in SDS - UniMI

Elettroforesi monodimensionale
SDS-PAGE:
Sodio
S
di DodecilSolfato-PoliAcrilammide
D d ilS lf t P liA il
id Gel
G l Elettroforesi
El tt f
i
™L elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di
™L`elettroforesi
SDS e` una delle tecniche piu` diffuse per l`analisi delle
proteine
™Permette di separare
p
le singole
g specie
p
p
proteiche di una
miscela complessa di proteine in funzione inversa
rispetto al loro peso molecolare (o mobilita` relativa Mr),
sotto forma di bande discrete all`interno di un gel
Necessità di avere un supporto che non influenzi la migrazione
f
fungendo
d d
da unico-esteso
i
t
setaccio
t i molecolare
l l
Gel di poliacrilammide
Monomeri di
acrilammide
NN’ metilenbisacrilammide
+
APS
TEMED
Polimerizzazione radicalica
Reazione di polimerizzazione
• La reazione di polimerizzazione avviene con l’aiuto di due
molecole che hanno la funzione di catalizzatori:
- Ammonio persolfato (APS)
-N,N,N’,N’- tetrametilenediamine (TEMED)
• La
L reazione
i
comincia
i i con la
l creazione
i
di radicali
di li liberi.
lib i
Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato
per ottenere un radicale libero che reagisce con un monomero
di acrilamide cominciando la polimerizzazione. Stabilizza
anche i radicali liberi.
• Di fondamentale importanza non ossigenare la soluzione
essendo O2 altamente reattivo verso i radicali liberi
R• + M => RM•
RM• + M => RMM•
RMM• + M => RMMM•
Per evitare il contatto del gel in formazione con l`aria (la reazione di polimerizzazione e` inibita
dall`ossigeno!) la polimerizzazione viene fatta avvenire nell`intercapedine ricavata tra due lastre di
vetro opportunamente spaziate.
La dimensione delle maglie del gel può essere controllata
conoscendo la concentrazione totale di acrilammide (T) e la
concentrazione
i
d l cross-legante
del
l
(C) espressii come percentuale.
l
gr acrilammide + gr bisacrilammide
x 100
%T =
ml della sol. di polimerizzazione
gr bisacrilammide
x 100
%C =
gr acrilammide + gr bisacrilammide
Agendo su T e su C cambiamo le dimensioni dei pori e quindi
possiamo migliorare la separazione
Es. mantenendo costante C e cambiando la concentrazione di
T, cambiamo in maniera inversa le dimensione dei pori
5%
7 5%
7.5%
10%
12 5%
12.5%
15%
Gel con pori di dimensioni ridotte (alta % T)
• Sono
S
restrittivi
t itti i per le
l proteine
t i di grandi
di dimensioni,
di
i i a tal
t l punto
t
che alcune di esse possono anche non entrare nel gel.
• Migliorano la separazione delle proteine a basso peso
molecolare
Gel con pori di grandi dimensioni (bassa % T)
• Sono meno restrittivi per le proteine di grandi dimensioni, e ne
migliorano la separazione.
• Proteine a basso peso molecolare migrano con il fronte del gel
e non si separano
Scelta dell’intervallo di separazione
%T
%C
Range di Mr risolti
5
2.6
da 25.000 a 300.000
10
2.6
da 15.000 a 100.000
15
2.6
da 12.000 a 50.000
Con i gel a concentrazione fissa spesso non riusciamo a
separare in maniera ottimale tutte le proteine presenti
Gradiente
Per la separazione di campioni complessi è vantaggioso
utilizzare gradienti:
• Aumenta l’intervallo
l intervallo di separazione dei MW
• Separa sia proteine ad alto che a basso peso molecolare
Forma gradienti
Soluzione
al 20%
Soluzione
5%
Gel a gradiente
Scelta del gradiente
%T
%C
Range di Mr risolti
3.3-12
2.0
da 14.500 a 2.800.000
3-30
8.4
da 13.000 a 1.000.000
5 20
5-20
26
2.6
da 14.000
14 000 a 210.000
210 000
88-15
15
1.0
da 14.000 a 330.000
I polipeptidi migrano in presenza di un campo elettrico
sul supporto di acrilammide (gel) e sono separati in
base alla loro mobilità relativa (Mr) che in questo caso è
dipendente dal peso molecolare.
