Skeletal muscle plasticity:
proteomic & intracellular signalling
pathways analysis
Maria Antonietta Pellegrino
Tipi di fibre muscolari
e isoforme della miosina
Uomo
MHC-1
MHC-2A MHC-2X
Fibre lente
Fibre veloci
tipo 1
tipo 2A tipo2X
I muscoli sono “misti”
soleo
vasto l.
tib.
MHC-2X
MHC-2A
MHC-1
VELOCITA’ DI ACCORCIAMENTO
FORZA SPECIFICA
I muscoli sono plastici
perché hanno la capacità di modificare la propria
specializzazione in base alle necessità funzionali
Fibre lente
Fibre veloci
Proprietà funzionali
Fibre ossidative
Fibre glicolitiche
attività metabolica
IL FENOTIPO CAMBIA
Condizioni fisiologiche
Fase dello sviluppo
Variazione attività muscolare
Invecchiamento
Condizioni patologiche
La plasticità
muscolare
risposte adattative del muscolo a diversi fattori
attraverso meccanismi di tipo:
• qualitativo: composizione in fibre lente e in
1 ↔ 2A ↔ 2X
fibre veloci
• quantitativo: modificazioni a livello di
dimensioni delle fibre
Meccanismo di plasticità di tipo qualitativo
Concetto di fenotipo
profilo di tutte le
proteine e delle loro
isoforme espresse
Espressione coordinata
delle proteine
MHC-slow MHC-fast
MLC-1 fast
MLC-1 slow
MLC-2 fast
MLC-2 slow
MLC-3 fast
TnC fast
TnI fast
etc……..
TnC slow
TnI slow
etc……..
L’espressione coordinata delle proteine
non è una regola
Necessità di studiare il fenotipo
muscolare con un approccio sistemico
suffisso …omica
Genomica,
Proteomica,
Trascrittomica,
Interattomica,
Metabolomica … ecc…
GENOMA
Corredo di materiale genetico,
DNA, di un organismo
Nell’uomo circa 30.000 geni
conservano le informazioni
TRASCRITTOMA
Nell’uomo circa 100.000 trascritti
“trasferiscono” le informazioni
PROTEOMA
Nell’uomo circa 1.000.000
di proteine
Studio dei trascritti –
livelli di mRNA
Totalità delle proteine,
espresse e modificate dopo
l’espressione, in un preciso istante
Studiare il Proteoma… perché?
Le proteine sono gli EFFETTORI MOLECOLARI
delle funzioni cellulari
La sequenza genica “non dice” quando una proteina
viene sintetizzata
I livelli di mRNA non sempre sono proporzionali alla
quantità di proteina espressa
14
una proteina puo’ essere presente
quando il suo mRNA non lo è piu’
possono esistere molti mRNA che non
vengono tradotti in polipeptidi
Molte modificazioni delle proteine sono
post-traduzionali
quindi non deducibili dalla sequenza genica
Il complemento proteico di una
cellula è altamente “dinamico”
- qualitativamente
- quantitativamente
variazioni fisiologiche, patologiche,
stress, somministrazione di farmaci, ecc.
