Immobiline

Biochimica delle proteine
Prof. M. Bolognesi
a.a. 2006/2007
Eloise Mastrangelo
Elettroforesi monodimensionale
SDS-PAGE:
Sodio DodecilSolfato-PoliAcrilammide Gel Elettroforesi
™L elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di
™L`elettroforesi
SDS e` una delle tecniche piu` diffuse per l`analisi delle
proteine
™Permette di separare le singole specie proteiche di una
miscela complessa di proteine in funzione del loro peso
molecolare (o mobilita` relativa Mr), sottoforma di
bande discrete all`interno di un gel
Necessità di avere un supporto che non influenzi la migrazione
Gel di poliacrilammide
Monomeri di
acrilammide
NN’ metilenbisacrilammide
+
APS
TEMED
Polimerizzazione
Reazione di polimerizzazione
• La reazione di polimerizzazione avviene con l’aiuto di due
molecole che hanno la funzione di catalizzatori:
- Ammonio persolfato (APS)
-N,N,N’,N’- tetrametilanediamine (TEMED)
• La reazione comincia con la creazione di radicali liberi.
liberi
Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato
per ottenere un radicale libero che reagisce con un monomero
di acrilamide
il id cominciando
i i d la
l polimerizzazione
li
i
i
• Di fondamentale importanza non ossigenare la soluzione
essendo l’ossigeno
l ossigeno altamente reattivo con i radicali liberi
R• + M => RM•
RM• + M => RMM•
RMM• + M => RMMM•
Per evitare il contatto del gel in formazione con l`aria (la reazione di polimerizzazione e` inibita
dall`ossigeno!) la polimerizzazione viene fatta avvenire nell`intercapedine ricavata tra due lastre di
vetro opportunamente spaziate.
La dimensione
L
di
i
d ll maglie
delle
li puòò essere perfettamente
f
controllata
ll
conoscendo la concentrazione totale di acrilammide (T) e la
concentrazione del cross-legante
g
((C)) espressi
p
come p
percentuale.
gr acrilammide + gr bisacrilammide
x 100
%T =
ml della sol. di p
polimerizzazione
gr bisacrilammide
x 100
%C =
gr acrilammide + gr bisacrilammide
Agendo su T e su C cambiamo le dimensioni dei pori e quindi
possiamo migliorare la separazione
Mantenendo costante C e cambiando la concentrazione di T,
cambiamo in maniera inversa le dimensione dei pori
5%
7.5%
10%
12.5%
15%
Gel con pori di dimensioni ridotte (alta % T)
• Sono restrittivi per le proteine di grandi dimensioni,
dimensioni a tal punto
che alcune di esse possono anche non entrare nel gel.
• Migliorano la separazione delle proteine a basso peso
molecolare
l l
Gel con p
pori di ggrandi dimensioni ((bassa % T))
• Sono meno restrittivi per le proteine di grandi dimensioni, e ne
migliorano la separazione.
separazione
• Proteine a basso peso molecolare migrano con il fronte del gel
e non si separano
Scelta dell’intervallo di separazione
%T
%C
Range di Mr risolti
5
26
2.6
da 25.000
25 000 a 300.000
300 000
10
2.6
da 15.000 a 100.000
15
2.6
da 12.000 a 50.000
Con i gel a concentrazione fissa spesso non riusciamo a
separare in maniera ottimale tutte le proteine presenti
Gradiente
Per la separazione
p
di campioni
p
complessi
p
è vantaggioso
gg
utilizzare gradienti:
• Aumenta l’intervallo di separazione dei MW
• Separa sia proteine ad alto che a basso peso molecolare
Forma gradienti
Soluzione
al 20%
Soluzione
5%
Gel a gradiente
Scelta del gradiente
%T
%C
Range di Mr risolti
3.3-12
3.3
12
2.0
da 14.500 a 2.800.000
3-30
8.4
da 13.000 a 1.000.000
5-20
2.6
da 14.000 a 210.000
8-15
1.0
da 14.000 a 330.000
I polipeptidi migrano in presenza di un campo elettrico
sul supporto di acrilammide (gel) e sono separati in
base alla loro mobilità relativa (Mr) che in questo caso è
dipendente dal peso molecolare.
