Elucigene CF-EU2v1 - Elucigene Diagnostics

Elucigene® CF-EU2v1 Istruzioni per l’uso
Elucigene® CF-EU2v1
Istruzioni per l’uso
Cod. catalogo:
CF2EUB2 – 50 test
CF2EUBX – 10 test
Per uso diagnostico in vitro
Prodotto da:
Elucigene Diagnostics
Greenheys House
Pencroft Way
Manchester Science Park
Manchester
M15 6JJ
Vendita, assistenza clienti e assistenza tecnica:
T: +44 (0) 161 669 8122
F: +44 (0) 161 669 8129
E: [email protected]
E: [email protected]
Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and
Wales, registration number 8696299.
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Elucigene® CF-EU2v1 Istruzioni per l’uso
Elucigene CF-EU2v1
Utilizzo previsto
Per la rilevazione qualitativa simultanea in vitro delle seguenti mutazioni del gene CFTR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Regulator) umano nel DNA estratto da campioni di sangue intero (conservato in EDTA)
e gocce di sangue essicate su carta da filtro:
Tradizionale
Secondo le linee guida HGVS *
cDNA name
Protein name
CFTRdele2,3
name
c.54-5940_273+1025delProtein
(c.54-5940_273+10250del21080)
E60X
c.178G>T
p.Glu60X
P67L
c.200C>T
p.Pro67Leu
G85E
c.254G>A
p.Gly85Glu
394delTT
c.262_263del (c.262_263delTT)
p.Leu88IlefsX22
444delA
c.313del (c.313delA)
p.Ile105SerfsX2
R117C
c.349C>T
p.Arg117Cys
R117H
c.350G>A
p.Arg117His
Y122X
c.366T>A
p.Tyr122X
621+1G>T
c.489+1G>T
711+1G>T
c.579+1G>T
L206W
c.617T>G
p.Leu206Trp
1078delT
c.948del(c.948delT)
p.Phe316LeufsX12
R334W
c.1000C>T
p.Arg334Trp
R347P
c.1040G>C
p.Arg347Pro
R347H
c.1040G>A
p.Arg347His
A455E
c.1364C>A
p.Ala455Glu
I507del
c.1519_1521del (c.1519_1521delATC)
p.Ile507del
F508del
c.1521_1523del (c.1521_1523delCTT)
p.Phe508del
1677delTA
c.1545_1546del (c.1545_1546delTA)
p.Tyr515X
V520F
c.1558G>T
p.Val 520Phe
1717-1G>A
c.1585-1G>A
G542X
c.1624G>T
p.Gly542X
S549R(T>G)
c.1647T>G
p.Ser549Arg
S549N
c.1646G>A
p.Ser549Asn
G551D
c.1652G>A
p.Gly551Asp
R553X
c.1657C>T
p.Arg553X
R560T
c.1679G>C
p.Arg560Thr
1811+1.6kbA>G
c.1680-886A>G
1898+1G>A
c.1766+1G>A
2143delT
c.2012del (c.2012delT)
p.Leu671X
2184delA
c.2052del (c.2052delA)
p.Lys684AsnfsX38
2347delG
c.2215del (c.2215delG)
p.Val739TyrfsX16
W846X
c.2538G>A
p.Trp846X
2789+5G>A
c.2657+5G>A
Q890X
c.2668C>T
3120+1G>A
c.2988+1G>A
CF2EUBYIT 002
p.Gln890X
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Tradizionale
Secondo le linee guida HGVS *
cDNA name
Protein name
Protein name
3272-26A>G
c. 3140-26A>G
R1066C
c.3196C>T
p.Arg1066Cys
Y1092X(C>A)
c.3276C>A
p.Tyr1092X
M1101K
c.3302T>A
p.Met1101Lys
D1152H
c.3454G>C
p.Asp1152His
R1158X
c.3472C>T
p.Arg1158X
R1162X
c.3484C>T
p.Arg1162X
3659delC
c.3528del (c.3528delC)
p.Lys1177SerfsX15
3849+10kbC>T
c.3718-2477C>T
S1251N
c.3752G>A
p.Ser1251Asn
3905insT
c.3773dup (c.3773dupT)
p.Leu1258PhefsX7
W1282X
c.3846G>A
p.Trp1282X
N1303K
c.3909C>G
p.Asn1303Lys
* with reference to – Mutation Nomenclature in Practice: Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis
External Quality Assessment Scheme. Berwouts S, Morris M, Girodon G, Schwarz M, Stuhrmann M and Dequeker
E. Human Mutation, Vol.00, No. 0, 1-7 (2011)
CF-EU2v1 è in grado di distinguere tra individui eterozigoti e omozigoti per le suddette mutazioni e
varianti ad eccezione di S549R(T>G) (consultare la sezione sulla reattività crociata nel presente
documento).
