANDI PER ESSERE
STUDIATE COSI’ COME SI TROVANO IN
NATURA
• Cromosoma 1 umano
• Una singola molecola di DNA, lunga circa
20 cm che contiene:
• 250 milioni di unità(A, G, C, T)
• Più di 3000 geni
Tuesday, June 12, 12
TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA
Tuesday, June 12, 12
TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA
• SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA (1953)
Tuesday, June 12, 12
TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA
• SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA (1953)
• SCOPERTA DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (1970)
Tuesday, June 12, 12
TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA
• SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA (1953)
• SCOPERTA DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (1970)
• SCOPERTA DI UN METODO PER DETERMINARE
LA SEQUENZA DI DNA (1975)
Tuesday, June 12, 12
TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA
• SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA (1953)
• SCOPERTA DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (1970)
• SCOPERTA DI UN METODO PER DETERMINARE
LA SEQUENZA DI DNA (1975)
• COMPLETAMENTO DEL GENOMA (2001)
Tuesday, June 12, 12
LA RICERCA SCIENTIFICA PUO’
SCOPRIRE APPLICAZIONI PER CASO
Tuesday, June 12, 12
I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER
DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A
DNA ESTRANEO
Batteri A
Tuesday, June 12, 12
I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER
DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A
DNA ESTRANEO
Batteri A
Tuesday, June 12, 12
I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER
DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A
DNA ESTRANEO
λ(A)
Tuesday, June 12, 12
I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER
DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A
DNA ESTRANEO
λ(A)
Batteri B
Tuesday, June 12, 12
I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER
DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A
DNA ESTRANEO
λ(A)
Batteri B
Tuesday, June 12, 12
GAACTGCAATCGCGAATCGAGCTAGAGCATCTAGCTATCAATGTCGTGCT
AGTGTCATTACTGC
...............AATTGATGCTAGCATGCTAGTCAGTACGTGCATGTA
CGTGCATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCAT
CGTACGTCGTCGTGCATGCTGATCGATGCTGCTGCTGCTAGTGATCGCTGA
TGCATGCTGCTAGCTAGCTGCTGCTGCTGTGCATGCTAGTCAGTCAGTCGT
ACGCATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTGACTTAA
!
TGCGTAGATGCTAGTCGATGCTAGCTAGTAGCTAGCTAGCTGCTGATGCTG
CATGCTAGCTAGCTGATAGTCGTAC
.........................AATTGCATGCTAGCTAGCTAACGTGC
ATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCTCGTACG
CATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTG
Tuesday, June 12, 12
GAACTGCAATCGCGAATCGAGCTAGAGCATCTAGCTATCAATGTCGTGCT
AGTGTCATTACTGC
...............AATTGATGCTAGCATGCTAGTCAGTACGTGCATGTA
CGTGCATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCAT
CGTACGTCGTCGTGCATGCTGATCGATGCTGCTGCTGCTAGTGATCGCTGA
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ACGCATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTGACTTAA
!
TGCGTAGATGCTAGTCGATGCTAGCTAGTAGCTAGCTAGCTGCTGATGCTG
CATGCTAGCTAGCTGATAGTCGTAC
.........................AATTGCATGCTAGCTAGCTAACGTGC
ATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCTCGTACG
CATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTG
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GAACTGCAATCGCGAATCGAGCTAGAGCATCTAGCTATCAATGTCGTGCT
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CGTGCATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCAT
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!