Esistenza di piu’ proteomi
(subproteomi)
proteomi delimitati da precisi confini fisici
mitocondrio, apparato di Golgi
proteomi funzionali
costituiti da proteine coinvolte in uno stesso
fenomeno cellulare o in una stessa via biochimica
che interagiscono a formare
macchine molecolari piu’ articolate
Proteomica differenziale
Confronto di pattern proteici
- derivanti dallo stesso sistema posto
in differenti condizioni
Presenza di proteine differentemente espresse
Adattamenti qualitativi:
Studio del profilo di tutte le isoforme
e delle loro modificazioni post-traduzionali
SDS-PAGE delle isoforme delle MHC
2D electrophoresis
SDS-PAGE delle isoforme delle MHC
2DE Tecnica di elezione per
lo studio del proteoma
1975
Identificazione delle proteine con 2DE
2D-PAGE
Punto isoelettrico
Prima dimensione IEF
cioè quel valore di pH
al quale la carica netta è
nulla
Peso molecolare
Seconda dimensione
SDS-PAGE
Principali limiti della 2D-PAGE
Impossibilità di visualizzare tutte le proteine
realmente espresse
-Proteine espresse in minore quantità
-Proteine con pI non compreso tra 3 ed 11
-Proteine di massa molecolare inferiore a 10000 D
-Proteine di massa molecolare superiore a 200000 D
-Proteine fortemente idrofobiche
Identificazione delle proteine
di un sistema complesso
2D-PAGE
Punto isoelettrico
Prima dimensione IEF
cioè quel valore di pH
al quale la carica netta è
nulla
Peso molecolare
Seconda dimensione
SDS-PAGE
kDa
100
40
20
10
3
pH
11
ANALISI PROTEOMICA
Preparazione dell’estratto proteico
Separazione delle proteine
Analisi
Identificazione e caratterizzazione delle
proteine
1
Preparazione
dell’estratto
proteico
Lisi (cellule e tessuti)
e Solubilizzazione
Azoto liquido (mortaio)
8M Urea
2M Thiourea
4% CHAPS
65 mM DTT
40 mMTris
Congelamenti e decongelamenti ripetuti
1
Preparazione
dell’estratto
proteico
Inattivazione delle sostanze che possono interferire
Inattivazione delle proteasi: Inibitori delle proteasi
(cocktail d’inibitori)
Inattivazione
degli acidi nucleici: cocktail di DNA/RNAasi
Concentrazione proteica
2-D Quant Kit
2
Separazione
delle proteine
2
Prima dimensione:
Isoelettrofocusing (IEF)
Prima dimensione:
Isoelettrofocusing
(IEF)
avviene in condizioni
denaturanti e ad alti
voltaggi
Campione
Tampone di
reidratazione
++
3-11
--
Strip
Olio
Elettrodo
esterno
anodo
catodo
IPGphor
Prima dimensione:
Isoelettrofocusing (IEF)
Reidratazione
Posizionamento
prot lungo la strip
5000
volt
4000
3000
2000
1000
step
Volt
tempo
Vhrs
S1 step-n-old
30
14:00 h
420
S2 gradient
200
2:00 h
230
S3 gradient
300
2:00 h
500
S4 gradient
1000
1:00 h
650
S5 gradient
3500
2:45 h
6187
S6 gradient
5000
2:45 h
11687
S7 step-n-old
5000
0:05 h
416
0
0
5
10
15
20
25
30
tempo
-
20°C
FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA
DV
anodo
catodo
proteine pI acido
pH3
proteine pI basico
pH10
+
-
+
-
Seconda dimensione:
SDS-PAGE
Separa le proteine secondo
il loro peso molecolare
Iodoacetamide serve per
alchilare
Tampone di
equilibrazione
+
-
3 - 11
12%
Tris-Cl, pH 6.8 1M (50 mM)
Urea
(6M)
Glicerolo 100%
(30%)
SDS
(2%)
Blu di bromofenolo
Iodoacetamide (3%)
15%
70 V
~20 h
cariche delle
catene laterali
+
+
-+
--
S O
O O
+
+
--
O
SDS
Na
- -- -- - - - - - - -
+
Il trattamento con SDS conferisce a tutte le proteine una carica negativa
Esse migreranno in un Gel, sotto l’azione di un campo elettrico,
solo in funzione della loro grandezza (M)
Seconda dimensione:
Separa le proteine secondo
SDS-PAGE
+
il loro peso molecolare
-
3 - 11
Protein Detection
12%
15%
70 V
~20 h
•
•
•
Coomassie Stain (100 ng to 10 mg protein)
Silver Stain (1 ng to 1 mg protein)
Fluorescent (Sypro Ruby) Stain (1 ng & up)
Seconda dimensione:
SDS-PAGE
kDa
100
40
20
10
3
pH
11
ANALISI
Image Master Platinum
Condizione 1
Il programma individua gli spot (detection)…
Condizione 2
Image Master Platinum
… accoppia spot corrispondenti di gel diversi (matching) e individua eventuali
differenze tra essi (volume, area)
4
Analisi
Analisi
Differenze sono in termini di
area, volume
Volume = Area x intensità
75% dell’altezza del
picco
Il volume consente di valutare
quantitativamente le variazioni
del profilo proteico dei campioni
analizzati
Valutazione precisa di parametri
quali pI, peso molecolare e
volume degli spot.
