Analisi quantitativa delle immagini
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Università degli studi di Firenze Dipartimento di Scienze Biochimiche Viale G.B. Morgagni 50 - Firenze Analisi quantitativa delle immagini per applicazioni in Life Science 14 Gennaio 2011 Immagini & Computer S.n.c. Via Don Carlo Riva 4 20010 Bareggio (Mi) Analisi quantitativa delle immagini “L’analisi quantitativa delle immagini rappresenta l’arte di trasformare una sensazione visiva nella sua forma schematica e discreta consentendone la descrizione, la classificazione e l’interpretazione matematica e logica univoca delle sue componenti spaziali e temporali.” Analisi quantitativa delle immagini Quando e perché ? Quando serve una rappresentazione oggettiva del risultato. Quando dobbiamo condividere i risultati con altri. Quando ci è richiesta una ripetibilità nei risultati ottenuti. Quando … Perché risulta più professionale fornire numeri piuttosto che impressioni. Perché ci consente di discutere e difendere i nostri dati. Perché possiamo rivedere e ripetere passo-passo il processo che ci ha portato al risultato. Perché …. Analisi quantitativa delle immagini Un significativo contributo alla diffusione di questa disciplina è stato fornito dalla enorme disponibilità di strumenti digitali in grado di produrre informazioni in grande quantità. Microscopia widefield Microscopia confocale Microscopia spettrale Microscopia confocale 2 fotoni Sistemi HCS Investigazione contemporanea in più dimensioni. Elevata risoluzione spaziale Esplorazione temporale Complessità Analisi quantitativa delle immagini Il percorso per arrivare alle misure Analisi quantitativa delle immagini Il percorso ideale Risultati Misura Trattamento dell’immagine Raccolta delle immagini Marcatura adeguata delle strutture Preparazione del campione Analisi quantitativa delle immagini Risulta quindi basilare 1. Fissare gli obiettivi che ci proponiamo 2. Studiare e definire i metodi di preparazione del campione 3. Studiare e definire i metodi ed i processi di acquisizione, trattamento ed analisi da utilizzare (Protocolli di acquisizione ed analisi). Assicurare per quanto possibile l‟indipendenza dei risultati dalla piattaforma utilizzata. Analisi quantitativa delle immagini Gli ostacoli sul percorso Analisi quantitativa delle immagini Errore, precisione ed accuratezza Qualsiasi misurazione quantitativa è influenzata da potenziali errori. • Gli errori possono derivare dal campione, dal sistema ottico (microscopio), dal sistema digitale di acquisizione o dall‟operatore. • Gli errori diminuiscono il livello di precisione della misura. • L‟accuratezza della misura influisce sulla affidabilità della singola quantificazione. Campioni biologici che possiedono un livello intrinseco di variabilità Distinzione tra variabilità naturale ed errori della misurazione. Necessità di effettuare una sola misurazione Capacità di identificazione e riduzione delle sorgenti di errore delle nostre misurazioni Analisi quantitativa delle immagini Principali sorgenti di errore Marcatura adeguata delle strutture Preparazione del campione Sistema Ottico e di acquisizione Background Rumore Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Deve essere sottratto al valore del segnale. Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Il segnale deve risultare significativamente più elevato del rumore. Degrado delle caratteristiche dell’immagine originale. Introduzione di aberrazioni ottiche e di fenomeni di diffrazione. •Autofluorescenza. •Fuori fuoco. •Luce estranea •Poisson noise (campione) •Noise ottico •Noise digitale (detector) •Valutazione PSF •Aberrazioni sferiche e cromatiche •Disallineamento •Artefatti SNR Rapporto segnale rumore Analisi quantitativa delle immagini Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR) Rappresenta il rapporto tra i disturbi presente nell‟immagine e l‟effettivo segnale. Analisi quantitativa delle immagini In un sistema di acquisizione basato su telecamera CCD il Rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come: SNR = PQet / [PQet + Dt + Nr2] 1/2 Dove P rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Qe l‟efficienza quantica del sensore, t il tempo di integrazione (Secondi), D la Dark Noise (Elettroni/pixel/Secondo) e Nr il Read Out Noise. Il segnale proveniente dal Background (Scatter o Riflessione) influisce sulla qualità del