Mobilità relativa =
Distanza percorsa dalla proteina
Distanza ppercorsa dal fronte del ggel
Formula della velocità di migrazione di una
particella carica in un campo elettrico
z
E
v =
f
v = velocità di migrazione
z = carica
i della
d ll particella
i ll
E = campo elettrico
f = caratteristiche intrinseche della particella e del mezzo
v = zE
f
v = velocità di migrazione
z = carica della particella
E = campo elettrico
l tt i
f = caratteristiche intrinseche della
particella e del mezzo
Affinché la separazione tenga conto solo delle
dimensioni della proteina bisogna che i polipeptidi
abbiano tutti la stessa carica e forma. Devono cioè
essere completamente denaturate.
denaturate
Carica
SDS
• Detergente anionico forte che solubilizza quasi tutte le
proteine denaturandole
• Rompe i legami idrogeno e le interazioni idrofobiche
distruggendo le strutture secondarie e terziarie
• Fornisce alle proteina una carica netta costante per unità
di massa pari a 11.4
4 g SDS / 1 g proteina (1 SDS/2 aa).
aa)
• "Maschera" la carica apportata dagli aminoacidi della
proteina.
proteina
• Tutte le molecole proteiche raggiungono una forma a
bastoncello, con un uguale rapporto carica/massa.
• Può essere aggiunto alla soluzione di polimerizzazione.
Riducenti
• Distruggono i ponti disolfuro fra cisteine rendendo la
catena
t
aminoacidica
i
idi
li
lineare,
sono generalmente
l
t dei
d i tioli
ti li
come il β-mercaptoetanolo od il ditiotreitolo.
•Non possono essere aggiunti alla soluzione di
polimerizzazione in quanto inibiscono la polimerizzazione.
• Sfortunatamente
fenomeni
ossidativi
ovvero
di
riformazione
if
i
d i ponti
dei
ti disolfuro
di lf
possono accadere
d
d
durante
t
la corsa
E` necessario l’utilizzo di un marcatore per la
visualizzazione della corsa elettroforetica nel gel. Il
marcatore maggiormente impiegato è il Blu di
Bromofenolo (BB) che ha la caratteristica di essere carico
negativamente e di piccole dimensioni in maniera da
migrare con il fronte del gel. La corsa viene fermata
quando il Blu di Bromofenolo raggiunge la fine del gel.
Il Blu di Bromofenolo fa parte del tampone di lisi del
campione
Tampone di lisi è composto da:
Tris-HCl
SDS
β-mercaptoetanolo
Glicerolo
BB
0.125 M, pH 6.8
2% (p/v)
5% (v/v)
10% (p/v)
0.001% (p/v)
Il campione è poi bollito per 5 min.
min prima di essere
caricato su gel
Buffer di corsa:
Tris
T
i
Glicina
SDS
pH
33.00 g\l
\l
14.4 g\l
1 0 g\l
1.0
8.8
Standard
Stacking gel
pH 6.8
Running gel
pH 8.8
88
applicazione della corrente
Stacking gel
Lo stacking gel ha il compito di permettere che le proteine del campione comincino la corsa effettiva
nel running gel in bande molto compatte aumentando la risoluzione della tecnica.
Per fare si che avvenga questo, lo stacking gel ha una percentuale più bassa di acrilamide
(comunemente il contenuto totale è 2-3%) e un pH 2 unità circa più basso del running gel.
_
pH
H+
+ acido
H+
H+
H+
E=IR
Cl-
pH
Cl-
Cl-
Cl-
+ basico
+
The macromolecular anions migrate rapidly until they reach the
region
i containing
t i i the
th stacking
t ki gell buffer
b ff ions.
i
This
Thi effect
ff t causes the
th
macromolecular ions to approach the running gel as stacks of very
narrow bands according to their mobilities.
Colorazione con blu Coomassie o con Argento
Sensibilità del metodo
Blu Coomassie
⇒
bande contenenti 0.1
0 1 μg di proteina
Argento
g
⇒
bande contenenti 0.01 μg di pproteina
KDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
Coomassie staining
Page
P
1493e
Voet Bioche
emistry
© 22004 John Wileey & Sons, Incc.
Logarithmic relationship between the molecular mass of a
protein and its relative electrophoretic mobility in SDSPAGE
- NB: dissociazione di oligomeri
Elettroforesi bidimensionale
™Tecnica di elezione per lo studio del proteoma
™Consiste nell’accoppiare
nell accoppiare in maniera sequenziale due sistemi di
separazione.
Focalizzazione Isoelettrica
SDS – PAGE
™Separa i polipeptidi sulla base di due caratteristiche
chimico-fisiche indipendenti: la carica e la massa
™Ha un elevato potere risolutivo
Focalizzazione Isoelettrica
I polipeptidi sono separati in un gradiente continuo di pH
dove migrano in base alla carica fino a raggiungere il proprio
punto isoelettrico (p
p
(pI).