75%
SPOTS REPORT
kDa
100
40
20
10
3
pH
11
Criteri adottati per la valutazione
differenziale degli spot
3 corse per ciascun campione
Spot comuni a tutti i gel
Parametro analizzato: volume dello spot
Identificazione degli spot
Confronto con banche dati
SWISS 2D PAGE
swiss-prot/TREMBL
excisione dello spot
Abbondanza relativa degli ioni
Spettrometria di massa
Rapporto massa/carica
Swiss 2D-PAGE
Lecture 1.3
41
Spettrometria di massa MALDI-TOF
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation time-of-flight
excisione dello spot
digestione con tripsina
Estrazione dei peptidi
Colorazione con argento
compatibile con spettrometria
analisi dei peptidi
MALDI-TOF
QUANDO E’ NECESSARIO CONFERMARE CON UN ESPERIMENTO
DI WESTERN BLOT UN RISULTATO DI ESPRESSIONE
DERIVANTE DALL’ANALISI 2D?
- Nel caso di proteine che focalizzano in più spot
- Nel caso di analisi su modificazioni post traduzionali
Western blotting (blotting di proteine)
The carbonyl groups in the protein side chains are derivatized to
2,4-dinitrophenylhydrazone (DNP hydrazone) by reaction with
2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH); 6 μg of the DNP-derivatized protein samples
were separated by PAGE (15% SDS-polyacrylamide gels) and then
blotted for 2 h at 100 V to a nitrocellulose membrane
1 Ponceau Red and scan
2 primary Ab anti-DNP hydrazone
Ponceau
Oxyblot
C
HU-3
HU-7
Meccanismo di plasticità muscolare
di tipo quantitativo
Atrophy
Hypertrophy
• Cancer cachexia
• Strength training
• Neuromuscolar deseases
• Steroids
• Aging
•Denervation
• Disuse
Meccanismo di plasticità muscolare
di tipo quantitativo
1
Analisi della variazione di massa muscolare (CSA) a livello di:
- muscolo in toto
- singola fibra muscolare
2
HU-7
HU-14
MHC-I
HU-3
MHC-IIA
Soleus
C
Analisi dei segnali responsabili delle variazioni della massa muscolare
Sistema Ubiquitina proteasoma
sintesi
degradazione
Sistema dell’autofagia
Attivazione della via degradativa
Attivazione della via sintetica
COMUNICAZIONE TRA LA VIA SINTETICA E DEGRADATIVA
I sistemi degradativi sono influenzati dalle alterazioni metaboliche
Attraverso la produzione di ROS
Mitochondrial
dysfunction/damage
Alterazioni della dinamica
mitocondriale
I sistemi degradativi sono influenzati dalle alterazioni metaboliche
Attraverso la produzione di ROS
Mitochondrial
dysfunction/damage
Alterazioni della dinamica
mitocondriale
I sistemi degradativi sono influenzati dalle alterazioni metaboliche
Attraverso la produzione di ROS
Mitochondrial
dysfunction/damage
Alterazioni della dinamica
Mitocondriale
Stress energetico
Real – Time PCR
La Polymerase Chain Reaction (PCR) è
il processo che permette
l’amplificazione di uno specific
frammento di DNA.