valore di SNR e deve di conseguenza essere tenuto in considerazione nel calcolo. SNR = PQet / [(P+B)Qet + Dt + Nr2] 1/2 In un sistema confocale il rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come: Dove N rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Q il noise generato dal laser, S il Noise secondario generato dalla moltiplicazione degli elettroni e D la dark current del PMT. Analisi quantitativa delle immagini Raccolta delle immagini Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini. Rimozione del rumore Rilocazione della luce fuori fuoco Correzione degli artefatti Decadimento (Photobleaching,ect) Correzione disomogeneità fondo Instabilità di illuminazione Registrazione Mosaicatura Identificazione delle strutture Segmentazione Distinzione da altre strutture Codifica dei confini e misura Classificazione Pubblicazione Evoluzione e comportamento delle strutture Tracking Cinetica Ratio Imaging Data Mining Simulazione evento Creazione modello Analisi dei dati Analisi quantitativa delle immagini La raccolta delle immagini Analisi quantitativa delle immagini La raccolta delle immagini richiede una serie di accorgimenti quali : Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z Adeguata considerazione della dinamica del segnale (rappresentazione dell‟evento) Corretta definizione dei parametri operativi (potenza del laser, esposizione della telecamera, impostazione PMT, livello di illuminazione del campione) Qualità della ripresa Corretta (e strutturata) memorizzazione delle immagini Standardizzazione del processo [Protocollo di acquisizione] Analisi quantitativa delle immagini Come archiviare le immagini. Importante considerare la finalità per la quale si vuole archiviare l’immagine. 1. Documentazione Soddisfatta la qualità visiva, le dimensioni del file rappresentano il principale obiettivo. I formati compressi con perdita di informazioni (Jpeg, Jpeg2000, ect) sono ampiamente giustificati. 2. Analisi successiva Necessità di preservare le informazioni originali contenute nell’immagine. In questo caso sono da preferire i formati lineari non compressi o con compressioni di tipo “lostless” (Tiff, Bmp, ect) oppure i formati proprietari degli strumenti. No a formati “ibridi” (quali il Tiff - Palette) Analisi quantitativa delle immagini I danni introdotti dai sistemi di compressione ad alta efficienza (Jpeg, Jpeg2000, ect) non sono immediatamente percettibili. Essi si manifestano sotto forma di “pixellatura” artificiale dell’immagine. Analisi quantitativa delle immagini I singoli pixel subiscono una modifica in termini di contenuto cromatico e/o di intensità/densità. Tale variazione può introdurre un errore di valutazione importante (5% - 10%) direttamente rapportato al coefficiente di compressione utilizzato. TIFF JPEG Differenza assoluta Analisi quantitativa delle immagini Dinamica del segnale La dinamica del segnale descrive l‟escursione relativa della intensità del segnale fluorescente in osservazione (valore massimo – valore minimo). Espresso come “Flusso di Fotoni “(fotoni / unità di sup. / Sec.) Il processo di conversione digitale effettua una “scomposizione” del segnale fluorescente utilizzando una scala numerica con una quantità predeterminata di valori (Livelli di Grigio). Continuo Discreto Immagine digitale Scala a Livelli di Grigio Analisi quantitativa delle immagini Dinamica del segnale Condizione teorica ottimale : 1f = 1 gl scala di grigio compresa tra 0 ed Infinito. In realtà la dinamica digitale del segnale è una caratteristica del dispositivo di acquisizione utilizzato Per i sensori CCD esso è funzione del rapporto tra la capacità di immagazzinamento dei fotoni (FWC) propria delle singole celle ed il contributo dei rumori intrinseci (ReadNoise, Termalnoise, ect) da esso generati. Esempio : Consideriamo un CCD con FWC pari a 40.000 e con un Noise di 12 e . Il relativo RDD risulta : GrayLevels= 40.000 / 12 = 3.333 [12 bit (4.096 GrayLevels)] L’efficienza di conversione definisce il numero di fotoni descritto dal singolo livello di grigio. EC = FWC / GL (- Offset) EC = 40.000 / 4096 = 9.7656 f FWC inversamente proporzionale alle dimensioni della singola cella CCD. Analisi quantitativa delle immagini Dinamica del segnale Nel caso di sensori PMT utilizzati nei sistemi confocali, a causa del basso flusso di fotoni (Pin Hole), la dinamica digitale del segnale risulta