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CATGCTAGCTAGCTGATAGTCGTAC
.........................AATTGCATGCTAGCTAGCTAACGTGC
ATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCTCGTACG
CATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTG
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...............AATTGATGCTAGCATGCTAGTCAGTACGTGCATGTA
CGTGCATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCAT
CGTACGTCGTCGTGCATGCTGATCGATGCTGCTGCTGCTAGTGATCGCTGA
TGCATGCTGCTAGCTAGCTGCTGCTGCTGTGCATGCTAGTCAGTCAGTCGT
ACGCATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTGACTTAA
TGCGTAGATGCTAGTCGATGCTAGCTAGTAGCTAGCTAGCTGCTGATGCTG
CATGCTAGCTAGCTGATAGTCGTAC
Tuesday, June 12, 12
ENZIMI DI RESTRIZIONE
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
+ ER
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Clonaggio
molecolare
Tuesday, June 12, 12
CLONAGGIO
MOLECOLARE
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
I Geni eucariotici sono
organizzati in esoni ed introni
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Tuesday, June 12, 12
IL MECCANISMO DELLO SPLICING
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Centinaia di enzimi di restrizione
Gene A
ENZ 1
ENZ 2
ENZ 3
Tuesday, June 12, 12
Centinaia di enzimi di restrizione
Gene A
ENZ 1
ENZ 2
ENZ 3
Tuesday, June 12, 12
Centinaia di enzimi di restrizione
Gene A
ENZ 1
ENZ 2
ENZ 3
Tuesday, June 12, 12
Centinaia di enzimi di restrizione
Gene A
ENZ 1
ENZ 2
ENZ 3
Tuesday, June 12, 12
LA STRUTTURA DI UN GENE
Regione di regolazione
QUANTO
DOVE
QUANDO
COME
Regione codificante
Proteina
Funzione
Tuesday, June 12, 12
Le diverse parti di un gene possono
essere riassortite in provetta
GENE 1
Fegato
GENE 2
Rene
GENE 1/2
Rene
17
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promoter
oncogene
Espressione DIPENDE
DAL PROMOTORE
ESPRESSIONE GENERALIZZATA=CANCRO GENERALIZZATO?
Tuesday, June 12, 12
L'INGEGNERIA GENETICA
Gene umano
Nel pancreas
Gene batterico
Insulina
Molto in
batteri
Proteina X
TAGLIO
CUCI
Proteina X nella ipofisi
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Insulina in batteri
GENI PER PROTEINE BIOLOGICAMENTE ATTIVE
MA DISPONIBILI IN QUANTITA' LIMITATE E/O DA
FONTI CONTENENTI AGENTI PERICOLOSI
TPA
ORMONE DELLA CRESCITA
CSF
INSULINA
FATTORE VIII DELLA COAGULAZIONE
ERITROPIETINA
Tuesday, June 12, 12
ORMONE DELLA CRESCITA UMANO
Prima dell'ingegneria genetica:
-Purificato da ipofisi di cadavere
- Possibilita' di contaminazione con virus
neurotropici (Creutzfeld-Jacob)
Dopo l'ingegneria genetica:
- Ormone della crescita purificato da cellule
produttrici; rischio di contaminazione abolito
Tuesday, June 12, 12
TOSSINA BOTULINICA
Prima dell'ingegneria genetica:
- La tossina e' prodotta in piccole quantita’da un
batterio che cresce con difficolta'
Dopo l'ingegneria genetica:
- La tossina potrebbe essere prodotta in grandi
quantita’ da qualunque batterio
Tuesday, June 12, 12
IL DNA RICOMBINANTE : una rivoluzione
del modo di studiare la genetica
Tuesday, June 12, 12
IL DNA RICOMBINANTE HA
RIVOLUZIONATO LO STUDIO DELLA
GENETICA
GENETICA CLASSICA
UN CARATTERE ( o
FUNZIONE)
UNO O PIU’ GENI
Tuesday, June 12, 12
Mutazioni del topo possono riprodurre il fenotipo di
malattie umane
MUTAGENESI e INCROCIO
Tuesday, June 12, 12
Mutazioni del topo possono riprodurre il fenotipo di
malattie umane
MUTAGENESI e INCROCIO
Tuesday, June 12, 12
Mutazioni del topo possono riprodurre il fenotipo di
malattie umane
MUTAGENESI e INCROCIO
Topo Snell
Tuesday, June 12, 12
Mouse Models for Human Diseases
Hamburger Abendblatt
Tuesday, June 12, 12
IL DNA RICOMBINANTE HA
RIVOLUZIONATO LO STUDIO DELLA
GENETICA
GENETICA INVERSA
UNO O PIU’ GENI
UN CARATTERE
Tuesday, June 12, 12
TRANSGENESI MEDIANTE INIEZIONE
DI DNA
• Il DNA si inserisce a caso
nel genoma.
• La espresssione del gene
iniettato dipende dal sito
di integrazione
• Sono presenti allo stesso
tempo il gene esogeno e
quello endogeno
Tuesday, June 12, 12
Le diverse parti di un gene possono
essere riassortite in provetta
Tuesday, June 12, 12
GENE 1
Virus
GENE 2
Tiroide
GENE 1/2
Tiroide
ORIGINE MULTIGENICA DELLA CRESCITA
NEOPLASTICA
TOPO NORMALE
TOPO TRANSGENICO CHE ESPRIME IN TIROIDE
UN GENE VIRALE
Tuesday, June 12, 12
LIMITI DELLA TRANSGENESI
• Ogni evento di transgenesi è indipendente
–In esperimenti successivi il DNA iniettato può
collocarsi in zone diverse del genoma.