Mobilità relativa =
Distanza percorsa dalla proteina
Di
Distanza
percorsa dal
d l fronte
f
del
d l gell
Formula della velocità di migrazione di una
particella
i ll carica
i in
i un campo elettrico
l
i
v = zE
f
v = velocità di migrazione
z = carica della particella
E = campo elettrico
f = caratteristiche intrinseche della particella e del mezzo
z
E
v =
f
v = velocità di migrazione
z = carica della particella
E = campo elettrico
f = caratteristiche intrinseche della
particella e del mezzo
Affinché la separazione tenga conto solo delle
dimensioni della proteina bisogna che i polipeptidi
abbiano tutti la stessa carica e forma. Devono cioè
essere completamente denaturate.
Carica
SDS
• Detergente anionico forte che solubilizza quasi tutte le
proteine denaturandole
• Rompe
R
i legami
l
i idrogeno
id
e le
l interazioni
i t
i i idrofobiche
id f bi h
distruggendo le strutture secondarie e terziarie
• Fornisce alle proteina una carica netta costante per unità
di massa pari a 1.4 g SDS / 1 g proteina.
• "Maschera" la carica apportata
pp
dagli
g aminoacidi della
proteina.
gg
alla soluzione di p
polimerizzazione.
• Può essere aggiunto
Forma
Riducenti
• Distruggono i ponti disolfuro fra cisteine rendendo la
catena aminoacidica lineare, sono generalmente dei tioli
come il β-mercaptoetanolo
β
t t
l od
d il ditiotreitolo.
diti t it l
•Non possono essere aggiunti
gg
alla soluzione di
polimerizzazione in quanto inibiscono la polimerizzazione.
• Sfortunatamente
fenomeni
ossidativi
ovvero
di
riformazione dei ponti di solfuro possono accadere durante
la corsa
E necessario l’utilizzo di un marcatore per la
E`
visualizzazione della corsa delle proteine nel gel. Il
marcatore maggiormente impiegato è il Blu di
Bromofenolo (BB) che ha la caratteristica di essere carico
negativamente e di piccole dimensioni in maniera da
migrare con il fronte del gel. La corsa viene fermata
quando il Blu di Bromofenolo raggiunge la fine del gel.
Il Blu di Bromofenolo fa parte del tampone di lisi del
campione
Tampone di lisi è composto da:
Tris-HCl
SDS
β mercaptoetanolo
β-mercaptoetanolo
Glicerolo
BB
0.125 M, pH 6.8
2% (p/v)
5% (v/v)
10% (p/v)
0.001% (p/v)
Il campione è poi bollito per 5 min. prima di essere
caricato su gel
Buffer di corsa:
Tris
Glicina
SDS
3.0 g\l
14 4 g\l
14.4
1.0 g\l
Standard
Stacking gel
pH 6.8
Running gel
pH 8.8
applicazione della corrente
Stacking gel
Lo stacking gel ha il compito di permettere che le proteine del campione comincino la corsa effettiva
nel running gel in bande molto compatte aumentando la risoluzione della tecnica.
P ffare sii che
Per
h avvenga questo, lo
l stacking
k
gell ha
h una percentuale
l piùù bassa
b
di
d acrilamide
l
d
(comunemente il contenuto totale è 2-3%) e un pH 2 unità circa più basso del running gel.
_
pH
H+
+ acido
H+
H+
H+
E=IR
Cl-
pH
Cl-
Cl-
Cl-
+ basico
+
The macromolecular anions migrate
g
rapidly
p y until they
y reach the
region containing the stacking gel buffer ions. This effect causes the
macromolecular ions to approach the running gel as stacks of very
narrow bands according to their mobilities.
Colorazione con blu Coomassie o con Argento
Sensibilità del metodo
Blu Coomassie
⇒
bande contenenti 0.1 μg di proteina
Argento
⇒
bande contenenti 0.02 μg di proteina
KDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
Coomassie staining
Elettroforesi
f
bidimensionale
™Tecnica di elezione per lo studio del proteoma
™Consiste nell’accoppiare in maniera sequenziale due sistemi di
separazione.
separazione
Focalizzazione Isoelettrica
SDS – PAGE
™Separa i polipeptidi sulla base di due caratteristiche
chimico-fisiche
chimico
fisiche indipendenti: la carica e la massa
™Ha un elevato potere risolutivo
Focalizzazione Isoelettrica
I p
polipeptidi
p p
sono separati
p
in un ggradiente continuo di p
pH
dove migrano in base alla carica fino a raggiungere il proprio
punto isoelettrico (pI). Tutti i polipeptidi di una determinata
specie si concentreranno o focalizzeranno in un zona
estremamente ristretta, questa caratteristica rende la IEF
una tecnica ad elevata risoluzione.
elettroforesi in gradiente di pH (senza SDS)
si possono separare proteine che differiscono tra loro di una sola carica
Il punto isoelettrico (pI) è il valore di pH al quale una molecola
non reca alcuna carica elettrica netta.