) Tutti i p
polipeptidi
p p
di una determinata
specie si concentreranno o focalizzeranno in un zona
estremamente ristretta, questa caratteristica rende la IEF
una tecnica ad elevata risoluzione.
elettroforesi in ggradiente di ppH ((senza SDS))
si possono separare proteine che differiscono tra loro di una sola carica
Il punto isoelettrico (pI) è il valore di pH al quale una molecola
non reca alcuna carica elettrica netta.
Per un amminoacido avente un solo gruppo amminico ed un solo gruppo carbossilico, il valore di pI
può essere determinato dai valori della costante di dissociazione acida di ciascuno dei due gruppi
calcolandone
l l d
la
l media
di
La costante di dissociazione acida è un valore che rappresenta, ad una data temperatura, il grado di dissociazione di un acido. Maggiore è la
costante, maggiore è la tendenza dell'acido a dissociarsi, maggiore è la sua "forza".
Data la reazione di dissociazione di un generico acido HA
la costante di dissociazione acida corrispondente viene calcolata come
Proteins are amphoteric
p
molecules with acidic and basic
buffering groups (side chain).
–
–
–
–
In basic environment, the acidic groups become negatively
charged.
In acidic environment,, the basic ggroups
p become ppositivelyy
charged.
The net charge of a protein is the sum of all charges.
Isoelectric point (pI): the pH where the charge of a protein
is zero.
Carica positiva
pH acido
Ç [H+]
Carica nulla
pI
Carica negativa
pH basico
È [[H+]
Titolazione di un piccolo enzima di circa 110 aminoacidi
(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)
Elettroforesi bidimensionale
Focalizzazione isoelettrica
™ Permette di misurare il pI dei polipeptidi
™ Una tecnica all’equilibrio, indipendente da:
¾ sistema di applicazione del campione
¾ quantità di proteina caricata
¾ tempo di corsa
™ Permette un’eccellente risoluzione di polipeptidi con pI che
differiscono di 0.01 unità di pH o addirittura di 0.001 se
utilizziamo gradienti immobilizzati
Immobiline
Sono molecole con una struttura chimica simile a quella
dell’acrilammide che permette loro di polimerizzare e quindi
fissarsi alla matrice gelatinosa creando un gradiente di pH
immobilizzato (IPG).
Immobiline:
Acrilammide:
CH2=CH
=CH-CO-NH-R
CO NH R
CH2=CH
=CH-CO-NH
CO NH2
R = un gruppo carbossilico o
amminico
• Creano un gradiente immobilizzato
• Il gradiente preformato è altamente stabile nel tempo
• Una elevata capacità di carico (4-5 mg)
Immobiline
I gel di immobiline sono
generalmente polimerizzati su
supporti di plastica (gel bond)
con una concentrazione di
acrilammide estremamente
bassa 3-4% . La creazione di
un gradiente
di t con le
l appropriate
i t
soluzioni di immobiline è
ottenuta con un forma gradienti
Soluzione
basica
Soluzione
acida
Immobiline
Esistono
E
it
in
i commercio
i gell di immobiline
i
bili che
h coprono svariati
i ti
range di pH. I gel sono venduti disidratati e congelati a –20°C
Range di pH:
3-10 L. e NL., 4-7, 6-11,
3.5-4.5, 4-5, 4.5-5.5, 5-6
Dimensioni:
7, 11, 18, 24 cm
I gradienti espansi e le dimensioni delle strisce di immobiline
producono una migliore risoluzione del campione da analizzare.
L scelta
La
lt iniziale
i i i l deve
d
peròò cadere
d
sull tipo
ti
di intervallo
i t
ll più
iù
ampio e solo in seguito scegliere intervalli più stretti.
3-10 lineare (L)
3-10 Non lineare (NL)
D
Denaturante
t
t o nativa?
ti ?
Denaturante
e u
e
Proteine:
• Si presentano in un’unica conformazione
• Sono evitate le interazioni proteina-proteina
• Sono
S
mantenute
t
t iin soluzione
l i
• pI teorici sono paragonabili a quelli sperimentalmente
ottenuti
Denaturazione
La soluzione di denaturazione non deve contenere sostanze che
possono influire sulla separazione ovvero molecole cariche o
ionizzabili.