Riepilogo e spiegazione
La fibrosi cistica (FC) è la malattia autosomica recessiva con morte precoce più comune nella
popolazione caucasica. L’incidenza della malattia è di 1 su 3200 nati vivi tra individui di razza caucasica
(1). Nella popolazione caucasica, la frequenza tra gli eterozigoti è circa di 1 su 25.
La fibrosi cistica colpisce il tessuto epiteliale di diversi organi determinando una complessa patologia
multisistemica che riguarda il pancreas esocrino, l’intestino, il tratto respiratorio, il tratto genitale maschile
e le ghiandole sudoripare esocrine. L’espressione della malattia varia in base alla gravità delle mutazioni
del gene CFTR (2), ai modificatori genetici (3) e ai fattori ambientali (4). L’intervallo di variabilità va dalla
morte nella prima infanzia a causa di malattia polmonare ostruttiva progressiva con bronchiectasia,
all’insufficienza pancreatica accompagnata da malattia polmonare ostruttiva gradualmente progressiva
durante l’adolescenza e crescente frequenza di ospedalizzazione per malattia polmonare all’inizio dell’età
adulta, a ricorrente sinusite e bronchite o infertilità maschile in giovane età adulta.
Nella maggior parte dei casi, la diagnosi di fibrosi cistica viene stabilita in individui con uno o più fenotipi
caratteristici della FC oltre all’evidenza di un’anomalia nella funzione del CFTR in base a una delle
seguenti condizioni: presenza di due mutazioni responsabili della malattia nel gene CFTR o due valori
quantitativi anomali del cloro nel sudore ottenuti mediante iontoforesi alla pilocarpina (>60 mEq/l) o
misure della differenza di potenziale transepiteliale nasale caratteristiche della FC. Il tasso di rilevazione
della mutazione del CFTR varia in base alla metodica di analisi e alla razza. In alcuni individui
sintomatici, è rilevabile solo una o nessuna mutazione patologica; in alcuni portatori la mutazione
patologica non è rilevabile.
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Le malattie correlate al gene CFTR sono ereditate in modalità autosomica recessiva. I fratelli o sorelle di
un probando con fibrosi cistica hanno una probabilità del 25% di essere affetti, una probabilità del 50% di
essere portatori asintomatici e una probabilità del 25% di non essere né affetti né portatori. L’analisi
genetica molecolare volta all’individuazione delle mutazioni che causano la malattia (s) nel gene CFTR
viene utilizzata per la rilevazione dei vettori in programmi di screening della popolazione. È disponibile
l’analisi prenatale per gravidanze a maggiore rischio di malattie correlate al gene CFTR se sono note in
ambito famigliare mutazioni patologiche.
Dalla scoperta del gene CFTR nel 1989 (5), sono state descritte più di 1700 mutazioni e varianti (6).
Molte di queste mutazioni sono ‘private’, nel senso che sono state descritte in un solo paziente e/o in una
sola famiglia. Analisi di routine per tutte le mutazioni possibili non sono né fattibili né economicamente
convenienti e ci si limita pertanto all’analisi delle mutazioni più comuni. CF-EU2v1 è un kit di analisi della
fibrosi cistica concepito espressamente per studiare le mutazioni più comuni presenti nelle popolazioni di
origine europea. L’analisi identifica un totale di 50 mutazioni e analizza inoltre il tratto poly T (politimidina)
dell’introne 9 con una misurazione accurata della ripetizione TG adiacente.
