Inherited disorders
Master in Medicina della Riproduzione
Abano Terme, 27 marzo 2009
Couples at genetic risk
Significato dell’analisi
del I globulo polare
Affected
Pregnancy
Children
Other family members
Options
Genetic screening
Reproductive roulette
Prenatal diagnosis /
termination
No more children
Adoption
Gamete donation
PGD
D. Zuccarello
Diagnosis of genetic disorders before implantation
of embryos
PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS
PGD to improve IVF outcome
An alternative could be to diagnose the genetic disorder
before the pregnancy is established (on oocytes or embryos).
Only the unaffected embryos would then be transferred to the
uterus.
Opportunity for couples to prevent the physical and
psychological trauma, and ethical-moral problems associated
with possible termination.
This technique is referred to as Preimplantation Genetic
Diagnosis (PGD)
•Aneuploidy Testing
•Advanced Maternal Age
•Repeated Implantation Failure
•Recurrent Early Abortions
•Severe Male Infertility
•Translocations
PGD to reduce recurrent genetic risk
•Single Gene Disorders
•Autosomal Recessive
•Autosomal Dominant
•X-Linked
•Late onset disorders
•Inherited Predisposition to Cancer
•HLA Genotyping
PGD applications
Biopsy for PGD
• 1^ Polar Body
PGD for:
Pre-conception
Aneuploidy screening (PGS)
Chromosomal Translocation (Robertsonian, Reciprocal)
• 1^ & 2^ Polar Body
Chromosomal inversions, deletions, duplications
Single gene disorders
HLA matching
• Cleavage Stage Embryos (day-3)
Late on set disorders
Inherited predisposition to cancer
• Blastocyst
Italian Law 40/2004 on
medically assisted procreation
Preparing to single cell PCR
Blastomere
After removal, each
blastomere or polar body is
transferred into sterile 0.2 ml
PCR tubes containing of
lysis buffer, and covered
with mineral oil before
subjection to cell lysis
Polar
bodies
1-2 drops of mineral
oil is added
the use of IVF techniques is restricted to
sterile couples;
fertilization of a maximum of 3 oocytes;
the transfer of all three possible embryos is
mandatory, even if affected!
Freezing of embryos is forbidden
PGD on embryos is unfeasible!
Opzioni per le coppie Italiane
dopo approvazione della Legge 40
La PGD in Italia dopo la Legge 40:
la Diagnosi Genetica Pre-concepimento
La Legge 40/2004 vieta qualsiasi forma di diagnosi genetica
sull’embrione; quindi in Italia non e‘ più possibile eseguire la
cosiddetta diagnosi genetica preimpianto (PGD).
Studio degli ovociti prima della loro fertilizzazione in vitro,
mediante analisi genetica del primo globulo polare (1PB).
Fino ad oggi, le coppie italiane portatrici di patologie genetiche
avevano due opzioni riproduttive:
Il concepimento naturale, sottoponendosi successivamente a
diagnosi prenatale, mediante villocentesi o amniocentesi;
Selezione degli ovociti in cui non sia presente la mutazione del
partner femminile.
La diagnosi genetica eseguita sull’ovocita,
concepimento, e non sull’embrione.
prima
del
Ricorrere al cosiddetto “turismo procreativo”.
Oggi, finalmente, si affaccia una nuova opportunità per le coppie
italiane a rischio genetico: la cosiddetta diagnosi genetica preconcepimento (PCGD)
Existing protocols on 1PB testing
Si producono solo embrioni sani, escludendo a priori la
possibilità di produrre embrioni con anomalie genetiche.
si risolve definitivamente il problema della selezione genetica
degli embrioni e dell'eliminazione degli embrioni malati.
Critiche alla PCGD
Originalità: già condotta nel 1990 dal gruppo di Chicago
1PB testing (Verlinsky et al., 1990);
Sequential analysis of 1PB and 2PB (Verlinsky et al., 1997), to
increase the accuracy and efficiency of diagnosis because of
recombination events.
At present, PGD on PBs is mainly applied to those couples having
moral objections to any micromanipulation and potential discarding
of abnormal embryos (Kuliev et al., 2001; Kuliev, 2006).
It also represents the only option for prevention of genetic diseases
for countries where diagnosis on embryos is prohibited (genetic
testing is carried out before fusion of the two pronuclei - Tomi et al.,
2005, 2006)
Affidabilità: tecnica parziale, affatto esaustiva, e con una
margine di errore molto elevato
L’analisi andrebbe fatta sul 1PB e il 2PB
Se si analizza solo il 1PB c'è un elevato margine d'errore
Casistica ridotta: la tecnica è stata applicata ad un
numero limitato di casi
PGD: è originale?