• Si può aggiungere materiale genetico e non
eliminarlo
Tuesday, June 12, 12
TRANSGENESI MEDIANTE
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
Tuesday, June 12, 12
TRANSGENESI MEDIANTE
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
I geni possono essere modificati usando il
macchinario cellulare della ricombinazione
Tuesday, June 12, 12
TRANSGENESI MEDIANTE
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
I geni possono essere modificati usando il
macchinario cellulare della ricombinazione
GENE X
X
Tuesday, June 12, 12
GENE 1
X
TRANSGENESI MEDIANTE
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
I geni possono essere modificati usando il
macchinario cellulare della ricombinazione
GENE X
X
Tuesday, June 12, 12
GENE 1
X
TRANSGENESI MEDIANTE
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
I geni possono essere modificati usando il
macchinario cellulare della ricombinazione
GENE X
X
GENE 1
X
GENE 1GENE X GENE 1
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
KNOCK-OUT
Tuesday, June 12, 12
KNOCK-OUT
GENE 1GENE X GENE 1
Tuesday, June 12, 12
KNOCK-OUT
GENE 1GENE X GENE 1
Il gene X non è un gene attivo; la funzione del
gene 1 è persa
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
KNOCK-IN
Tuesday, June 12, 12
KNOCK-IN
GENE 1GENE X GENE 1
Tuesday, June 12, 12
KNOCK-IN
GENE 1GENE X GENE 1
Il gene X è un gene attivo; il gene 1
viene sostituito dal gene X
Tuesday, June 12, 12
UNA VERA BLASTOCISTI
Tuesday, June 12, 12
UNA VERA BLASTOCISTI
Tuesday, June 12, 12
UNA VERA BLASTOCISTI
Tuesday, June 12, 12
COLTURA IN VITRO DI
CELLULE EMBRIONALI
TOTIPOTENTI (ES)
E’ necessario trovare condizioni
per impedirne il
differenziamento
Tuesday, June 12, 12
Dimostrazione della totipotenza
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
La distruzione di un gene ne rivela la
funzione di parti del gene
Wild type
Knock-out
X
X
Tuesday, June 12, 12
Southern Blot
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
SEQUENZIAMENTO
Tuesday, June 12, 12
Sequencing)costs/)Megabase)
h2ps://www.genome.gov/sequencingcosts/)
Tuesday, June 12, 12
Sequencing)costs/human)sized)
genome)
h3ps://www.genome.gov/sequencingcosts/)
Tuesday, June 12, 12
Evoluzione del sequenziamento del DNA su larga scala
• 
• 
2000: Prima bozza del genoma umano
10 anni; circa 3 miliardi $
!
• 
2008:%%I%maggiori%centri%di%sequenziamento%
o"engono&la&stessa&quan-tà&di&informazione&in&4&
giorni&
• 
• 
• 
Tuesday, June 12, 12
Si%lancia%il%proge9o%dei%1000%genomi%
2009:%Ogni&4&ore($25,000)&
2010:&Ogni&14&minu-($5,000)&
• 
Illumina%HiSeq2000%produce%200%miliardi%di%basi%in%
8%giorni%(BGI%ne%ha%ordinaB%128)%
PAGINA BROWSER
Tuesday, June 12, 12
PAGINA BROWSER
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Ibridazione con oligonucleotidi
Tuesday, June 12, 12
PCR: Polymerase Chain reaction
Tuesday, June 12, 12
PCR
Tuesday, June 12, 12
AMPLIFICAZIONE ALLELE SPECIFICA
Tuesday, June 12, 12
Basics of microarrays
• DNA attached to solid
support
– Glass, plastic, or nylon
• RNA is labeled
– Usually indirectly
• Bound DNA is the probe
– Labeled RNA is the
“target”
Benfey and Protopapas, "Genomics" © 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper
Saddle River, New Jersey 07458
Tuesday, June 12, 12
Slide-based DNA microarrays
In general, slide-based arrays are used to make a direct comparison
between two different RNA samples. These can be a tissue sample
vs. a reference, mutant vs. wild type, treated vs. control, etc. The
microarray provides a readout of the relative differences in
abundance of the RNAs present in each sample.
cell type A
extract
mRNA
cell type B
make
labeled
cDNA
hybridize to
microarray
more in “A”
more in “B”
equal in A & B
Tuesday, June 12, 12
CGH
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12
Tuesday, June 12, 12