Il tratto di timidina polimorfica alla giunzione dell’introne 9 e dell’esone 10 influenza la trascrizione. Il
numero di residui di timidina (5T, 7T o 9T) influisce sull’efficienza di splicing dell’esone 10; se è presente
l’allelo 5T, sarà assente una proporzione di trascritti dell’esone 10 dando luogo a una proteina non
funzionale e a sintomi di FC variabili. È stato segnalato che il numero di ripetizioni TG dal 5’ al tratto della
politimidina può influire anche sullo splicing dell’esone 10 (7). Se presente sullo stesso allelo della
variante 5T, quanto più a lungo sarà il numero delle ripetizioni TG, tanto più elevata sarà la proporzione di
trascritti CFTR nei quali manca l’esone 10. Il numero di ripetizioni TG può essere determinato utilizzando
CF-EU2v1 mediante la valutazione delle dimensioni dei picchi degli ampliconi 5T.
Principi della procedura
La metodica utilizzata dal kit Elucigene CF-EU2v1 si avvale della tecnologia di amplificazione allelespecifica a fluorescenza basata sul sistema delle mutazioni refrattarie all’amplificazione (Amplification
Refractory Mutation System, ARMS), che rileva mutazioni puntiformi, inserzioni o delezioni nel DNA (8).
La tecnologia ARMS si basa sul principio che, in determinate condizioni, gli oligonucleotidi con un residuo
non appaiato in corrispondenza del 3’ non funzionano come primer nella reazione a catena delle
polimerasi (PCR). La selezione di oligonucleotidi appropriati rende possibile l’amplificazione e la
rilevazione di specifiche sequenze di DNA mutanti o normali. Le sequenze amplificate (ampliconi)
vengono separate mediante elettroforesi capillare utilizzando un analizzatore genetico Applied
Biosystems. Il software di analisi permette l’identificazione e la marcatura degli ampliconi in base alle loro
dimensioni e al tipo di colorante.
Elucigene CF-EU2v1 è un test multiplex ad ampio spettro che prevede due reazioni di PCR (A e B).
Cinquanta sequenze mutanti per il gene CFTR vengono rilevate nella miscela A e visualizzate come
picchi di ampliconi blu. Le corrispondenti sequenze normali non mutate (genotipo selvatico o wild-type)
vengono rilevate nella miscela B e visualizzate come picchi di ampliconi verdi. La miscela A permette
inoltre di rilevare la sequenza normale per le mutazioni più comunemente osservate che causano fibrosi
cistica nelle popolazioni caucasiche, denominata F508del e visualizzata come un picco di ampliconi
verde. Nella miscela A vengono rilevate altre sequenze ripetute poly T, visualizzate come picchi di
ampliconi neri. I marker di controllo interno dell’amplificazione (non fibrosi cistica) sono inclusi sia nella
miscela A che nella miscela B per monitorare l’efficienza dell’amplificazione dei campioni e vengono
visualizzati come picchi di ampliconi rossi.
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Avvertenze e precauzioni
1. Il DNA di controllo fornito con questo kit, di origine umana e testato indipendentemente con un’analisi
basata sulla PRC, è risultato negativo per il virus dell’epatite B (HBV), dell’epatite C (HCV) e per il
virus dell’immunodeficienza umana 1 (HIV1).
2. Si consiglia di maneggiare con cautela il materiale di origine umana. Tutti i campioni devono essere
considerati potenzialmente infettivi. Nessun metodo di analisi può offrire la certezza assoluta
dell’assenza dei virus HBV, HCV e HIV 1 o di altri agenti infettivi.
3. La manipolazione dei campioni e dei componenti del test, il loro utilizzo, la conservazione e lo
smaltimento devono avvenire in conformità con le procedure definite dalle rispettive linee guida o
regolamenti nazionali in materia di sicurezza in ambito biologico.
4. In osservanza delle buone pratiche di laboratorio correnti, i laboratori devono analizzare i propri
campioni di controllo di qualità interno contenenti un genotipo noto in ciascuna analisi, in modo da
poter valutare la validità della procedura.
5. Se la scatola del kit è danneggiata, anche il contenuto potrebbe essere danneggiato; non utilizzare il
kit e contattare l’assistenza clienti.
