Analisi quantitativa delle immagini

Università degli studi di Firenze
Dipartimento di Scienze Biochimiche
Viale G.B. Morgagni 50 - Firenze
Analisi quantitativa delle immagini
per applicazioni in Life Science
14 Gennaio 2011
Immagini & Computer S.n.c.
Via Don Carlo Riva 4
20010 Bareggio (Mi)
Analisi quantitativa delle immagini
“L’analisi quantitativa delle immagini rappresenta l’arte di trasformare
una sensazione visiva nella sua forma schematica e discreta consentendone
la descrizione, la classificazione e l’interpretazione matematica e logica
univoca delle sue componenti spaziali e temporali.”
Analisi quantitativa delle immagini
Quando e perché ?
 Quando serve una rappresentazione oggettiva del risultato.
 Quando dobbiamo condividere i risultati con altri.
 Quando ci è richiesta una ripetibilità nei risultati ottenuti.
 Quando …
 Perché risulta più professionale fornire numeri piuttosto che
impressioni.
 Perché ci consente di discutere e difendere i nostri dati.
 Perché possiamo rivedere e ripetere passo-passo il processo che ci ha
portato al risultato.
Perché ….
Analisi quantitativa delle immagini
Un significativo contributo alla diffusione di questa disciplina è stato fornito dalla enorme
disponibilità di strumenti digitali in grado di produrre informazioni in grande quantità.
Microscopia widefield
Microscopia confocale
Microscopia spettrale
Microscopia confocale 2 fotoni
Sistemi HCS
Investigazione contemporanea
in più dimensioni.
Elevata risoluzione spaziale
Esplorazione temporale
Complessità
Analisi quantitativa delle immagini
Il percorso per arrivare alle misure
Analisi quantitativa delle immagini
Il percorso ideale
Risultati
Misura
Trattamento
dell’immagine
Raccolta delle immagini
Marcatura adeguata delle strutture
Preparazione del campione
Analisi quantitativa delle immagini
Risulta quindi basilare
1. Fissare gli obiettivi che ci proponiamo
2. Studiare e definire i metodi di preparazione del campione
3. Studiare e definire i metodi ed i processi di acquisizione, trattamento ed analisi da
utilizzare (Protocolli di acquisizione ed analisi).
Assicurare per quanto possibile l‟indipendenza dei risultati dalla piattaforma utilizzata.
Analisi quantitativa delle immagini
Gli ostacoli sul percorso
Analisi quantitativa delle immagini
Errore, precisione ed accuratezza
Qualsiasi misurazione quantitativa è influenzata da potenziali errori.
• Gli errori possono derivare dal campione, dal sistema ottico (microscopio), dal sistema digitale di
acquisizione o dall‟operatore.
• Gli errori diminuiscono il livello di precisione della misura.
• L‟accuratezza della misura influisce sulla affidabilità della singola quantificazione.
Campioni biologici che
possiedono un livello
intrinseco di variabilità
Distinzione tra variabilità
naturale ed errori della
misurazione.
Necessità di effettuare una
sola misurazione
Capacità di identificazione e riduzione delle sorgenti di errore delle nostre misurazioni
Analisi quantitativa delle immagini
Principali sorgenti di errore
Marcatura adeguata delle strutture
Preparazione del campione
Sistema Ottico e di
acquisizione
Background
Rumore
Si aggiunge al reale segnale
e ne compromette la
quantificazione. Deve essere
sottratto al valore del
segnale.
Causa una variazione
(fluttuazione) del segnale
intorno al suo valore reale.
Il segnale deve risultare
significativamente più
elevato del rumore.
Degrado delle caratteristiche
dell’immagine originale.
Introduzione di aberrazioni
ottiche e di fenomeni di
diffrazione.
•Autofluorescenza.
•Fuori fuoco.
•Luce estranea
•Poisson noise (campione)
•Noise ottico
•Noise digitale (detector)
•Valutazione PSF
•Aberrazioni sferiche e cromatiche
•Disallineamento
•Artefatti
SNR
Rapporto segnale
rumore
Analisi quantitativa delle immagini
Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR)
Rappresenta il rapporto tra i disturbi presente nell‟immagine e l‟effettivo segnale.
Analisi quantitativa delle immagini
In un sistema di acquisizione basato su telecamera CCD
il Rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come:
SNR = PQet / [PQet + Dt + Nr2] 1/2
Dove P rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Qe l‟efficienza quantica del sensore, t il
tempo di integrazione (Secondi), D la Dark Noise (Elettroni/pixel/Secondo) e Nr il Read Out Noise.