La procedura applicata nel 1990 dal gruppo di Chicago
prevedeva l’analisi del 1PB dopo la fecondazione.
Vecchia tecnologia.
tempi di analisi lunghi (16-24 h), non compatibili con i tempi
massimi di ICSI (6-8 h post prelievo).
Successivamente l’analisi del solo 1PB è stata abbandonata,
ed integrata con l’analisi sequenziale del 1PB e 2PB.
Il nome della procedura e’ stato modificato in “diagnosi
genetica pre-zigotica o pre-embrionica” (dopo la fertilizzazione
dell’ovocita, ma prima della formazione dello zigote), ed
attualmente utilizzata in Germania, Austria e Svizzera.
I protocolli di diagnosi genetica pre-zigotica non sono
compatibili con la Legge 40.
L’originalità risiede nella rapidità del test (estrema
complessità) che può essere portato a termine entro 4h, quindi
in tempo utile per la ICSI
PCGD: è affidabile?
La PCGD ha un alto margine di errore?
L’analisi andrebbe fatta su 1PB e 2PB?
Se si analizza solo il 1PB si rischia un errore di
diagnosi?
PGD from
PB1
La diagnosi genetica dell’ovocita mediante analisi
del primo globulo polare (1PB)
I tempi analitici molto stretti (al massimo 6 ore).
Per questo motivo, l’applicazione della tecnica
segue uno schema articolato che richiede una
stretta coordinazione tra due diverse equipe:
Il team del laboratorio di PMA;
Il team del laboratorio di genetica.
L’attività’ di questi due gruppi di professionisti
consente di ottenere i risultati entro 6 ore dal
prelievo degli ovociti.
Analisi genetica dell’ovocita mediante diagnosi
del primo globulo polare (1PB)
Analisi genetica dell’ovocita mediante diagnosi
del primo globulo polare (1PB)
1) Selezionare marcatori STRs e primers
1) Selezionare marcatori STRs e primers
2) Testare marcatori STRs e primers su DNA genomico e
su singoli leucociti
3) Biopsia, lisi del 1PB ed allestimento di nested multiplex
PCR fluorescente
2) Testare marcatori STRs e primers su DNA genomico e
su singoli leucociti
3) Biopsia, lisi del 1PB ed allestimento di nested multiplex
PCR fluorescente
4) Analisi di linkage
4) Analisi di linkage
Analisi genetica dell’ovocita mediante diagnosi
del primo globulo polare (1PB)
Multiplex
Metodica di PCR FAST
50 minuti: multiplex PCR
50 minuti: nested PCR
Nested
Riduzione dei tempi di analisi di circa 60 minuti !
Analisi genetica dell’ovocita mediante diagnosi
del primo globulo polare (1PB)
ANALISI DI LINKAGE
1) Selezionare marcatori STRs e primers
2) Testare marcatori STRs e primers su DNA genomico e
su singoli leucociti
3) Biopsia, lisi del 1PB ed allestimento di nested multiplex
PCR fluorescente
4) Analisi di linkage
Permette di evidenziare eventuali crossingover e di identificare gli alleli dropout
Esempio di allele dropout:
PGD PER DISTONIA PRIMARIA
Embryo 1
La PCGD è affidabile!
Elettroforesi
capillare dei
prodotti di PCR
fluorescenti.
La ricombinazione non incide sull’affidabilità dell’analisi,
in quanto gli ovociti ricombinanti non verranno
considerati per la successiva fertilizzazione
Embryo 1:
affetto
La ricombinazione comporta solo una riduzione del
numero di ovociti disponibili per la ICSI
Embryo 2
L’analisi del 2PB degli ovociti con ricombinazione
aumenterebbe solo il numero degli ovociti per ICSI, non
rende l’analisi genetica più affidabile
Embryo 2:
affetto (allele
dropout)
Gene DYT1
La diagnosi effettuata sul solo 1PB è affidabile
(ADO circa 0.5%)
Embryo 3
Embryo 3: sano
Diagnosi Genetica Pre-concepimento:
Diagnosi Genetica Pre-concepimento:
APPLICABILITA’
La diagnosi pre-concepimento puo’ essere applicata a coppie portatrici di :
VANTAGGI
L’analisi e’ effettuata su materiale extra-embrionario, che non ha alcun
ruolo biologico.