funzione del solo segnale. Non confondere dinamica digitale del segnale con il formato file. Sfruttiamo al meglio la dinamica del segnale evitando, per quanto possibile, la saturazione di parti dell‟immagine. Analisi quantitativa delle immagini Campionamento e densità La densità di campionamento rappresenta il numero di unità digitali di base (pixel o voxel) catturate per unità di superfice / volume. Essa definisce la connessione diretta tra le unità digitali (voxel) ed il reale volume dello spazio fisico. La densità di campionamento è direttamente derivata dai parametri caratteristici del sistema ottico (PSF) e non può essere modificata dopo l‟acquisizione del volume. La Point Spread Function (PSF) rappresenta “il mattone” sul quale l‟immagine viene costruita. Risulta quindi basilare registrare i dettagli in essa contenuti con la stessa scala della PSF. PSF Image Restoration Analisi quantitativa delle immagini Campionamento e densità Il valore di campionamento critico, al di sotto del quale il processo di acquisizione può produrre artefatti (frange di diffrazione), è calcolato utilizzando la formula di Nyquist. “La frequenza di campionamento di un segnale (Analogico ->Digitale) deve risultare più grande del doppio della banda passante del segnale originale in modo da garantirne la perfetta ricostruzione digitale.” Calcolo Z secondo Nyquist Δz = λem / (2 N (1- cos α)) Λem = emission wavelenght N = medium index α = ½ angolo apertura obiettivo Calcolo XY secondo Nyquist Δxy = λem / (4 N sen α) In pratica Λem = 520nm N = 1.515 NA = 1.3 α = αrcsen(NA/N) Δz = 520 /(2*1.515*(1-cos α)) Δz = 353 nm Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione Analisi quantitativa delle immagini Le molteplici risoluzioni di un sistema A. Risoluzione Ottica : limite di discriminazione tra due oggetti adiacenti. Determinato dalla apertura numerica dell’obiettivo e dalla lunghezza d’onda di emissione della luce. B. Risoluzione spaziale : limite di discriminazione del sensore CCD. Determinato dalle dimensioni della singola cella del sensore e dall’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato. C. Risoluzione Immagine : caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine. Analisi quantitativa delle immagini La risoluzione Ottica. La risoluzione ottica del microscopio è funzione della : • lunghezza d’onda della luce utilizzata; • apertura numerica (N.A.) dell’obiettivo. La risoluzione ottica del microscopio NON dipende da: • ingrandimento dell’obiettivo Secondo la formula generale ->R = 0,61 λem/ N.A. dove N.A.= n sen a (Formula descritta per la prima volta da Ernest Abbe e Carl Zeiss) Si consideri che: • Maggiore e’ l’angolo (N.A.) con cui l’obiettivo è in gradodi raccogliere la lucemaggiore è ilpoteredirisoluzione •Maggiore è N.A. minore è la distanzadilavoro Per obiettivi in aria a è sempre minore di 90° Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione spaziale & Risoluzione discriminante La risoluzione spaziale rappresenta la dimensione, espressa in unità metriche, del più piccolo oggetto, proiettato sul piano di fuoco, identificabile come tale dal sistema di acquisizione. La risoluzione discriminante rappresenta la distanza minima, espressa in unità metriche, che deve intercorrere tra due oggetti proiettati sul piano di fuoco, e ben contrastati tra loro, per poter essere identificati come tali dal sistema di acquisizione. Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione spaziale In presenza di un dispositivo CCD, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni della singola cella del sensore (pixel size) e del’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato secondo la formula: Rs= (Pixel size / Ingrandimento obiettivo) In presenza di un dispositivo PMT confocale, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni Pin Hole utilizzato (Airy unit), dal fattore di ingrandimento (zoom) e dal numero di pixels utilizzati per la matrice di acquisizione. L‟impostazione di questi parametri è strettamente dipendenti dai valori di densità di campionamento calcolati utilizzando la formula di Nyquist. 