Il segnale proveniente dal Background (Scatter o Riflessione) influisce sulla qualità del valore di SNR e
deve di conseguenza essere tenuto in considerazione nel calcolo.
SNR = PQet / [(P+B)Qet + Dt + Nr2] 1/2
In un sistema confocale il rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come:
Dove N rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Q il noise generato dal laser, S il Noise
secondario generato dalla moltiplicazione degli elettroni e D la dark current del PMT.
Analisi quantitativa delle immagini
Raccolta delle immagini
Ripristino delle caratteristiche
originali delle immagini.
Rimozione del rumore
Rilocazione della luce fuori
fuoco
Correzione degli artefatti
Decadimento (Photobleaching,ect)
Correzione disomogeneità fondo
Instabilità di illuminazione
Registrazione
Mosaicatura
Identificazione delle strutture
Segmentazione
Distinzione da altre strutture
Codifica dei confini e misura
Classificazione
Pubblicazione
Evoluzione e comportamento
delle strutture
Tracking
Cinetica
Ratio Imaging
Data Mining
Simulazione evento
Creazione modello
Analisi dei dati
Analisi quantitativa delle immagini
La raccolta delle immagini
Analisi quantitativa delle immagini
La raccolta delle immagini richiede una serie di accorgimenti quali :
 Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z
 Adeguata considerazione della dinamica del segnale (rappresentazione dell‟evento)
 Corretta definizione dei parametri operativi (potenza del laser, esposizione della
telecamera, impostazione PMT, livello di illuminazione del campione)
 Qualità della ripresa
 Corretta (e strutturata) memorizzazione delle immagini
Standardizzazione del processo
[Protocollo di acquisizione]
Analisi quantitativa delle immagini
Come archiviare le immagini.
Importante considerare la finalità per la quale si vuole archiviare l’immagine.
1. Documentazione
Soddisfatta la qualità visiva, le dimensioni del file rappresentano il principale
obiettivo.
I formati compressi con perdita di informazioni (Jpeg, Jpeg2000, ect) sono
ampiamente giustificati.
2. Analisi successiva
Necessità di preservare le informazioni originali contenute nell’immagine.
In questo caso sono da preferire i formati lineari non compressi o con compressioni
di tipo “lostless” (Tiff, Bmp, ect) oppure i formati proprietari degli strumenti.
No a formati “ibridi” (quali il Tiff - Palette)
Analisi quantitativa delle immagini
I danni introdotti dai sistemi di
compressione ad alta efficienza (Jpeg,
Jpeg2000, ect) non sono
immediatamente percettibili.
Essi si manifestano sotto forma di
“pixellatura” artificiale dell’immagine.
Analisi quantitativa delle immagini
I singoli pixel subiscono una modifica in termini di contenuto cromatico e/o di
intensità/densità. Tale variazione può introdurre un errore di valutazione importante
(5% - 10%) direttamente rapportato al coefficiente di compressione utilizzato.
TIFF
JPEG
Differenza
assoluta
Analisi quantitativa delle immagini
Dinamica del segnale
La dinamica del segnale descrive l‟escursione relativa
della intensità del segnale fluorescente in osservazione
(valore massimo – valore minimo).
Espresso come “Flusso di Fotoni “(fotoni / unità di sup. / Sec.)
Il processo di conversione digitale effettua una
“scomposizione” del segnale fluorescente utilizzando
una scala numerica con una quantità predeterminata
di valori (Livelli di Grigio).
Continuo
Discreto
Immagine digitale
Scala a Livelli di Grigio
Analisi quantitativa delle immagini
Dinamica del segnale
Condizione teorica ottimale :
1f = 1 gl
scala di grigio compresa tra 0 ed Infinito.
In realtà la dinamica digitale del segnale è una caratteristica del dispositivo di acquisizione utilizzato
Per i sensori CCD esso è funzione del rapporto tra la capacità di
immagazzinamento dei fotoni (FWC) propria delle singole celle
ed il contributo dei rumori intrinseci (ReadNoise, Termalnoise,
ect) da esso generati.
Esempio : Consideriamo un CCD con FWC pari a 40.000 e con un Noise di
12 e . Il relativo RDD risulta :
GrayLevels= 40.000 / 12 = 3.333 [12 bit (4.096 GrayLevels)]
L’efficienza di conversione definisce il numero di fotoni descritto
dal singolo livello di grigio.
EC = FWC / GL (- Offset)
EC = 40.000 / 4096 = 9.7656 f
FWC inversamente
proporzionale alle dimensioni
della singola cella CCD.