La biopsia del 1PB non incide sullo sviluppo dell’embrione,
mantenendo inalterate le relative percentuali di impianto.
La diagnosi genetica viene quindi eseguita sull’ovocita, l’embrione
non viene manipolato. Ciò previene l’eliminazione degli embrioni
malati e consente di superare i problemi etici che hanno determinato il
divieto della diagnosi preimpianto.
Utile per quelle coppie, portatrici di una malattia genetica, che non
vogliono affrontare la scelta dolorosa di un’interruzione volontaria
della gravidanza o con problemi etici ad essa connessi.
Evita gli effetti del “turismo procreativo”.
Malattie monogeniche a trasmissione:
autosomica recessiva (Fibrosi Cistica, Beta Talassemia, SMA, etc.)
legata al cromosoma X (Sindrome X-Fragile, Distrofia Muscolare)
autosomica dominante di origine femminile (Distrofia Miotonica)
Con questa procedura non possono essere individuate eventuali malattie
genetiche a trasmissione autosomica dominante di origine maschile.
Traslocazioni cromosomiche bilanciate:
Reciproche
Robertsoniane
Diagnosi Genetica Pre-concepimento:
Clinical outcome of PGD cycles
LIMITI
Range of the age
L’analisi consente di ottenere solo informazioni relative ad
anomalie di origine femminile, ed e’ quindi inapplicabile in caso di
malattie genetiche autosomiche dominanti di origine maschile.
35-39
40>
PGD+PGS All
38>
ages
Outcome
<35
35-37
38-39
hCG+ rate x ET
73,9%
50,0%
50,0% 50,0% 40,0%
44,4%
57,7%
Clinical Pregnancy
69,6%
rate x ET
50,0%
50,0% 50,0% 40,0%
44,4%
55,8%
Una bassa risposta alla stimolazione ovarica incide sul numero di
All ages
ovociti disponibili per l’analisi genetica. Una buona riserva
Outcome
SGD
hCG+ rate x ET
53,8%
69,2%
57,7%
Clinical Pregnancy rate x ET
51,3%
69,2%
55,8%
ovarica, quindi, e’ un requisito importante per il successo della
procedura.
Translocation SGD+Translocation
Età!
Fiorentino et al., 2009
Applicazione clinica della PGD
Patologia
DM Becker
CMT2A
CONX26
DM Duchenne
Eredità
X-linked
Mutazione lei
delezione esoni 45-52
AD
S249C (esone 8)
AR
V153I
X-linked
MLPA negativo. Aplotipo a rischio
Applicazione clinica della PGD
Mutazione lui
Provenienza
nn
Cremona
Nr. di
cicli
Indicazione
Nr. di
coppie
Nr. di gravidanze in Nr. di Bambini
corso di gestazione
già nati
Malattie Monogeniche
nn
Livorno
-3224C>A
Milano
Fibrosi Cistica
4
4
0
0
nn
Milano
Beta Talassemia
4
4
1
0
IVS2 -745
Novara
1
1
0
Como
Distrofia Muscolare Duchenne (DMD)
0
D-F508 / 5T
HT: C282Y/H63D); FC: 711+5G>A
Padova
Distrofia Miotonica
2
2
0
0
1564 del CA
Padova
Atrofia Muscolare Spinale (SMA)
2
2
0
0
Y843C (esone 24)
Brescia
Sordità ereditaria (CX26)
1
1
0
0
X-Fragile (FRAXA)
1
1
1
B-talassemia
AR
codone 39
FC
AR
D-F508
HT - FC
AR
HT: H63D; FC: 5T
FC
AR
D-F508
S. Meckel-Gruber
AR
W225X (esone 27)
B-talassemia
AR
codone 39
Hb S
Como
Distrofia FSO + FC
AD
delezione 4q35
CFTR: D-F508
Lecco
AR
IVS1 nt1 G>A
delezione delta-beta
Agrigento
Charcot Marie Tooth (CMTX)
1
1
0
1
nn
Milano
Sindrome di Kallman
1
1
0
0
codone 39
Torino
Malattia di Treacher-Collins
1
1
0
0
nn
Prato
B-talassemia
Emofilia A
X-linked
inversione IVS 22
B-talassemia
AR
IVS1:6 T>C + del alpha 3.7
Aniridia (PAX6)
AD
IVS6+1 G>C
AR
Hb Lepore
IVS1 -6
AR
Q302X
B-talassemia
SMARD
DM Duchenne
Von Hippel Lindau
X-linked
AD
Milano
W386R
Torino
MLPA in corso. Aplotipo a rischio
nn
Padova
delezione parziale 3Kb
nn
Cagliari
Traslocazioni Cromosomiche
Robertsoniane
4
3
0
0
Reciproche
4
4
0
0
Totale
