cromosomi umani
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CROMOSOMI UMANI Tuesday, June 12, 12 GRANDEZZA DEL GENOMA UMANO • • • • 3,2 miliardi di unità (basi): A, G, C, T Lunghezza se srotolato: circa due metri 30,0000 - 50,0000 geni Funzione conosciuta solo per il 5% dei geni Tuesday, June 12, 12 LE MOLECOLE DI DNA SONO IN GENERE TROPPO GRANDI PER ESSERE STUDIATE COSI’ COME SI TROVANO IN NATURA • Cromosoma 1 umano • Una singola molecola di DNA, lunga circa 20 cm che contiene: • 250 milioni di unità(A, G, C, T) • Più di 3000 geni Tuesday, June 12, 12 TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA Tuesday, June 12, 12 TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA • SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA (1953) Tuesday, June 12, 12 TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA • SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA (1953) • SCOPERTA DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (1970) Tuesday, June 12, 12 TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA • SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA (1953) • SCOPERTA DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (1970) • SCOPERTA DI UN METODO PER DETERMINARE LA SEQUENZA DI DNA (1975) Tuesday, June 12, 12 TAPPE CRUCIALI PER IL GENOMA • SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA (1953) • SCOPERTA DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (1970) • SCOPERTA DI UN METODO PER DETERMINARE LA SEQUENZA DI DNA (1975) • COMPLETAMENTO DEL GENOMA (2001) Tuesday, June 12, 12 LA RICERCA SCIENTIFICA PUO’ SCOPRIRE APPLICAZIONI PER CASO Tuesday, June 12, 12 I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A DNA ESTRANEO Batteri A Tuesday, June 12, 12 I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A DNA ESTRANEO Batteri A Tuesday, June 12, 12 I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A DNA ESTRANEO λ(A) Tuesday, June 12, 12 I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A DNA ESTRANEO λ(A) Batteri B Tuesday, June 12, 12 I BATTERI HANNO UN MECCANISMO PER DIFENDERSI DALLA ESPOSIZIONE A DNA ESTRANEO λ(A) Batteri B Tuesday, June 12, 12 GAACTGCAATCGCGAATCGAGCTAGAGCATCTAGCTATCAATGTCGTGCT AGTGTCATTACTGC ...............AATTGATGCTAGCATGCTAGTCAGTACGTGCATGTA CGTGCATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCAT CGTACGTCGTCGTGCATGCTGATCGATGCTGCTGCTGCTAGTGATCGCTGA TGCATGCTGCTAGCTAGCTGCTGCTGCTGTGCATGCTAGTCAGTCAGTCGT ACGCATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTGACTTAA ! TGCGTAGATGCTAGTCGATGCTAGCTAGTAGCTAGCTAGCTGCTGATGCTG CATGCTAGCTAGCTGATAGTCGTAC .........................AATTGCATGCTAGCTAGCTAACGTGC ATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCTCGTACG CATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTG Tuesday, June 12, 12 GAACTGCAATCGCGAATCGAGCTAGAGCATCTAGCTATCAATGTCGTGCT AGTGTCATTACTGC ...............AATTGATGCTAGCATGCTAGTCAGTACGTGCATGTA CGTGCATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCAT CGTACGTCGTCGTGCATGCTGATCGATGCTGCTGCTGCTAGTGATCGCTGA TGCATGCTGCTAGCTAGCTGCTGCTGCTGTGCATGCTAGTCAGTCAGTCGT ACGCATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTGACTTAA ! TGCGTAGATGCTAGTCGATGCTAGCTAGTAGCTAGCTAGCTGCTGATGCTG CATGCTAGCTAGCTGATAGTCGTAC .........................AATTGCATGCTAGCTAGCTAACGTGC ATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCTCGTACG CATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTG Tuesday, June 12, 12 GAACTGCAATCGCGAATCGAGCTAGAGCATCTAGCTATCAATGTCGTGCT AGTGTCATTACTGC ...............AATTGATGCTAGCATGCTAGTCAGTACGTGCATGTA CGTGCATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCAT CGTACGTCGTCGTGCATGCTGATCGATGCTGCTGCTGCTAGTGATCGCTGA TGCATGCTGCTAGCTAGCTGCTGCTGCTGTGCATGCTAGTCAGTCAGTCGT ACGCATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTGACTTAA ! TGCGTAGATGCTAGTCGATGCTAGCTAGTAGCTAGCTAGCTGCTGATGCTG CATGCTAGCTAGCTGATAGTCGTAC .........................AATTGCATGCTAGCTAGCTAACGTGC ATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCTCGTACG CATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTG Tuesday, June 12, 12 ...............AATTGATGCTAGCATGCTAGTCAGTACGTGCATGTA CGTGCATGCATGTCGACTGCTAGCTAGTCAGTGCACTGATCGTACGTGCAT CGTACGTCGTCGTGCATGCTGATCGATGCTGCTGCTGCTAGTGATCGCTGA TGCATGCTGCTAGCTAGCTGCTGCTGCTGTGCATGCTAGTCAGTCAGTCGT ACGCATGCTGCTGCTAGTAGCTGCTGATGCTGCTAGTACGTAGTGACTTAA TGCGTAGATGCTAGTCGATGCTAGCTAGTAGCTAGCTAGCTGCTGATGCTG CATGCTAGCTAGCTGATAGTCGTAC Tuesday, June 12, 12 ENZIMI DI RESTRIZIONE Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 + ER Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Clonaggio molecolare Tuesday, June 12, 12 CLONAGGIO MOLECOLARE Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 I Geni eucariotici sono organizzati in esoni ed introni Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Tuesday, June 12, 12 IL MECCANISMO DELLO SPLICING Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Centinaia di enzimi di restrizione Gene A ENZ 1 ENZ 2 ENZ 3 Tuesday, June 12, 12 Centinaia di enzimi di restrizione Gene A ENZ 1 ENZ 2 ENZ 3 Tuesday, June 12, 12 Centinaia di enzimi di restrizione Gene A ENZ 1 ENZ 2 ENZ 3 Tuesday, June 12, 12 Centinaia di enzimi di restrizione Gene A ENZ 1 ENZ 2 ENZ 3 Tuesday, June 12, 12 LA STRUTTURA DI UN GENE Regione di regolazione QUANTO DOVE QUANDO COME Regione codificante Proteina Funzione Tuesday, June 12, 12 Le diverse parti di un gene possono essere riassortite in provetta GENE 1 Fegato GENE 2 Rene GENE 1/2 Rene 17 Tuesday, June 12, 12 promoter oncogene Espressione DIPENDE DAL PROMOTORE ESPRESSIONE GENERALIZZATA=CANCRO GENERALIZZATO? Tuesday, June 12, 12 L'INGEGNERIA GENETICA Gene umano Nel pancreas Gene batterico Insulina Molto in batteri Proteina X TAGLIO CUCI Proteina X nella ipofisi Tuesday, June 12, 12 Insulina in batteri GENI PER PROTEINE BIOLOGICAMENTE ATTIVE MA DISPONIBILI IN QUANTITA' LIMITATE E/O DA FONTI CONTENENTI AGENTI PERICOLOSI TPA ORMONE DELLA CRESCITA CSF INSULINA FATTORE VIII DELLA COAGULAZIONE ERITROPIETINA Tuesday, June 12, 12 ORMONE DELLA CRESCITA UMANO Prima dell'ingegneria genetica: -Purificato da ipofisi di cadavere - Possibilita' di contaminazione con virus neurotropici (Creutzfeld-Jacob) Dopo l'ingegneria genetica: - Ormone della crescita purificato da cellule produttrici; rischio di contaminazione abolito Tuesday, June 12, 12 TOSSINA BOTULINICA Prima dell'ingegneria genetica: - La tossina e' prodotta in piccole quantita’da un batterio che cresce con difficolta' Dopo l'ingegneria genetica: - La tossina potrebbe essere prodotta in grandi quantita’ da qualunque batterio Tuesday, June 12, 12 IL DNA RICOMBINANTE : una rivoluzione del modo di studiare la genetica Tuesday, June 12, 12 IL DNA RICOMBINANTE HA RIVOLUZIONATO LO STUDIO DELLA GENETICA GENETICA CLASSICA UN CARATTERE ( o FUNZIONE) UNO O PIU’ GENI Tuesday, June 12, 12 Mutazioni del topo possono riprodurre il fenotipo di malattie umane MUTAGENESI e INCROCIO Tuesday, June 12, 12 Mutazioni del topo possono riprodurre il fenotipo di malattie umane MUTAGENESI e INCROCIO Tuesday, June 12, 12 Mutazioni del topo possono riprodurre il fenotipo di malattie umane MUTAGENESI e INCROCIO Topo Snell Tuesday, June 12, 12 Mouse Models for Human Diseases Hamburger Abendblatt Tuesday, June 12, 12 IL DNA RICOMBINANTE HA RIVOLUZIONATO LO STUDIO DELLA GENETICA GENETICA INVERSA UNO O PIU’ GENI UN CARATTERE Tuesday, June 12, 12 TRANSGENESI MEDIANTE INIEZIONE DI DNA • Il DNA si inserisce a caso nel genoma. • La espresssione del gene iniettato dipende dal sito di integrazione • Sono presenti allo stesso tempo il gene esogeno e quello endogeno Tuesday, June 12, 12 Le diverse parti di un gene possono essere riassortite in provetta Tuesday, June 12, 12 GENE 1 Virus GENE 2 Tiroide GENE 1/2 Tiroide ORIGINE MULTIGENICA