Analisi quantitativa delle immagini
Dinamica del segnale
Nel caso di sensori PMT utilizzati nei sistemi confocali, a causa del basso flusso di fotoni (Pin Hole), la
dinamica digitale del segnale risulta funzione del solo segnale.
Non confondere dinamica digitale del segnale con il formato file.
Sfruttiamo al meglio la dinamica del segnale evitando, per quanto possibile, la saturazione di parti
dell‟immagine.
Analisi quantitativa delle immagini
Campionamento e densità
La densità di campionamento rappresenta il numero di unità digitali di base (pixel o
voxel) catturate per unità di superfice / volume.
Essa definisce la connessione diretta tra le unità digitali (voxel) ed il reale volume dello
spazio fisico.
La densità di campionamento è direttamente derivata dai parametri caratteristici del
sistema ottico (PSF) e non può essere modificata dopo l‟acquisizione del volume.
La Point Spread Function (PSF) rappresenta “il mattone” sul quale l‟immagine viene
costruita. Risulta quindi basilare registrare i dettagli in essa contenuti con la stessa scala
della PSF.
PSF
Image Restoration
Analisi quantitativa delle immagini
Campionamento e densità
Il valore di campionamento critico, al di sotto del quale il processo di acquisizione può
produrre artefatti (frange di diffrazione), è calcolato utilizzando la formula di Nyquist.
“La frequenza di campionamento di un segnale (Analogico ->Digitale) deve risultare più
grande del doppio della banda passante del segnale originale in modo da garantirne la
perfetta ricostruzione digitale.”
Calcolo Z secondo Nyquist
Δz = λem / (2 N (1- cos α))
Λem = emission wavelenght
N = medium index
α = ½ angolo apertura obiettivo
Calcolo XY secondo Nyquist
Δxy = λem / (4 N sen α)
In pratica
Λem = 520nm
N = 1.515
NA = 1.3
α = αrcsen(NA/N)
Δz = 520 /(2*1.515*(1-cos α))
Δz = 353 nm
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione
Analisi quantitativa delle immagini
Le molteplici risoluzioni di un sistema
A. Risoluzione Ottica : limite di discriminazione tra due oggetti adiacenti. Determinato
dalla apertura numerica dell’obiettivo e dalla lunghezza d’onda di emissione della luce.
B. Risoluzione spaziale : limite di discriminazione del sensore CCD. Determinato dalle
dimensioni della singola cella del sensore e dall’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato.
C. Risoluzione Immagine : caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero
di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine.
Analisi quantitativa delle immagini
La risoluzione Ottica.
La risoluzione ottica del microscopio è funzione della :
• lunghezza d’onda della luce utilizzata;
• apertura numerica (N.A.) dell’obiettivo.
La risoluzione ottica del microscopio NON dipende da:
• ingrandimento dell’obiettivo
Secondo la formula generale ->R = 0,61 λem/ N.A.
dove N.A.= n sen a (Formula descritta per la prima volta da Ernest
Abbe e Carl Zeiss)
Si consideri che:
• Maggiore e’ l’angolo (N.A.) con cui l’obiettivo è in gradodi
raccogliere la lucemaggiore è ilpoteredirisoluzione
•Maggiore è N.A. minore è la distanzadilavoro
Per obiettivi in aria a è sempre minore di 90°
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione spaziale & Risoluzione discriminante
La risoluzione spaziale
rappresenta la dimensione,
espressa in unità metriche, del più
piccolo oggetto, proiettato sul
piano di fuoco, identificabile come
tale dal sistema di acquisizione.
La risoluzione discriminante rappresenta
la distanza minima, espressa in unità
metriche, che deve intercorrere tra due
oggetti proiettati sul piano di fuoco, e ben
contrastati tra loro, per poter essere
identificati come tali dal sistema di
acquisizione.
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione spaziale
In presenza di un dispositivo CCD, la risoluzione spaziale risulta
funzione delle dimensioni della singola cella del sensore (pixel
size) e del’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato secondo la
formula:
Rs= (Pixel size / Ingrandimento obiettivo)
In presenza di un dispositivo PMT confocale, la risoluzione
spaziale risulta funzione delle dimensioni Pin Hole
utilizzato (Airy unit), dal fattore di ingrandimento (zoom) e
dal numero di pixels utilizzati per la matrice di
acquisizione.
L‟impostazione di questi parametri è strettamente
dipendenti dai valori di densità di campionamento calcolati
utilizzando la formula di Nyquist.