26
25
2
1
Fiorentino et al., 2009
PCGD for CMTX
No. of COC: 19
No. of MII Oocytes: 15
1PB
PCGD X-Fragile
No. of biopsied Oocytes: 15
No. of COC: 9
Diagnosi 1PB
Diagnosi Ovocita
1
Presenza di Aplotipo Normale
MUTAZIONE PRESENTE
2
Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione
3
4
No. of MII Oocytes: 9 No. of biopsied Oocytes: 9
1PB
Diagnosis of 1PB
Diagnosis of Oocyte
Assenza di Mutazione
1
Ricombinazione
Ovocita non diagnosticabile
Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione
Assenza di Mutazione
2
Ricombinazione
Ovocita non diagnosticabile
Presenza di Aplotipo Normale
MUTAZIONE PRESENTE
5
Presenza di Aplotipo Normale
MUTAZIONE PRESENTE
3
Presenza di Aplotipo Normale
ESPANSIONE PRESENTE
6
Presenza di Aplotipo Normale
MUTAZIONE PRESENTE
4
Presenza di Aplotipo associato alla Espansione
Assenza di Espansione
7
Assenza di amplificazione
Nessun Risultato
8
Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione
Assenza di Mutazione
5
Presenza di Aplotipo associato alla Espansione
Assenza di Espansione
9
Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione
Assenza di Mutazione
6
Presenza di Aplotipo Normale
ESPANSIONE PRESENTE
10
Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione
Assenza di Mutazione
11
Presenza di Aplotipo Normale
MUTAZIONE PRESENTE
7
Presenza di Aplotipo associato alla Espansione
Assenza di Espansione
12
Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione
Assenza di Mutazione
8
Ricombinazione
Ovocita non diagnosticabile
13
Presenza di Aplotipo Normale
MUTAZIONE PRESENTE
9
Ricombinazione
Ovocita non diagnosticabile
14
Ricombinazione
Ovocita non diagnosticabile
15
Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione
Assenza di Mutazione
Fiorentino et al., 2009
Conclusioni
PCGD -Talassemia
No. of COC: 17
Fiorentino et al., 2009
No. of MII Oocytes: 15 No of biopsied Oocytes: 15
1PB
Diagnosi 1PB
Diagnosi Ovocita
1
2
3
Ricombinazione
Presenza della Mutazione
Ricombinazione
Ovocita non diagnosticabile
Mutazione Assente
Ovocita non diagnosticabile
4
Assenza di Amplificazione
Nessuna Diagnosi
5
7
8
9
10
11
13
14
16
17
18
Assenza della Mutazione
Assenza della Mutazione
Presenza della Mutazione
Ricombinazione
Ricombinazione
Assenza della Mutazione
Ricombinazione
Ricombinazione
Ricombinazione
Assenza di Amplificazione
Assenza della Mutazione
MUTAZIONE PRESENTE
MUTAZIONE PRESENTE
Mutazione Assente
Ovocita non diagnosticabile
Ovocita non diagnosticabile
MUTAZIONE PRESENTE
Ovocita non diagnosticabile
Ovocita non diagnosticabile
Ovocita non diagnosticabile
Nessuna Diagnosi
MUTAZIONE PRESENTE
Fiorentino et al., 2009
la diagnosi genetica pre-concepimento consente di superare un sentito
problema etico: la manipolazione dell’embrione a fini diagnostici.
soluzione che permette di conciliare le due opposte visioni di tutela
dell’embrione.
la diagnosi genetica viene eseguita sull’ ovocita, e non sull’embrione.
A differenza della diagnosi preimpianto, non si producono ed eliminano
embrioni malati.
Con le attuali restrizioni legislative, la diagnosi pre-concepimento è più
efficace della diagnosi preimpianto.
L’opzione di un trattamento in Italia, evita alle coppie a rischio genetico i
notevoli disagi di natura psicologica ed economica conseguenti al
“turismo riproduttivo”.
Una speranza per molte coppie che non possono affrontare i costi di un
trattamento all’estero, a causa delle limitate disponibilità economiche.