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Simboli usati sulle etichette
I simboli utilizzati su tutte le etichette e le confezioni sono conformi allo standard armonizzato ISO15223
Produttore
Numero di test
Vedere le istruzioni per l’uso
X°
C
Conservare al di sotto della temperatura indicata
Utilizzare prima della data indicata
Codice catalogo
Numero di lotto o partita
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
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Materiali forniti
I reagenti devono essere conservati in un’area esente da prodotto DNA o PCR contaminante.
Tutti i reagenti devono essere forniti pronti per l’uso. Sia i reagenti sigillati che quelli aperti devono essere
conservati a -20 °C. I reagenti aperti possono essere conservati per un massimo di 3 mesi.
Sono forniti materiali sufficienti per 50 (10) test:
2 fiale da 120µl (50µl) di miscela di primer A CF-EU2v1, contenente primer per amplificare i seguenti
alleli mutanti: R347H, R347P, 2789+5G>A, 3120+1G>A, 711+1G>T, R334W, I507del, F508del,
3849+10kbC>T, 1677delTA, 1078delT, V520F, L206W, W1282X, R560T, 2347delG, Q890X, R553X,
G551D, S549N, M1101K, G542X, 3905insT, Y1092X(C>A), S1251N, 444delA, 1811+1.6kbA>G,
1717-1G>A, R117H, R117C, N1303K, Y122X, 394delTT, G85E, R1066C, 1898+1G>A, W846X,
2184delA, D1152H, CFTRdele2,3, P67L, 2143delT, E60X, 3659delC, 3272-26A>G, 621+1G>T,
A455E, R1162X e R1158X. Questa miscela contiene anche primer wild-type per il rilevamento
dell’allele F508del normale, primer per il rilevamento delle varianti della politimidina, IVS8-5T, IVS87T, IVS8-9T e primer per l’identificazione di 2 marker STR (ripetizioni in tandem brevi, short tandem
repeat) ipervariabili – 404473 (450043).
2 fiale da 120µl (50µl) di miscela di primer B CF-EU2v1, contenente primer wild-type per amplificare
gli alleli normali dei mutanti amplificati dalla miscela di primer A, ad eccezione di F508del, l’allele
normale amplificato dai primer inclusi nella miscela di primer A. Questa miscela contiene anche
primer per l’identificazione di 2 marker STR ipervariabili – 404474 (450044).
2 fiale da 400µl (75l) di miscela master per PCR contenente HotStart Taq DNA polimerasi e
deossinucleotidi trifosfati in tampone – 404480 (450045).
1 fiala da 50 µl di DNA di controllo in concentrazione di 6 ng/μl, normale per le mutazioni rilevate da
Elucigene CF-EU2v1 - 404489.
Materiali necessari ma non forniti
Materiale di consumo di laboratorio: guanti; provette per microcentrifuga con tappo a vite; fiale
per PCR da 0,2 ml o piastre di microtitolazione consigliate dal produttore del termociclatore
utilizzato; puntali per pipette.
Preparazione del DNA – Minikit per DNA QIAamp (Qiagen GmbH, n. cat. 51304/51306) o un prodotto
equivalente.
Elettroforesi capillare – GeneScan 600 LIZ, size standard (ABI, n. cat. 4366589) o GeneScan 600v2 LIZ,
size standard (ABI, n. cat. 4408399), multicapillare DS-33 (set colorante G5) matrix standard (ABI, n. cat.
4345833), polimero POP-7 (ABI, n. cat. 4352759), tampone per analizzatore genetico 10x (ABI, n. cat.
402824) e formamide Hi-Di (ABI, n. cat. 4311320).
Nota – Assicurarsi che tutti i materiali utilizzati rientrino nella data di stabilità indicata dal produttore.
Apparecchiatura necessaria
Apparecchiature di laboratorio: pipette di precisione (2 set: 1 per la pre-amplificazione e 1 per la
manipolazione post-amplificazione); indumenti di protezione; agitatore vortex; microcentrifuga; centrifuga
con piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.
Amplificazione mediante PCR: termociclatore adatto a contenere piastre per microtitolazione a 96
pozzetti o fiale da 0,2 ml, con accuratezza di temperatura minima di +/-1 °C tra 33 °C e 100 °C e
uniformità di temperatura statica di +/-1 °C.