Misura l'amplificazione in tempo reale durante la
fase esponenziale della PCR, quando cioè
l'efficienza di amplificazione è influenzata
minimamente dalle variabili di reazione,
permettendo di ottenere risultati molto più
accurati e quantitativi
TRATTAMENTO DEL TESSUTO MUSCOLARE
Per poter estrarre l’RNA dalle cellule dei tessuti è necessario frantumare il tessuto
E rompere le cellule che lo costituiscono
Possibili metodi per la rottura delle cellule:
Metodi meccanici
Vibrazioni ultrasoniche
Agenti litici responsabili della lisi celulare
METODO MECCANICO:
1. CONGELAMENTO DEL TESSUTO
IN GHIACCIO SECCO O AZOTO LIQUIDO
2. POLVERIZZAZIONE
DEL TESSUTO
CON IL PESTELLO
Solubilizzazione nel buffer di lisi
COLONNINE DI SILICE eliminare DNA e trattenere l’RNA sulla
membrana
Il campione nella soluzione di lisi viene
caricato nella colonnina al silice e
centrifugato
trattamento con DNAasi
Eluisco l’RNA con l’H2O, stacca dalla
viene recuperato
Quantificazione dell’RNA
membrana e
TRASCRIZIONE INVERSA RNA
La trascrizzione inversa consente di produrre una molecola di cDNA (DNA
complementare) partendo da una molecola di RNA, grazie all’utilizzo di un enzima
DNA polimerasi RNA dipendente
3’
5’
AAAAA
mRNA
5’
3’
oligo nucleotidi random
3’
mRNA
AAAAA
5’
cDNA
5’
3’
cDNA
APPAIAMENTO DEI
RANDOM PRIMERS
SINTESI DEL cDNA per
ottenere una molecola
ibrida cDNA-RNA
Eliminazione dell’RNA
tramite l’utilizzo dell’ RNase
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
amplificazione
“Stampo” una piccola quantità di DNA che si vuole
amplificare (DNA Target)
“L’operaio” l’enzima polimerasi che sintetizza il DNA
•i “mattoni”,
una riserva di nucleotidi liberi
costituita da Adenina, Timina, Citosina, Guanina
•Innesco,2 primer: sequenze di DNA a singolo filamento (2030 nucleotidi) sintetizzate artificialmente, hanno la funzione
di innescare la reazione di sintesi [un primer (for) è
complementare a un filamento di DNA all’inizio della regione
bersaglio;
l’altro
(Rev)
è
complementare
all’altro
filamento, alla fine della regione bersaglio]
Polymerase Chain Reaction: principio
CICLI TERMICI:
Dapprima viene sintetizzata una molecola
di DNA a doppio filamento a partire dalla
molecola di cDNA, conducendo la reazione
ad una temperatura adatta a permettere
l'annealing dei primer al DNA
DENATURAZIONE
(94-96°C)
ANNEALING
(50-65°C)
EXTENSION
(72°C)
Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles
2 copies
DNA
fragment
to be
amplified
4 copies
8 copies
Chimiche fluorescenti
per PCR Real-Time
•La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto
di diverse possibili reazioni chimiche
•Le chimiche principali sono basate sia sul legame di
coloranti fluorescenti che si intercalano al dsDNA, come il
SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
SYBR Green
Utilizza una molecola fluorescente
non specifica che si lega al solco minore
di tutte le molecole di DNA.
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DN
denaturato, primers e la molecola fluorescente
Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti
alla doppia elica.
Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che
corrisponde all’aumento del numero di copie dell’amplicone
Sonde TaqMan
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i
primers della PCR, viene disegnato per essere
complementare alla sequenza bersaglio da amplificare
R
3’
5’
5’
Primer
3’
5’
Q
3’
5’
Primer
3’
5’
3’
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che
spegne la fluorescenza del reporter
Curve di amplificazione
Fluorescenza
Plot lineare
Cicli di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il
cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla
quantità di template iniziale
Normalised reporter fluorescence (Rn)
Plot di amplificazione
Linea soglia scelta
d a l l ’ o p e r a t o r e
In maniera da intersecare
le curve di tutti i campioni
nella fase esponenziale
Indica il valore al di
sopra del quale
inizia l’accumulo di
un amplificato
E’ il ciclo della reazione di
amplificazione in cui il segnale
di fluorescenza del campione è
maggiore rispetto a quello
d e l l a T h r e s h o l d
PCR cycle number
Quantitativa relativa
Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario:
•TARGET
– La sequenza di DNA da analizzare.
•CALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento per l’analisi
comparativa (Trattato/non Trattato, campione al T0 in uno studio time course)
•CONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso costitutivamente in tutti i
campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di
DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione.
Quantitativa relativa: analisi dei dati
∆CtT = Ct gene target campione
– Ct campione di riferimento
∆Ct HK = Ct gene HK campione
– Ct campione di riferimento
∆∆Ct = ∆Ct gene target campione – ∆Ct campione HK
2- (DCT- DCTHK)