4.6 um
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione discriminante
A causa delle caratteristiche fisiche del sensore CCD, due oggetti devono distare almeno di un pixel tra
loro per poter essere discriminati come tali.
Rd = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3)
Esempio : Pixel size = 6.4 um, Ingrandimento = 100x
Risoluzione spaziale = (6.4 / 100) = 0.064 um -> (Pixel size / Ingrandimento)
Risoluzione Discriminante = ((6.4 / 100) * 2.3) = 0.147 um -> (Pixel size / Ingrandimento) * 2.3
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione Immagine
Caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che
formano l’immagine.
Da non confondere con i DPI.
1024 x 768 pixel
2048 x 1536 pixel
Analisi quantitativa delle immagini
Artefatti & affini
Analisi quantitativa delle immagini
Principali sorgenti di errore
Artefatti
Sistema Ottico e di
acquisizione
Rumore
Campione
Si aggiunge al
reale segnale e ne
compromette la
quantificazione.
Causa una
variazione
(fluttuazione) del
segnale intorno al
suo valore reale.
Decadimento delle
caratteristiche del
segnale.
Degrado delle
caratteristiche
dell’immagine
originale.
•Autofluorescenza.
•Fuori fuoco.
•Luce estranea
•Poisson noise
(campione)
•Noise ottico
•Noise digitale
(detector)
•Photobleaching
•Quencing
• etc.
•Valutazione PSF
•Aberrazioni
sferiche e
cromatiche
•Disallineamento
•Artefatti
Background
Analisi quantitativa delle immagini
Quencing : generato da processi che producono il passaggio degli elettroni dallo stato di eccitazione a
quello di riposo senza emissione di luce. Questi processi competono con i classici processi fluorescenti
riducendone il LIFETIME e la QY (emissione quantica) del fluoroforo utilizzato. Il processo di
Quencing è reversibile.
Photobleaching : Perdita permanente della capacità di
emettere elettroni da parte del fluoroforo a causa di un
danno chimico indotto. Una delle cause principali del
Photobleaching è l‟interazione del fluoroforo con luce ed
ossigeno (distruzione molecole fluorescenti con creazione
di radicali liberi che interagiscono con altre molecole
presenti nelle cellule).
Tale effetto può essere contenuto riducendo la quantità di
luce utilizzata per l‟eccitazione ed aggiungendo al media di
montaggio appositi preparati Antifading.
Il processo di Photobleaching non è reversibile.
Fluoroforo : FITC
Sorgente di eccitazione : HBO 100W
Esposizione : 30sec
Perdita del 50% del segnale
Analisi quantitativa delle immagini
Photobleaching
Perdita progressiva della capacità di un fluoroforo di emettere fotoni in risposta ad uno stimolo
luminoso. La continua e prolungata esposizione ad una sorgente di eccitazione porta alla completa
estinzione della molecola fluorescente.
T = 0 sec
T = 15 sec
T = 30 sec
Analisi quantitativa delle immagini
Correzione degli artefatti
Decadimento del segnale
La procedura corregge le differenze di intensità di segnale causate dal
degrado della sonda fluorescente nel corso del tempo
(timelapse o volume 3D).
Correzione Background
Elimina i difetti dovuti alla disomogeneità del campo illuminato
(disallineamento lampada, ect)
Disomogeneità di illuminazione
La procedura corregge le differenze di intensità di segnale causate dalla
non perfetta stabilità della sorgente di illuminazione (Flickering)
Analisi quantitativa delle immagini
Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini
La convoluzione è il processo ottico di creazione dell‟immagine. Esso
introduce artefatti di vario genere con la conseguente degradazione
dell‟immagine.
1. Rumore
2. Aberrazioni (sferiche e cromatiche)
3. Errata localizzazione della luce (sfocatura)
A causa della profondità di campo dell‟obiettivo utilizzato, la luce
proveniente dai piani di fuoco adiacenti a quello principale fornisce il
proprio contributo nella formazione dell‟immagine.
Analisi quantitativa delle immagini
Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini
La profondità di campo è funzione principalmente della apertura numerica
della lente e della lunghezza d‟onda di emissione della luce utilizzata. La
profondità di campo può essere espressa come :
DoF = λn/NA2 + (n/M×NA)e
Bkg
Segnale
S/N
801
1394
1.74
189
1318
6.97
Prima conseguenza evidente è rappresentata dalla riduzione della risoluzione e del rapporto segnale /
rumore all‟interno dell‟immagine.
Analisi quantitativa delle immagini
Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini
ImageRestoration
insieme di procedure e funzioni atte al recupero di un
segnale (immagine) nella sua forma originale.