4.6 um Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione discriminante A causa delle caratteristiche fisiche del sensore CCD, due oggetti devono distare almeno di un pixel tra loro per poter essere discriminati come tali. Rd = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3) Esempio : Pixel size = 6.4 um, Ingrandimento = 100x Risoluzione spaziale = (6.4 / 100) = 0.064 um -> (Pixel size / Ingrandimento) Risoluzione Discriminante = ((6.4 / 100) * 2.3) = 0.147 um -> (Pixel size / Ingrandimento) * 2.3 Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione Immagine Caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine. Da non confondere con i DPI. 1024 x 768 pixel 2048 x 1536 pixel Analisi quantitativa delle immagini Artefatti & affini Analisi quantitativa delle immagini Principali sorgenti di errore Artefatti Sistema Ottico e di acquisizione Rumore Campione Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Decadimento delle caratteristiche del segnale. Degrado delle caratteristiche dell’immagine originale. •Autofluorescenza. •Fuori fuoco. •Luce estranea •Poisson noise (campione) •Noise ottico •Noise digitale (detector) •Photobleaching •Quencing • etc. •Valutazione PSF •Aberrazioni sferiche e cromatiche •Disallineamento •Artefatti Background Analisi quantitativa delle immagini Quencing : generato da processi che producono il passaggio degli elettroni dallo stato di eccitazione a quello di riposo senza emissione di luce. Questi processi competono con i classici processi fluorescenti riducendone il LIFETIME e la QY (emissione quantica) del fluoroforo utilizzato. Il processo di Quencing è reversibile. Photobleaching : Perdita permanente della capacità di emettere elettroni da parte del fluoroforo a causa di un danno chimico indotto. Una delle cause principali del Photobleaching è l‟interazione del fluoroforo con luce ed ossigeno (distruzione molecole fluorescenti con creazione di radicali liberi che interagiscono con altre molecole presenti nelle cellule). Tale effetto può essere contenuto riducendo la quantità di luce utilizzata per l‟eccitazione ed aggiungendo al media di montaggio appositi preparati Antifading. Il processo di Photobleaching non è reversibile. Fluoroforo : FITC Sorgente di eccitazione : HBO 100W Esposizione : 30sec Perdita del 50% del segnale Analisi quantitativa delle immagini Photobleaching Perdita progressiva della capacità di un fluoroforo di emettere fotoni in risposta ad uno stimolo luminoso. La continua e prolungata esposizione ad una sorgente di eccitazione porta alla completa estinzione della molecola fluorescente. T = 0 sec T = 15 sec T = 30 sec Analisi quantitativa delle immagini Correzione degli artefatti Decadimento del segnale La procedura corregge le differenze di intensità di segnale causate dal degrado della sonda fluorescente nel corso del tempo (timelapse o volume 3D). Correzione Background Elimina i difetti dovuti alla disomogeneità del campo illuminato (disallineamento lampada, ect) Disomogeneità di illuminazione La procedura corregge le differenze di intensità di segnale causate dalla non perfetta stabilità della sorgente di illuminazione (Flickering) Analisi quantitativa delle immagini Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini La convoluzione è il processo ottico di creazione dell‟immagine. Esso introduce artefatti di vario genere con la conseguente degradazione dell‟immagine. 1. Rumore 2. Aberrazioni (sferiche e cromatiche) 3. Errata localizzazione della luce (sfocatura) A causa della profondità di campo dell‟obiettivo utilizzato, la luce proveniente dai piani di fuoco adiacenti a quello principale fornisce il proprio contributo nella formazione dell‟immagine. Analisi quantitativa delle immagini Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini La profondità di campo è funzione principalmente della apertura numerica della lente e della lunghezza d‟onda di emissione della luce utilizzata. La profondità di campo può essere espressa come : DoF = λn/NA2 + (n/M×NA)e Bkg Segnale S/N 801 1394 1.74 189 1318 6.97 Prima conseguenza evidente è rappresentata dalla riduzione della risoluzione e del rapporto segnale / rumore all‟interno dell‟immagine. Analisi quantitativa delle immagini Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini ImageRestoration insieme di procedure e funzioni atte al recupero di un segnale (immagine) nella sua forma originale. Deconvoluzione 3D operazione matematica utilizzata per recuperare un segnale degradato da un processo fisico. Filtri spaziali lineari e non Filtri in domini di frequenza (FFT) Nessuna alterazione dell‟immagine (analisi quantitativa) Analisi quantitativa