Per un amminoacido avente un solo gruppo amminico ed un solo gruppo carbossilico, il valore di pI
può essere determinato dai valori della costante di dissociazione acida di ciascuno dei due gruppi
calcolandone la media
La costante di dissociazione acida è un valore che rappresenta, ad una data temperatura, il grado di dissociazione di un acido. Maggiore è la
costante,, maggiore
gg
è la tendenza dell'acido a dissociarsi,, maggiore
gg
è la sua "forza".
f
Data la reazione di dissociazione di un generico acido HA
la costante di dissociazione acida corrispondente viene calcolata come
Proteins are amphoteric molecules with acidic and basic
buffering groups (side chain).
–
–
–
–
In basic environment, the acidic groups become negatively
charged.
charged
In acidic environment, the basic groups become positively
charged.
g
The net charge of a protein is the sum of all charges.
Isoelectric point (pI): the pH where the charge of a protein
is zero.
Carica positiva
pH acido
Ç [H+]
Carica nulla
pI
Carica negativa
pH basico
È [H+]
Elettroforesi
f
bidimensionale
Focalizzazione isoelettrica
™ Permette di misurare il pI dei polipeptidi
™ Una tecnica all’equilibrio,
all equilibrio, indipendente da:
¾ sistema di applicazione del campione
¾ quantità di proteina caricata
¾ tempo
t
di corsa
™ Permette un’eccellente risoluzione di polipeptidi con pKa
che differiscono di 0.01 unità di pH o addirittura di 0.001 se
utilizziamo gradienti immobilizzati
Immobiline
Sono molecole con una struttura chimica simile a quella
dell’acrilammide che gli permette di polimerizzare e quindi
fissarsi alla matrice gelatinosa creando un gradiente di pH
immobilizzato (IPG).
Immobiline:
Acrilammide:
CH2=CH-CO-NH-R
CH2=CH-CO-NH2
R = un g
gruppo
pp carbossilico o
amminico
• Creano un gradiente immobilizzato
• Il gradiente preformato è altamente stabile nel tempo
• Una elevata capacità di carico (4-5 mg)
Immobiline
ii
I gel di immobiline sono
generalmente polimerizzati su
supporti di plastica (gel bond)
con una concentrazione di
acrilammide estremamente
b
bassa
3 4% . L
3-4%
La creazione
i
di
un gradiente con le appropriate
soluzioni di immobiline è
ottenuta con un forma gradienti
Soluzione
basica
Soluzione
acida
Immobiline
Esistono in commercio gel di immobiline che coprono svariati
range di pH. I gel sono venduti disidratati e congelati a –20°C
Range
ge di
d pH:
p :
3-10 L. e NL., 4-7, 6-11,
3.5-4.5, 4-5, 4.5-5.5, 5-6
Dimensioni:
7, 11, 18, 24 cm
I gradienti espansi e le dimensioni delle strisce di immobiline
producono una migliore risoluzione del campione da analizzare.
La scelta iniziale deve però cadere sul tipo di intervallo più
ampio
i e solo
l in
i seguito
it scegliere
li
i t
intervalli
lli più
iù stretti.
t tti
3-10
3
10 lineare (L)
3-10
3
10 Non lineare (NL)
Denaturante o nativa?
Denaturante
Proteine:
• Si p
presentano in un’unica conformazione
• Sono evitate le interazioni proteina-proteina
• Sono mantenute in soluzione
• pI teorici sono paragonabili a quelli sperimentalmente
ottenuti
Denaturazione
La soluzione di denaturazione non deve contenere sostanze che
possono influire sulla separazione ovvero molecole cariche o
ionizzabili.