Deconvoluzione 3D
operazione matematica utilizzata per recuperare
un segnale degradato da un processo fisico.
Filtri spaziali lineari e non
Filtri in domini di frequenza (FFT)
Nessuna alterazione dell‟immagine
(analisi quantitativa)
Analisi quantitativa delle immagini
Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini
Per ridistribuire correttamente la luce è necessario conoscere a priori il modello fisico che regola la
diffusione della stessa nel sistema ottico in uso (descrittore della funzione di convoluzione). Tale
modello fisico è conosciuto come PSF o Point Spread Function.
Analisi quantitativa delle immagini
Semplificare le informazioni
Analisi quantitativa delle immagini
Quale è la nostra base di partenza?
• Circa 1/3 del cervello umano elabora informazioni visive
• Percezione visiva dipende dal modo in cui vengono elaborate le informazioni luminose prodotte da fotoni che
colpiscono la retina
• Elaborazioni diverse permettono di percepire aspetti diversi della visione: forme, colore, movimento, profondità.
• Elaborazione molto veloce e complessa : percezione simultanea di dettagli e di aspetti globali dell‟immagine.
Visione
Valutazione
Comprensione della scena
Conoscenza
Informazioni
Le principali prerogative del sistema visivo umano sono la rapidità di interpretazione, la capacità di adattamento alle
variazioni presenti nella scena rispetto al modello noto e la possibilità di incrementare la conoscenza.
Analisi quantitativa delle immagini
Quale è la nostra base di partenza?
Immagine Ottica campione
Sensore (CCD, PMT)
Fotoni convertiti in una
grandezza fisica
proporzionale (ma non
uguale) al numero dei
fotoni rilevati.
Matrice bidimensionale di pixel
ognuno dei quali rappresenta
una specifica area del
campione
I livelli di grigio espressi dai
singoli pixel rappresentano il
numero di fotoni presenti nella
corrispondente area / volume
del campione
Analisi quantitativa delle immagini
Semplificare per identificare
Proprietà dei pixel :
• Intensità (luminosità)
• Coordinate spaziali X,Y
• Identità ed iterazione con pixel adiacenti
E‟ evidente la difficoltà nell‟assegnare, sulla
sola base delle proprietà sopra indicate, i
singoli pixel ad una specifica classe di
appartenenza (filamento, nucleo, membrana,
fondo ect)
Analisi quantitativa delle immagini
Identificazione delle strutture
Metodi strettamente dipendenti dalle
caratteristiche delle strutture da identificare
Preservare il contenuto informativo
Segmentazione
Manipolazione
dell’immagine
Region Growing
Binarizzazione
Riconoscimento contorni
(Edge detection)
Analisi quantitativa delle immagini
Riconoscimento dei contorni
Si definisce contorno (edge) una forte variazione locale dei livelli di grigio tipicamente associata al
bordo di una regione od al confine di separazione tra due regioni adiacenti.
Per rilevare i contorni si ricorre al calcolo del gradiente di intensità, ovvero alla valutazione delle
variazione dei livelli di grigio, ed al suo orientamento nell‟intorno del bordo da definire.
Uno degli algoritmi più conosciuti è il LoG (Laplace ofGaussian) che determina il gradiente attraverso il
calcolo della derivata seconda dei livelli di grigio.
L‟area racchiusa dal contorno è
riempita con un solo valore di
grigio e considerata struttura
(oggetto).
Analisi quantitativa delle immagini
Riconoscimento dei contorni
Il contorno può risultare chiuso ed identificare una specifica regione dell‟immagine (oggetto) oppure
aperto e definirne solo una parte del confine. Uno dei principali motivi della mancata chiusura dei
bordi è da ricondurre al basso contrasto esistente tra regioni dell‟immagine (es fondo ed oggetto).
Anche la presenza di rumore sull'immagine (basso SNR) è causa di difficoltà nella rilevazione dei
contorni (generazione di falsi bordi).
Immagine
Edge detection & linking
Binarizzazione
Ogni area racchiusa dal un contorno
è riempita con un solo valore di
grigio e considerata struttura
(oggetto).
Analisi quantitativa delle immagini
Segmentazione
Tipicamente si tende a distinguere il fondo
(background) dalle strutture di interesse.
All„interno dell„intervallo di grigi si trova
l„oggetto, all„esterno il fondo.
Le tecniche di segmentazione sono sensibili ai vari artefatti presenti nell‟immagine (rumore, disomogeneità, ect).
In presenza di strutture caratterizzate da intensità di fluorescenza differenti un unico intervallo di grigi non consente
una perfetta identificazione delle stesse.