DELLA CRESCITA NEOPLASTICA TOPO NORMALE TOPO TRANSGENICO CHE ESPRIME IN TIROIDE UN GENE VIRALE Tuesday, June 12, 12 LIMITI DELLA TRANSGENESI • Ogni evento di transgenesi è indipendente –In esperimenti successivi il DNA iniettato può collocarsi in zone diverse del genoma. • Si può aggiungere materiale genetico e non eliminarlo Tuesday, June 12, 12 TRANSGENESI MEDIANTE RICOMBINAZIONE OMOLOGA Tuesday, June 12, 12 TRANSGENESI MEDIANTE RICOMBINAZIONE OMOLOGA I geni possono essere modificati usando il macchinario cellulare della ricombinazione Tuesday, June 12, 12 TRANSGENESI MEDIANTE RICOMBINAZIONE OMOLOGA I geni possono essere modificati usando il macchinario cellulare della ricombinazione GENE X X Tuesday, June 12, 12 GENE 1 X TRANSGENESI MEDIANTE RICOMBINAZIONE OMOLOGA I geni possono essere modificati usando il macchinario cellulare della ricombinazione GENE X X Tuesday, June 12, 12 GENE 1 X TRANSGENESI MEDIANTE RICOMBINAZIONE OMOLOGA I geni possono essere modificati usando il macchinario cellulare della ricombinazione GENE X X GENE 1 X GENE 1GENE X GENE 1 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 KNOCK-OUT Tuesday, June 12, 12 KNOCK-OUT GENE 1GENE X GENE 1 Tuesday, June 12, 12 KNOCK-OUT GENE 1GENE X GENE 1 Il gene X non è un gene attivo; la funzione del gene 1 è persa Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 KNOCK-IN Tuesday, June 12, 12 KNOCK-IN GENE 1GENE X GENE 1 Tuesday, June 12, 12 KNOCK-IN GENE 1GENE X GENE 1 Il gene X è un gene attivo; il gene 1 viene sostituito dal gene X Tuesday, June 12, 12 UNA VERA BLASTOCISTI Tuesday, June 12, 12 UNA VERA BLASTOCISTI Tuesday, June 12, 12 UNA VERA BLASTOCISTI Tuesday, June 12, 12 COLTURA IN VITRO DI CELLULE EMBRIONALI TOTIPOTENTI (ES) E’ necessario trovare condizioni per impedirne il differenziamento Tuesday, June 12, 12 Dimostrazione della totipotenza Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 La distruzione di un gene ne rivela la funzione di parti del gene Wild type Knock-out X X Tuesday, June 12, 12 Southern Blot Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 SEQUENZIAMENTO Tuesday, June 12, 12 Sequencing)costs/)Megabase) h2ps://www.genome.gov/sequencingcosts/) Tuesday, June 12, 12 Sequencing)costs/human)sized) genome) h3ps://www.genome.gov/sequencingcosts/) Tuesday, June 12, 12 Evoluzione del sequenziamento del DNA su larga scala • • 2000: Prima bozza del genoma umano 10 anni; circa 3 miliardi $ ! • 2008:%%I%maggiori%centri%di%sequenziamento% o"engono&la&stessa&quan-tà&di&informazione&in&4& giorni& • • • Tuesday, June 12, 12 Si%lancia%il%proge9o%dei%1000%genomi% 2009:%Ogni&4&ore($25,000)& 2010:&Ogni&14&minu-($5,000)& • Illumina%HiSeq2000%produce%200%miliardi%di%basi%in% 8%giorni%(BGI%ne%ha%ordinaB%128)% PAGINA BROWSER Tuesday, June 12, 12 PAGINA BROWSER Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Ibridazione con oligonucleotidi Tuesday, June 12, 12 PCR: Polymerase Chain reaction Tuesday, June 12, 12 PCR Tuesday, June 12, 12 AMPLIFICAZIONE ALLELE SPECIFICA Tuesday, June 12, 12 Basics of microarrays • DNA attached to solid support – Glass, plastic, or nylon • RNA is labeled – Usually indirectly • Bound DNA is the probe – Labeled RNA is the “target” Benfey and Protopapas, "Genomics" © 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458 Tuesday, June 12, 12 Slide-based DNA microarrays In general, slide-based arrays are used to make a direct comparison between two different RNA samples. These can be a tissue sample vs. a reference, mutant vs. wild type, treated vs. control, etc. The microarray provides a readout of the relative differences in abundance of the RNAs present in each sample. cell type A extract mRNA cell type B make labeled cDNA hybridize to microarray more in “A” more in “B” equal in A & B Tuesday, June 12, 12 CGH Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12 Tuesday, June 12, 12