• Urea
• Detergenti non ionici o zwitterionici
• Riducenti
Rid
ti
F
SDS-PAGE
Elettroforesi
f
bidimensionale
La prima dimensione è la focalizzazione isoelettrica
Campione
IPG strip
La seconda
L
d
dimensione è
SDS - PAGE
Gel di poliacrilamide
C
Campo
elettrico
l tt i
Elettroforesi
f
bidimensionale
Ogni polipeptide separato tramite 2D è riconducibile ad un punto in un
asse cartesiano dove le coordinate sono rispettivamente il pI e il Mr
Non-linear IPG 3-10
pH 3
pH 10
200
Mr
10
Potere risolutivo
dell’elettroforesi
bidimensionale
è il prodotto dei
poteri risolutivi
dell’ IEF e del
SDS-PAGE
Western Blot
/PVDF
PVDF:
Polyvinylidene fluoride
Western blots allow investigators to determine the molecular weight of a protein and to measure relative amounts of
the protein present in different samples.
_
+
1) Proteins are separated by gel electrophoresis, usually SDSPAGE (but also 2D gel).
2) The proteins are transfered to a sheet of special blotting paper
( it
(nitrocellulose
ll l
or PVDF).
PVDF) The
Th proteins
t i retain
t i the
th same
pattern of separation they had on the gel.
3) The blot is incubated with a generic protein (such as milk
proteins) to bind to any remaining sticky places on the
nitrocellulose. An antibody is then added to the solution
which is able to bind to its specific protein. The antibody has
an enzyme (e.g. alkaline phosphatase or horseradish
peroxidase)) or dye
p
y attached to it.
4) The location of the antibody is revealed by incubating it with a
colorless substrate that the attached enzyme converts to a
colored product that can be seen and photographed.
Cenni di proteomica
Genomica e Proteomica
•Genomica: sequenziamento del DNA presente in un
organismo e analisi dei geni (bioinformatica)
•Proteomica: analisi delle proteine di un organismo.
Quali proteine in un dato momento dello
sviluppo?
Come interagiscono tra di loro?
In quali localizzazioni cellulari sono presenti?
Quali sono le proprietà biofisiche,
biochimiche e strutturali di singole proteine
e/o complessi?
¾ Il termine proteomica indica lo studio di tutte le proteine espresse
da un organismo, tessuto o cellula in un preciso istante.
¾ La proteomica è una scienza più complessa della genomica. Molte
cellule di uno stesso organo
g
esprimono
p
p
proteine diverse e lo stesso tipo
p
cellulare in condizioni diverse (età, malattia, ambiente, ecc.) esprime
proteine differenti.
¾ La proteomica si avvale di metodologie specifiche: elettroforesi
bidimensionale, spettrometria di massa, analisi statistica.
¾ Il rapido
id sviluppo
il
d
della
ll proteomica
t
i in
i questi
ti ultimi
lti i annii ha
h tratto
t tt
vantaggio da metodi innovativi di spettrometria di massa che stanno
diffondendosi rapidamente, quali le tecniche “matrix-assisted laser
desorption ionization” (MALDI) e ‘“electrospray ionization” (ESI) in
combinazione con l’enorme quantità di “expressed tagged sequences”
(EST) disponibili nelle banche dati
dati.
¾La proteomica è una scienza con un approccio olistico: non dobbiamo fare ipotesi a priori sempre restrittive perché ci obbligano a focalizzare la nostra attenzione su una particolare proteina
o al massimo su uno specifico sistema. Piuttosto dobbiamo scegliere il sistema che ci interessa ed
analizzarlo in toto.
¾Il confronto fra un tessuto sano ed uno malato può infatti mostrare un gran numero di proteine
alterate.
¾L’identificazione di tutte queste proteine e della loro funzione ci permette a posteriori di
comprendere
p
il complesso
p
meccanismo di insorgenza
g
ep
progressione
g
di una malattia.
Up-regulation
Down-regulation
Loss
Control
•
•
•
•
Addition
Experimental
L'analisi dell'immagine permette l'identificazione degli spot
L'informazione può essere utilizzata per istruire un robot che taglia ciascuno spot
Gli spot vengono isolati e digeriti, ad esempio, con tripsina
L'analisi dei peptidi con MS permette l'identificazione delle proteine
Proteomics, like its precursor genomics, thus represents the emergence of a
new way of doing research that is not dependent on the testing of specific
models
d l off cellular
ll l behavior.
b h i This
Thi style
t l off science
i
obviously
b i l does
d
nott replace,
l
but rather will increasingly operate with traditional biological methods.
JOE SUTLIFF