Analisi quantitativa delle immagini
Segmentazione Adattiva
Le tecniche di segmentazione adattiva permettono di calcolare l„intervallo di grigio adeguato ad una
zona specifica dell„immagine in funzione delle caratteristiche locali del segnale (valutazione statistica).
E‟ possibile dividere l‟immagine in aree irregolari in base alle caratteristiche di omogeneità espresse
localmente dal segnaledi segnale.
Analisi quantitativa delle immagini
Segmentazione
Tutti i pixel compresi nell‟intervallo di grigi definito e confinanti tra loro vengono assegnati alla stessa
struttura.
In questo caso le strutture vengono create accorpando tutte
le aree tra loro confinanti secondo criteri impostati
dall‟operatore .
Tali criteri sono basati su caratteristiche morfologiche,
statistiche, di tessitura della superficie o di omogeneità di
segnale.
Analisi quantitativa delle immagini
Crescita delle regioni (Region Growing)
Proposto da Haralick, fa uso di descrittori statistici. Si basa sulla progressiva aggregazione di pixel in
regioni connesse. Tale aggregazione avviene sulla base di uno o più criteri di similarità.
Originale
Massimo locale
Crescita delle regioni
Definizione strutture
Partendo da un punto qualsiasi dell‟immagine (massimo o minimo locale) vengono aggregati tutti i pixel
del suo vicinato che soddisfano i parametri statistici assegnati (es. media e varianza).
La regione viene considerata completa (e non cresce più) quando tutti i pixel sono stati classificati
(come aggiunta si possono valutare alcuni criteri ad essa associati (forma, dimensione, ect) oppure
incontra un‟altra regione in crescita. La procedura è ripetuta per ogni punto aggiunto e le statistiche
della regione vengono aggiornate ciclicamente.
Analisi quantitativa delle immagini
Estrazione delle informazioni
Analisi quantitativa delle immagini
Estrazione delle informazioni
Possiamo ottenere qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente :
Dimensioni
Area
Perimetro
Diametri
Forma
Posizione
Roundness
Aspect ratio
Centroide XY
Analisi quantitativa delle immagini
Estrazione delle informazioni
Possiamo ottenere grandezze fisiche che descrivono il segnale presente :
Intensità del segnale
Variazione di segnale
Distribuzione di segnale
Analisi quantitativa delle immagini
Le misure di fluorescenza e la calibrazione.
Corretto il confronto tra strutture
appartenenti allo stesso campo
Incorretto il confronto diretto tra strutture appartenenti
a campi / campioni differenti a causa delle:
• Impostazioni del sistema di acquisizione. (esposizione, eccitazione, ect)
• Stato del campione.(photobleaching, quencing, ect)
• Rumore, disomogeneità nella distribuzione del segnale, fuori fuoco, ect
• Condizioni ambientali
Analisi quantitativa delle immagini
Le misure di fluorescenza e la calibrazione.
Una delle possibili soluzioni consiste nel legare la misura di interesse con un riferimento che possa
esprimere le eventuali variazioni dovute alle condizioni esterne al campione.
•Livello del fondo
•Auto fluorescenza dei tessuti circostanti
•Segnali provenienti da strutture non influenzate dalle condizioni sperimentali
Linea cellulare nota inserita nel processo di analisi
Misure raziometriche (Ca2+)
Cellule non caricate e caricate a saturazione
Caso reale
Intensità dei telomeri normalizzata con intensità
centromero prima del loro confronto.
Entrambi marcati utilizzando lo stesso dye.
Analisi quantitativa delle immagini
Le misure di fluorescenza e la calibrazione.
La calibrazione del sistema di acquisizione garantisce la ripetibilità delle misure
100%
Intensità
relativa
33%
Intensità
relativa
10%
Intensità
relativa
3%
Intensità
relativa
0.667%
Intensità
relativa
Analisi quantitativa delle immagini
3D: il mondo reale
Analisi quantitativa delle immagini
Quale è la nostra base di partenza?
3 Dimensioni
Immagine Ottica campione
Sensore (CCD, PMT)
Fotoni convertiti in una
grandezza fisica
proporzionale (ma non
uguale) al numero dei
fotoni rilevati.
Matrice tridimensionale di
voxel ognuno dei quali
rappresenta uno specifico
volume del campione .
I livelli di grigio espressi dai
singoli voxel rappresentano il
numero di fotoni presenti nella
corrispondente volume del
campione .