• Urea
• Detergenti non ionici o zwitterionici
• Riducenti
Elettroforesi bidimensionale
La prima dimensione è la focalizzazione isoelettrica
Campione
IPG strip
La seconda
di
dimensione
i
è
SDS - PAGE
Gel di poliacrilamide
Campo elettrico
Elettroforesi bidimensionale
Ogni polipeptide separato tramite 2D è riconducibile ad un punto in un
asse cartesiano
t i
dove
d
le
l coordinate
di t sono rispettivamente
i tti
t il pII e il Mr
M
Non-linear IPG 3-10
pH 3
pH 10
200
M
Mr
10
Potere
P
t
risolutivo
i l ti
dell’elettroforesi
bidimensionale
è il prodotto dei
poteri risolutivi
dell’ IEF e del
SDS-PAGE
http://us.expasy.org/ch2d
Voet Biocheemistry 3e
© 22004 John Wileey & Sons, Incc.
sito per la consultazione di mappe 2D-elettroforesi e usi in
proteomica
http://users.unimi.it/biolstru/Home.html
Western Blot
/PVDF
PVDF:
Polyvinylidene fluoride
Western blots allow investigators to determine the molecular weight of a protein and to measure relative amounts of
the protein present in different samples.
1) Proteins are separated by gel electrophoresis, usually SDSSDS
PAGE (but also 2D gel).
2) The proteins are transfered to a sheet of special blotting paper
(nitrocellulose or PVDF). The proteins retain the same
pattern of separation
p
p
they
y had on the ggel.
3) The blot is incubated with a generic protein (such as milk
proteins)
p
ote s) to bind
b d to any
a y remaining
e a
g sticky
st c y places
p aces oon tthee
nitrocellulose. An antibody is then added to the solution
which is able to bind to its specific protein. The antibody has
an enzyme (e.g. alkaline phosphatase or horseradish
peroxidase) or dye attached to it.
4) The location of the antibody is revealed by incubating it with a
colorless substrate that the attached enzyme converts to a
colored
l d product
d t th
thatt can b
be seen and
d photographed.
h t
h d
Cenni di proteomica
Genomica e Proteomica
•Genomica:
Ge o c : seque
sequenziamento
e o del
de DNA presente
p ese e in un
u
organismo e analisi dei geni (bioinformatica)
•Proteomica: analisi delle p
proteine di un organismo.
g
Quali proteine in un dato momento dello
sviluppo?
Come interagiscono tra di loro?
In quali localizzazioni cellulari sono presenti?
Q li sono le
Quali
l proprietà
i à biofisiche,
bi fi i h
biochimiche e strutturali di singole proteine
e/o complessi?
¾ Il termine proteomica indica lo studio di tutte le proteine espresse
da un organismo,
organismo tessuto o cellula in un preciso istante
istante.
¾ La proteomica è una scienza più complessa della genomica. Molte
cellule
ll l di uno stesso
t
organo esprimono
i
proteine
t i diverse
di
e lo
l stesso
t
tipo
ti
cellulare in condizioni diverse (età, malattia, ambiente, ecc.) esprime
proteine differenti
differenti.
¾ La proteomica si avvale di metodologie specifiche: elettroforesi
bidimensionale spettrometria di massa,
bidimensionale,
massa analisi statistica.
statistica
¾ Il rapido sviluppo della proteomica in questi ultimi anni ha tratto
vantaggio
t i da
d metodi
t di innovativi
i
ti i di spettrometria
tt
t i di massa che
h stanno
t
diffondendosi rapidamente, quali le tecniche “matrix-assisted laser
desorption ionization”
ionization (MALDI) e ‘“electrospray
electrospray ionization”
ionization (ESI) in
combinazione con l’enorme quantità di “expressed tagged sequences”
(EST) disponibili nelle banche dati.
¾La proteomica è una scienza con un approccio olistico: non dobbiamo fare ipotesi a priori sempre restrittive perché ci obbligano a focalizzare la nostra attenzione su una particolare proteina
o al massimo su uno specifico sistema. Piuttosto dobbiamo scegliere il sistema che ci interessa ed
analizzarlo
li
l in
i toto.
t t
¾Il confronto fra un tessuto sano ed uno malato può infatti mostrare un gran numero di proteine
alterate.
¾L’identificazione di tutte q
queste p
proteine e della loro funzione ci p
permette a p
posteriori di
comprendere il complesso meccanismo di insorgenza e progressione di una malattia.
Up-regulation
p g
Down-regulation
g
Loss
Control
•
•
•
•
Addition
Experimental
L'analisi dell'immagine permette l'identificazione degli spot
L'informazione può essere utilizzata per istruire un robot che taglia ciascuno spot
Gli spot vengono isolati e digeriti
digeriti, ad esempio
esempio, con tripsina
L'analisi dei peptidi con MS permette l'identificazione delle proteine
Proteomics, like its precursor genomics, thus represents the emergence of a
new way
y of doing
g research that is not dependent
p
on the testing
g of specific
p
models of cellular behavior. This style of science obviously does not replace,
but rather will increasingly operate with traditional biological methods.
JOE SUTLIFF
_
+
F
SDS-PAGE