delle immagini Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini Per ridistribuire correttamente la luce è necessario conoscere a priori il modello fisico che regola la diffusione della stessa nel sistema ottico in uso (descrittore della funzione di convoluzione). Tale modello fisico è conosciuto come PSF o Point Spread Function. Analisi quantitativa delle immagini Semplificare le informazioni Analisi quantitativa delle immagini Quale è la nostra base di partenza? • Circa 1/3 del cervello umano elabora informazioni visive • Percezione visiva dipende dal modo in cui vengono elaborate le informazioni luminose prodotte da fotoni che colpiscono la retina • Elaborazioni diverse permettono di percepire aspetti diversi della visione: forme, colore, movimento, profondità. • Elaborazione molto veloce e complessa : percezione simultanea di dettagli e di aspetti globali dell‟immagine. Visione Valutazione Comprensione della scena Conoscenza Informazioni Le principali prerogative del sistema visivo umano sono la rapidità di interpretazione, la capacità di adattamento alle variazioni presenti nella scena rispetto al modello noto e la possibilità di incrementare la conoscenza. Analisi quantitativa delle immagini Quale è la nostra base di partenza? Immagine Ottica campione Sensore (CCD, PMT) Fotoni convertiti in una grandezza fisica proporzionale (ma non uguale) al numero dei fotoni rilevati. Matrice bidimensionale di pixel ognuno dei quali rappresenta una specifica area del campione I livelli di grigio espressi dai singoli pixel rappresentano il numero di fotoni presenti nella corrispondente area / volume del campione Analisi quantitativa delle immagini Semplificare per identificare Proprietà dei pixel : • Intensità (luminosità) • Coordinate spaziali X,Y • Identità ed iterazione con pixel adiacenti E‟ evidente la difficoltà nell‟assegnare, sulla sola base delle proprietà sopra indicate, i singoli pixel ad una specifica classe di appartenenza (filamento, nucleo, membrana, fondo ect) Analisi quantitativa delle immagini Identificazione delle strutture Metodi strettamente dipendenti dalle caratteristiche delle strutture da identificare Preservare il contenuto informativo Segmentazione Manipolazione dell’immagine Region Growing Binarizzazione Riconoscimento contorni (Edge detection) Analisi quantitativa delle immagini Riconoscimento dei contorni Si definisce contorno (edge) una forte variazione locale dei livelli di grigio tipicamente associata al bordo di una regione od al confine di separazione tra due regioni adiacenti. Per rilevare i contorni si ricorre al calcolo del gradiente di intensità, ovvero alla valutazione delle variazione dei livelli di grigio, ed al suo orientamento nell‟intorno del bordo da definire. Uno degli algoritmi più conosciuti è il LoG (Laplace ofGaussian) che determina il gradiente attraverso il calcolo della derivata seconda dei livelli di grigio. L‟area racchiusa dal contorno è riempita con un solo valore di grigio e considerata struttura (oggetto). Analisi quantitativa delle immagini Riconoscimento dei contorni Il contorno può risultare chiuso ed identificare una specifica regione dell‟immagine (oggetto) oppure aperto e definirne solo una parte del confine. Uno dei principali motivi della mancata chiusura dei bordi è da ricondurre al basso contrasto esistente tra regioni dell‟immagine (es fondo ed oggetto). Anche la presenza di rumore sull'immagine (basso SNR) è causa di difficoltà nella rilevazione dei contorni (generazione di falsi bordi). Immagine Edge detection & linking Binarizzazione Ogni area racchiusa dal un contorno è riempita con un solo valore di grigio e considerata struttura (oggetto). Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Tipicamente si tende a distinguere il fondo (background) dalle strutture di interesse. All„interno dell„intervallo di grigi si trova l„oggetto, all„esterno il fondo. Le tecniche di segmentazione sono sensibili ai vari artefatti presenti nell‟immagine (rumore, disomogeneità, ect). In presenza di strutture caratterizzate da intensità di fluorescenza differenti un unico intervallo di grigi non consente una perfetta identificazione delle stesse. Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Adattiva Le tecniche di segmentazione adattiva permettono di calcolare l„intervallo di grigio adeguato ad una zona specifica dell„immagine in funzione delle caratteristiche locali del segnale (valutazione statistica). E‟ possibile dividere l‟immagine in aree irregolari in base alle caratteristiche di omogeneità espresse localmente dal segnaledi segnale. Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Tutti i pixel compresi nell‟intervallo di grigi definito e confinanti tra loro vengono assegnati alla stessa struttura. In questo caso le strutture vengono create accorpando tutte le aree tra loro confinanti secondo criteri impostati dall‟operatore . Tali criteri sono basati su caratteristiche morfologiche, statistiche, di tessitura della superficie o di omogeneità di segnale. Analisi quantitativa delle immagini Crescita delle regioni (Region Growing) Proposto da Haralick, fa uso di descrittori statistici. Si basa sulla progressiva aggregazione di pixel in regioni connesse. Tale aggregazione avviene sulla base di uno o più criteri di similarità. Originale Massimo locale Crescita delle regioni Definizione strutture Partendo da un punto qualsiasi dell‟immagine (massimo o minimo locale) vengono aggregati tutti i pixel del suo vicinato che soddisfano i parametri statistici assegnati (es. media e varianza). La regione viene considerata completa (e non cresce più) quando tutti i pixel sono stati classificati (come aggiunta si possono valutare alcuni criteri ad essa associati (forma, dimensione, ect) oppure incontra un‟altra regione in crescita. La procedura è ripetuta per ogni punto aggiunto e le statistiche della regione vengono aggiornate ciclicamente. Analisi quantitativa delle immagini Estrazione delle informazioni Analisi quantitativa delle immagini Estrazione delle informazioni Possiamo ottenere qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente : Dimensioni Area Perimetro Diametri Forma Posizione Roundness Aspect ratio Centroide XY Analisi quantitativa delle immagini Estrazione delle informazioni Possiamo ottenere grandezze fisiche che descrivono il segnale presente : Intensità del segnale Variazione di segnale Distribuzione di segnale Analisi quantitativa delle immagini Le misure di fluorescenza e la calibrazione. Corretto il confronto tra strutture appartenenti allo stesso campo Incorretto il confronto diretto tra strutture appartenenti a campi / campioni differenti a causa delle: • Impostazioni del sistema di acquisizione. (esposizione, eccitazione, ect) • Stato del campione.(photobleaching, quencing, ect) • Rumore, disomogeneità nella distribuzione del segnale, fuori fuoco, ect • Condizioni ambientali Analisi quantitativa delle immagini Le misure di fluorescenza e la calibrazione. Una delle possibili soluzioni consiste nel legare la misura di interesse con un riferimento che possa esprimere le eventuali variazioni dovute alle condizioni esterne al campione. •Livello del fondo •Auto fluorescenza dei tessuti circostanti •Segnali provenienti da strutture non influenzate dalle condizioni sperimentali Linea cellulare nota inserita nel processo di analisi Misure raziometriche (Ca2+) Cellule non caricate e caricate a saturazione Caso reale Intensità dei telomeri normalizzata con intensità centromero prima del loro confronto. Entrambi marcati utilizzando lo stesso dye. Analisi quantitativa delle immagini Le misure di fluorescenza e la calibrazione. La calibrazione del sistema di acquisizione garantisce la ripetibilità delle misure 100% Intensità relativa 33% Intensità relativa 10% Intensità relativa 3% Intensità relativa 0.667% Intensità relativa Analisi quantitativa delle immagini 3D: il mondo reale Analisi quantitativa delle immagini Quale è la nostra base di partenza? 3 Dimensioni Immagine Ottica campione Sensore (CCD, PMT) Fotoni convertiti in una grandezza fisica proporzionale (ma non uguale) al numero dei fotoni rilevati. Matrice tridimensionale di voxel ognuno dei quali rappresenta uno specifico volume del campione . I livelli di grigio espressi dai singoli voxel rappresentano il numero di fotoni presenti nella corrispondente volume del campione . Analisi quantitativa delle immagini Semplificare per identificare Proprietà dei voxel : • Intensità (luminosità) • Coordinate spaziali X,Y e Z • Identità ed iterazione con voxel adiacenti E‟ evidente la difficoltà nell‟assegnare, sulla sola base delle proprietà sopra indicate, i singoli voxel ad una specifica classe di appartenenza (filamento, nucleo, membrana, fondo ect) Iso Superficie