Analisi quantitativa delle immagini
Semplificare per identificare
Proprietà dei voxel :
• Intensità (luminosità)
• Coordinate spaziali X,Y e Z
• Identità ed iterazione con voxel adiacenti
E‟ evidente la difficoltà nell‟assegnare, sulla
sola base delle proprietà sopra indicate, i
singoli voxel ad una specifica classe di
appartenenza (filamento, nucleo, membrana,
fondo ect)
Iso Superficie
Analisi quantitativa delle immagini
Costruzione delle Iso Superfici
Le iso superfici rappresentano l‟equivalente 3D degli iso contorni. Entrambe descrivono una parte di
volume, o di una area bidimensionale, all‟interno del quale tutti i punti (voxel) presenti possiedono un
valore eguale tra loro o compreso in un intervallo definito
Iso Superficie
Iso Contorno
Le iso superfici non hanno solo una valenza estetica ma risultano essenziali per la quantificazione del
volume. Esse costituiscono il “guscio” che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini precisi.
Analisi quantitativa delle immagini
Identificazione delle strutture
Metodi strettamente dipendenti dalle
caratteristiche delle strutture da identificare
Preservare il contenuto informativo
Manipolazione
dell’immagine
Region Growing
Segmentazione
Iso Superficie
Analisi quantitativa delle immagini
Costruzione delle Iso Superfici
1. Selezione dell‟intervallo di intensità del
segnale (livelli di grigio) da descrivere
attraverso la Iso Superficie.
3. Trasformazione visiva della
struttura complessa attraverso il
loro riempimento.
2. Creazione matematica di una struttura
complessa di forme geometriche (triangoli)
che descrivono la superficie esterna del
volume.
Analisi quantitativa delle immagini
Costruzione delle Iso Superfici
Il livello di precisione nella ricostruzione della superficie è gestito attraverso il grado di interpolazione
matematica con la quale vengono create le forme geometriche.
Tanto più piccoli sono i triangoli tanto più dettagliata è la superficie.
Di contro un grado di interpolazione troppo elevato tende, in presenza di interconnessione spaziale dei
voxels bassa, a frammentare il volume più del necessario.
Analisi quantitativa delle immagini
Quali informazioni di base possiamo estrarre?
Qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente :
Dimensioni
Volume
Spostamento
Superficie
Forma
Diametri
Distanze tra comparti
Sfericità
Segnale
Intensità
Distanze tra strutture
Posizione
Baricentro X Y Z
Altro . .
Analisi quantitativa delle immagini
Quali informazioni di base possiamo estrarre?
Volume ricostruito
Misure di distanza lineari e non tra punti
nello spazio reale appartenenti al volume.
Sezioni ortogonali
Analisi quantitativa delle immagini
Quali informazioni di base possiamo estrarre?
Analisi quantitativa delle immagini
Le misure di fluorescenza.
Le iso superfici costituiscono il “guscio” che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini
precisi.
Struttura su canale n°3
Segnale canale n°1
Segnale canale n°2
Analisi quantitativa delle immagini
Il processo di analisi
Definizione delle Iso Superfici
Divisione degli oggetti
Classificazione delle strutture
Selezione degli oggetti di interesse
Analisi quantitativa delle immagini
Il processo di analisi
Studio interazioni dei comparti cellulari

Distanza vescicole – Nuclei

Colocalizatione delleVescicole
(Intensità di un canale all‟interno del volume vescicolare)

DistanzaVescicole–Membrana

Numero di Vescicole per nucleo

Densità delle vescicole per nucleo

Numero di vescicole per cellula, Densità delle vescicole per
cellule, , Volume delle vescicole per cellula

Nuclei per Cellula

Volume del Nucleo / Volume del Citoplasma

Distanza media vescicole – Nuclei e vescicole vs Membrana

Intensità delle vescicole per cellula
Analisi quantitativa delle immagini
Informazioni in movimento
Valutazione del movimento delle strutture
(variazione della posizione) rispetto al tempo
ed allo spazio.
Determinazione della direzione, velocità,
accelerazione e tipologia del moto
di ogni singolo oggetto.
Quantificazione delle modifiche strutturali
(Dimensioni) e chimiche (intensità del
segnale) in relazione al tempo.
Analisi quantitativa delle immagini
Informazioni in movimento
Browniano
Connesso
Autoregressivo
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tb
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E‟ importante conoscere la natura del moto degli oggetti per poter selezionare l‟algoritmo adeguato alla loro
identificazione .
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Analisi quantitativa delle immagini
Informazioni in movimento
Editing delle tracce
Correzione dei tracciati erroneamente calcolati .
Separazione e collegamento di spezzoni di traccia.
Analisi quantitativa delle immagini
Informazioni in movimento
Selezione (filtro)
Statistica
Rappresentazione
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di oggetti
Iterazione proteina – proteina.
Associazione spaziale di segnali
Oggetti che risultano parzialmente
in contatto o totalmente inseriti in
altri oggetti.
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di oggetti
Definizione della intensità del segnale utilizzata per costruire le Iso Superfici .
Divisione degli oggetti tramite „region growing“
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di oggetti
Estrazione dei dati di intensità di fluorescenza della proteina “B” (canale verde) localizzata dentro i siti
relativi alla proteina “A” (canale rosso).
Classificazione per livello di intensità espresso.
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di segnale
Valutazione del livello di sovrapposizione spaziale di due segnali fluorescenti aventi caratteristiche
spettrali (lunghezze d‟onda) di emissione differenti.
L’analisi della colocalizzazione richiede:
1. Basso livello di rumore
2. Segnali non saturati
3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleed through)
4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore)
5. Registrazione XY perfetta tra i due fluorocromi (shifting ottico)
6. Rimozione del fuori fuoco
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di segnale
Obiettivo : calcolo di coefficienti statistici atti a valutare il grado di sovrapposizione dei segnali
Tra i più utilizzati :
Coefficiente di Pearson - Misura la sovrapposizione tra i pixel
Coefficienti di Manders - Misura il contributo di sovrapposizione di un canale rispetto all‟altro
Coefficiente di correlazione -Misura il grado di correlazione tra i due canali
si considerano inoltre :
Numero di voxel colocalizzati, volume sopra soglia colocalizzato, materiale sopra soglia materializzato..
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di segnale
Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale
17 pixel su 40 presenti sono colocalizzati.
Dato significativo o casuale?
La risposta attarverso il calcolo del
coefficiente di probalibità
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di segnale
Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale
•
•
•
•
•
P = 0.97%
P = 0.55%
Il coefficiente di correlazione di Pearson
viene calcolato su uno dei due canali (PCC 1).
Il secondo canale viene sottoposto ad un
processo di smoothing (PSF size).
Successivamente i pixel che compongono il
secondo canale vengono riposizionati nella
matrice in tutte le combinazioni possibili ed i
rispettivi coefficienti di Pearson calcolati.
Il coefficiente di Pearson del primo canale
viene confrontato con la distribuzione dei
coefficienti di Pearson calcolati sul secondo
canale.
Se il coefficiente di Pearson del primo canale
non è superiore al 95% della distribuzione
ottenuta sul secondo canale la probabilità
che la colocalizzazione sia casuale è reale.
L‟immagine deve essere scartata.
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di segnale
Punto critico : definizione della soglia di colocalizzazione dei singoli canali
•
L„algoritmo proposto da Costes e Lockett
(NCI/NIH) si basa sulla esclusione delle
coppie di intensità che non mostrano
correlazione (coefficiente di Pearson =< 0).
•
Partendo dalla coppia di valori di intensità
più alti, l‟algoritmo procede verso il basso
della scala di intensità lungo la linea di
interpolazione calcolata. Il coefficiente di
Pearson viene calcolato per tutti I valori al di
sotto della soglia corrente . L‟algoritmo
procede fino a quando il coefficiente di
Pearson raggiunge il valore 0 (o diventa
negativo).
Canale A
Interpolazione
lineare dei valori
Coefficiente di Pearson = 0
per valori di soglia inferiori a
quelli impostati
Canale B
Analisi quantitativa delle immagini
Colocalizzazione di segnale
Canale A
Interpolazione
lineare dei valori
Coefficiente di Pearson = 0
per valori di soglia inferiori a
quelli impostati
Canale B
Analisi quantitativa delle immagini
Il processo di analisi
Analisi di filamenti
•Misurazione dell‟albero dendritico
•Identificazione delle spine e calcolo delle loro caratteristiche
strutturali (volume, ect)
•Diametro dei filamenti.
•Statistica distribuzione spine
•Orientamento dendriti
•Analisi dei livelli dei branches (generazioni)
•Classificazione spine
Analisi quantitativa delle immagini
Il processo di analisi
Analisi di filamenti
Analisi quantitativa delle immagini
Apertura al mondo esterno
Programma di analisi
Piattaforme di calcolo
Analisi quantitativa delle immagini
Alcuni lavori scientifici e testi interessanti
La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D IMARIS
Immagini & Computer Snc
Via Don Carlo Riva 4
Bareggio (Mi)
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