Analisi quantitativa delle immagini Costruzione delle Iso Superfici Le iso superfici rappresentano l‟equivalente 3D degli iso contorni. Entrambe descrivono una parte di volume, o di una area bidimensionale, all‟interno del quale tutti i punti (voxel) presenti possiedono un valore eguale tra loro o compreso in un intervallo definito Iso Superficie Iso Contorno Le iso superfici non hanno solo una valenza estetica ma risultano essenziali per la quantificazione del volume. Esse costituiscono il “guscio” che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini precisi. Analisi quantitativa delle immagini Identificazione delle strutture Metodi strettamente dipendenti dalle caratteristiche delle strutture da identificare Preservare il contenuto informativo Manipolazione dell’immagine Region Growing Segmentazione Iso Superficie Analisi quantitativa delle immagini Costruzione delle Iso Superfici 1. Selezione dell‟intervallo di intensità del segnale (livelli di grigio) da descrivere attraverso la Iso Superficie. 3. Trasformazione visiva della struttura complessa attraverso il loro riempimento. 2. Creazione matematica di una struttura complessa di forme geometriche (triangoli) che descrivono la superficie esterna del volume. Analisi quantitativa delle immagini Costruzione delle Iso Superfici Il livello di precisione nella ricostruzione della superficie è gestito attraverso il grado di interpolazione matematica con la quale vengono create le forme geometriche. Tanto più piccoli sono i triangoli tanto più dettagliata è la superficie. Di contro un grado di interpolazione troppo elevato tende, in presenza di interconnessione spaziale dei voxels bassa, a frammentare il volume più del necessario. Analisi quantitativa delle immagini Quali informazioni di base possiamo estrarre? Qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente : Dimensioni Volume Spostamento Superficie Forma Diametri Distanze tra comparti Sfericità Segnale Intensità Distanze tra strutture Posizione Baricentro X Y Z Altro . . Analisi quantitativa delle immagini Quali informazioni di base possiamo estrarre? Volume ricostruito Misure di distanza lineari e non tra punti nello spazio reale appartenenti al volume. Sezioni ortogonali Analisi quantitativa delle immagini Quali informazioni di base possiamo estrarre? Analisi quantitativa delle immagini Le misure di fluorescenza. Le iso superfici costituiscono il “guscio” che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini precisi. Struttura su canale n°3 Segnale canale n°1 Segnale canale n°2 Analisi quantitativa delle immagini Il processo di analisi Definizione delle Iso Superfici Divisione degli oggetti Classificazione delle strutture Selezione degli oggetti di interesse Analisi quantitativa delle immagini Il processo di analisi Studio interazioni dei comparti cellulari Distanza vescicole – Nuclei Colocalizatione delleVescicole (Intensità di un canale all‟interno del volume vescicolare) DistanzaVescicole–Membrana Numero di Vescicole per nucleo Densità delle vescicole per nucleo Numero di vescicole per cellula, Densità delle vescicole per cellule, , Volume delle vescicole per cellula Nuclei per Cellula Volume del Nucleo / Volume del Citoplasma Distanza media vescicole – Nuclei e vescicole vs Membrana Intensità delle vescicole per cellula Analisi quantitativa delle immagini Informazioni in movimento Valutazione del movimento delle strutture (variazione della posizione) rispetto al tempo ed allo spazio. Determinazione della direzione, velocità, accelerazione e tipologia del moto di ogni singolo oggetto. Quantificazione delle modifiche strutturali (Dimensioni) e chimiche (intensità del segnale) in relazione al tempo. Analisi quantitativa delle immagini Informazioni in movimento Browniano Connesso Autoregressivo ta r r tb r ta tc td te te tb tc E‟ importante conoscere la natura del moto degli oggetti per poter selezionare l‟algoritmo adeguato alla loro identificazione . r‘ Analisi quantitativa delle immagini Informazioni in movimento Editing delle tracce Correzione dei tracciati erroneamente calcolati . Separazione e collegamento di spezzoni di traccia. Analisi quantitativa delle immagini Informazioni in movimento Selezione (filtro) Statistica Rappresentazione Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di oggetti Iterazione proteina – proteina. Associazione spaziale di segnali Oggetti che risultano parzialmente in contatto o totalmente inseriti in altri oggetti. Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di oggetti Definizione della intensità del segnale utilizzata per costruire le Iso Superfici . Divisione degli oggetti tramite „region growing“ Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di oggetti Estrazione dei dati di intensità di fluorescenza della proteina “B” (canale verde) localizzata dentro i siti relativi alla proteina “A” (canale rosso). Classificazione per livello di intensità espresso. Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Valutazione del livello di sovrapposizione spaziale di due segnali fluorescenti aventi caratteristiche spettrali (lunghezze d‟onda) di emissione differenti. L’analisi della colocalizzazione richiede: 1. Basso livello di rumore 2. Segnali non saturati 3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleed through) 4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore) 5. Registrazione XY perfetta tra i due fluorocromi (shifting ottico) 6. Rimozione del fuori fuoco Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Obiettivo : calcolo di coefficienti statistici atti a valutare il grado di sovrapposizione dei segnali Tra i più utilizzati : Coefficiente di Pearson - Misura la sovrapposizione tra i pixel Coefficienti di Manders - Misura il contributo di sovrapposizione di un canale rispetto all‟altro Coefficiente di correlazione -Misura il grado di correlazione tra i due canali si considerano inoltre : Numero di voxel colocalizzati, volume sopra soglia colocalizzato, materiale sopra soglia materializzato.. Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale 17 pixel su 40 presenti sono colocalizzati. Dato significativo o casuale? La risposta attarverso il calcolo del coefficiente di probalibità Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale • • • • • P = 0.97% P = 0.55% Il coefficiente di correlazione di Pearson viene calcolato su uno dei due canali (PCC 1). Il secondo canale viene sottoposto ad un processo di smoothing (PSF size). Successivamente i pixel che compongono il secondo canale vengono riposizionati nella matrice in tutte le combinazioni possibili ed i rispettivi coefficienti di Pearson calcolati. Il coefficiente di Pearson del primo canale viene confrontato con la distribuzione dei coefficienti di Pearson calcolati sul secondo canale. Se il coefficiente di Pearson del primo canale non è superiore al 95% della distribuzione ottenuta sul secondo canale la probabilità che la colocalizzazione sia casuale è reale. L‟immagine deve essere scartata. Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Punto critico : definizione della soglia di colocalizzazione dei singoli canali • L„algoritmo proposto da Costes e Lockett (NCI/NIH) si basa sulla esclusione delle coppie di intensità che non mostrano correlazione (coefficiente di Pearson =< 0). • Partendo dalla coppia di valori di intensità più alti, l‟algoritmo procede verso il basso della scala di intensità lungo la linea di interpolazione calcolata. Il coefficiente di Pearson viene calcolato per tutti I valori al di sotto della soglia corrente . L‟algoritmo procede fino a quando il coefficiente di Pearson raggiunge il valore 0 (o diventa negativo). Canale A Interpolazione lineare dei valori Coefficiente di Pearson = 0 per valori di soglia inferiori a quelli impostati Canale B Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Canale A Interpolazione lineare dei valori Coefficiente di Pearson = 0 per valori di soglia inferiori a quelli impostati Canale B Analisi quantitativa delle immagini Il processo di analisi Analisi di filamenti •Misurazione dell‟albero dendritico •Identificazione delle spine e calcolo delle loro caratteristiche strutturali (volume, ect) •Diametro dei filamenti. •Statistica distribuzione spine •Orientamento dendriti •Analisi dei livelli dei branches (generazioni) •Classificazione spine Analisi quantitativa delle immagini Il processo di analisi Analisi di filamenti Analisi quantitativa delle immagini Apertura al mondo esterno Programma di analisi Piattaforme di calcolo Analisi quantitativa delle immagini Alcuni lavori scientifici e testi interessanti La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D IMARIS Immagini & Computer Snc Via Don Carlo Riva 4 Bareggio (Mi) GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE !