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Nota – Il termociclatore deve essere sottoposto a regolare manutenzione in base alle istruzioni del
produttore e tarato per garantire un ciclo di PCR accurato e un rendimento ottimale. Il test Elucigene CFEU2v1 è stato sviluppato su termociclatori Applied Biosystems 9700. Altre marche e modelli devono
essere completamente testati e valutati dall’operatore per garantire un rendimento ottimale, prima di
riportare i risultati ottenuti con il test CF-EU2v1.
Elettroforesi capillare: analizzatore genetico ABI 3130/3500 (con software di analisi dei frammenti
GeneMapper), array di capillari di 36 cm o 50 cm (ABI3500), 96 piastre ottiche a 96 pozzetti, setti per 96
pozzetti, cassette per 96 pozzetti.
Nota – Le apparecchiature per elettroforesi capillare devono essere sottoposte a regolare manutenzione
in base alle istruzioni del produttore e tarata per garantire un rendimento ottimale.
Prelievo e conservazione dei campioni
Campioni di sangue intero (in EDTA) e gocce di sangue essiccate su carta da filtro sono stati giudicati
compatibili con questo test.
È stato segnalato che talvolta i dispositivi di prelievo dei campioni hanno influito in modo negativo
sull’integrità di determinati analiti e che potrebbero interferire con alcune tecnologie metodologiche (9). Si
raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che il dispositivo selezionato sia usato secondo le
istruzioni della ditta produttrice e che i dispositivi di prelievo dei campioni siano compatibili con questo
test.
I campioni di sangue devono essere conservati a -20 °C prima della preparazione del DNA. Evitare di
congelare e scongelare ripetutamente il campione.
Preparazione di DNA da campioni di sangue intero (trattato con EDTA)
Si ottengono sempre risultati con DNA estratto con kit di sangue per DNA da 96 QIAamp (o il minikit per
DNA QIAamp con Proteinasi K) seguendo il protocollo descritto nel manuale QIAamp partendo con 200
μl di sangue intero liquido e procedendo all’eluizione in 200 μl di acqua per biologia molecolare.
Preparazione di DNA da gocce di sangue essiccate su carta da filtro
Si ottengono sempre risultati con DNA estratto con il minikit per DNA QIAamp seguendo il protocollo
descritto nel manuale QIAamp, ma partendo con 2 dischi da 3 mm di un campione di sangue secco e
procedendo all’eluizione in 100 μl di acqua per biologia molecolare.
Prima di usare i risultati a scopo diagnostico, si raccomanda di valutare accuratamente con il test
Elucigene CF-EU2v1 metodi e tipi di campioni alternativi per l’estrazione del DNA.
Considerazioni importanti – Quantitativo di DNA
In condizioni ottimali e con l’utilizzo delle configurazioni raccomandate per l’iniezione dei campioni
impostate nei moduli di analisi per la colonna capillare (vedere la nota nella sezione Elettroforesi
capillare), sono stati ottenuti sistematicamente risultati accettabili da DNA estratto con i suddetti metodi a
concentrazioni comprese tra 1,5 ng/μl e 25 ng/μl. La quantificazione del DNA è molto importante: per
garantire risultati ottimali, è necessario misurare la concentrazione di ogni campione di DNA da
analizzare. Sono accettabili tecniche quali la fluorescenza PicoGreen o l’assorbanza UV. Data la varietà
di tecniche per la quantificazione del DNA, l’operatore dovrebbe adottare i seguenti accorgimenti.
Quantitativi molto elevati di DNA di input aumenteranno la probabilità che i picchi di fondo vengano
marcati dal software di analisi. Per ridurre la probabilità che i picchi di fondo vengano marcati, è
possibile seguire la procedura riportata di seguito:
 diluire il campione di DNA e ripetere l’amplificazione;
 ridurre il tempo di iniezione (vedere la sezione Elettroforesi capillare);
 aumentare la soglia di ampiezza minima dei picchi (vedere la Guida al software di analisi
Elucigene CF-EU2v1).
Bassi quantitativi di DNA di input aumenteranno la probabilità di ottenere picchi diagnostici deboli
che non vengono marcati dal software di analisi. Per aumentare il segnale, è possibile seguire la
procedura riportata di seguito:
 portare il tempo di iniezione a 36 secondi, opzione fortemente consigliata per le estrazioni da
gocce di sangue essiccate su carta filtro (vedere la sezione Elettroforesi capillare);
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 estrarre nuovamente il campione costituito da gocce di sangue essiccate su carta da filtro ed
eluirlo in un volume di acqua ridotto (50 μl);
 aumentare il numero di campioni per l’estrazione, costituti da gocce di sangue essiccate su
carta da filtro, portandolo a 4 dischetti da 3 mm.
Considerazioni importanti – Qualità del DNA
CF-EU2v1 è un test multiplex ad ampio spettro e per funzionare in maniera ottimale richiede un’efficace
amplificazione mediante PCR. La qualità del DNA può determinare l’efficienza del processo di PCR. Gli
inibitori estratti in concomitanza ai campioni di DNA possono dar luogo a un’amplificazione non ottimale
con conseguenti picchi deboli e scarsamente bilanciati. Elucigene ha convalidato l’uso del kit QIAmp da
96 per l’estrazione del DNA da campioni di sangue e del mini kit QIAmp per l’estrazione del DNA
(QIAGEN GmbH) con il kit CF-EU2v1. Altri kit o metodi di estrazione del DNA devono essere convalidati
e ottimizzati per l’uso con CF-EU2v1.
Nota – Per maggiori informazioni, consultare la Guida alla risoluzione dei problemi Elucigene CF-EU2v1.
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Protocollo del test
Controllo della contaminazione nella PCR
Il processo di PCR genera un gran numero di prodotti amplificati (ampliconi) e porta con sé un alto rischio
di contaminazione che può causare falsi risultati. La contaminazione può derivare da due fonti:
Contaminazione crociata: contaminazione del campione con materiale non amplificato proveniente
dall’ambiente circostante o con altri campioni contenenti la sequenza bersaglio.
Contaminazione da prodotto finale: contaminazione del campione con ampliconi di precedenti PCR
che determinano l’amplificazione sia dell’amplicone bersaglio sia dell’amplicone contaminante.
I laboratori in cui si esegue la PCR sono tenuti a conoscere l’esistenza di queste fonti di contaminazione
e a mettere in atto delle procedure per ridurre in modo significativo il rischio di contaminazione. I metodi
per controllare la contaminazione sono ben documentati (10) e includono l’architettura dei laboratori, il
flusso di lavoro, le procedure di manipolazione dei campioni e gli approcci chimici ed enzimatici.
Procedure di laboratorio efficaci e ben definite sono fondamentali per controllare la contaminazione nella
PCR e devono essere implementate prima di analizzare i campioni clinici.
Procedura di amplificazione
Nota – Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, i passaggi 3 - 5 devono essere eseguiti in
un’area priva di prodotti della PCR, preferibilmente in una cabina a flusso laminare.
1. Programmare il termociclatore per un singolo passaggio per attivare la (polimerasi) HotStart Taq a 94
°C per 20 minuti collegata ad un programma ciclico di amplificazione di 1 minuto a 94 °C
(denaturazione), 2 minuti a 58 °C (annealing) e 1 minuto a 72 °C (estensione) per 30 cicli. Questo
procedimento deve essere collegato ad un file di ritardo di 20 minuti a 72 °C (estensione) sul ciclo
finale.
2. Ciascun ciclo di PCR deve includere un controllo negativo.
3. Scongelare le miscele di primer e la miscela master per PCR e centrifugare brevemente le fiale per
raccoglierne il contenuto sul fondo. Miscelare leggermente con vortex e centrifugare di nuovo
brevemente le fiale. Preparare una miscela di reazione sufficiente per il numero di campioni e
controlli da analizzare (Tabella 1).
Nota – La miscela master per PCR è viscosa e occorre prestare attenzione per far sì che vengano
manipolati i volumi corretti. Si consiglia di aggiungere la miscela master per PCR alle miscele di
primer precedentemente dispensate per far sì che tutto il liquido passi dalla pipetta alla miscela di
primer.
Nota – Non usare miscele diverse o componenti appartenenti a lotti diversi del kit
CF-EU2v1.
Programma
ciclico
Attivazione
enzimatica
94 °C
Estensione finale
94 °C
20 min. 1 min.
72 °C
72 °C
1 min.
20 min.
58 °C
Temperatura
ambiente
2 min.
30 cicli
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Elucigene® CF-EU2v1 Istruzioni per l’uso
Tabella 1 – Formulazione delle miscele di reazione
Numero dei campioni da
analizzare
1
10
25
50
Miscela di primer
(μl)
4,5
45
112,5
225
Miscela master per
PCR (μl)
7,5
75
187,5
375
Totale (μl)
12
120
300
600
4. Pipettare 10 μl di ciascuna miscela di reazione sul fondo delle fiale
0,2 ml, a cui è stata applicata un’apposita etichetta.
per
PCR
da
5. Usare puntali per pipette separati per aggiungere 2,5 μl di campione di DNA per il test a ciascuna
fiala e chiuderla con il tappo. Non aggiungere DNA nella fiala per il controllo negativo; sostituire con
2,5 μl di acqua sterile deionizzata.
6. Centrifugare brevemente le fiale per PCR per raccoglierne il contenuto sul fondo.
7. Posizionare le fiale nel blocco del termociclatore in modo che siano stabili. Avviare il ciclo a
passaggio singolo d 94 °C seguito dal programma ciclico di amplificazione.
8. Al termine del programma ciclico di amplificazione, i campioni possono essere conservati a
temperatura ambiente per tutta la notte oppure a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C per un
massimo di 7 giorni al buio prima dell’analisi con elettroforesi capillare.
Elettroforesi capillare
Si raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che l’apparecchiatura per elettroforesi capillare
selezionata venga usata secondo le istruzioni del produttore e che sia compatibile con questo test. In
questo contesto, i parametri chiave sono il polimero e l’array di capillari. È possibile ottenere risultati
ottimali utilizzando le seguenti condizioni di elettroforesi capillare.
1.
Combinare 6,8 μl di GS600v2 LIZ size standard con 250 μl di formamide Hi-Di e miscelare
accuratamente (miscela sufficiente per 16 pozzetti). Dispensare 15 μl di miscela in ciascun pozzetto
di una piastra per PCR a 96 pozzetti.
2.
Aggiungere 3 µl di prodotto di PCR da ciascuna delle miscele A e B amplificate in pozzetti separati
contenenti la miscela di size standard/formammide (ottenuta con il passaggio 1) già dispensata nella
piastra.
3.
Denaturare il prodotto di PCR dispensato nella piastra per PCR su un termociclatore utilizzando i
seguenti parametri: 94 °C per 3 minuti seguiti da 4 °C per 30 secondi.
4.
Centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il contenuto sul fondo delle fiale e per eliminare
eventuali bolle presenti nei pozzetti, e caricare immediatamente sull’analizzatore genetico.
Nota – È possibile modificare le impostazioni di iniezione dei campioni in funzione della quantità di
ampliconi prodotti durante la PCR, che può variare a seconda della quantità di DNA di input
genomico aggiunto. Riducendo il tempo o la tensione di iniezione è possibile applicare una minore
quantità di ampliconi alla colonna di analisi. Aumentando invece il tempo o la tensione di iniezione è
possibile applicare una maggiore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. I campioni
precedentemente amplificati possono essere reiniettati più volte per ripetere le analisi (per maggiori
informazioni, consultare la Guida alla risoluzione dei problemi Elucigene CF-EU2v1).
Strumenti ABI 3130
È necessario creare un modulo di analisi CF-EU2 che può successivamente essere usato per ciascuna
analisi CF-EU2.
Creare il modulo di analisi CF-EU2 nell Module Manager (editor dei moduli) del software di acquisizione
dati 3130. Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci.
•
Type (Tipo): Regolare
CF2EUBYIT 002
Sep-2014
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•
Template (Modello): FragmentAnalysis36_POP7
•
Immettere le impostazioni illustrate in dettaglio nella tabella seguente.
Modulo per capillare da 36 cm
#
Nome del parametro
1
2
3
4
5
6
7
8
Oven Temperature (Temperatura forno)
Poly_Fill_Vol. (Volume riempimento poly)
Current Stability (Stabilità corrente)
PreRun_Voltage (Tensione pre-analisi)
Pre_Run_Time (Tempo pre-analisi)
Injection_Voltage (Tensione iniezione)
Injection_Time (Durata iniezione)
Voltage_Number_Of_Steps
(Tensione numero di passaggi)
Voltage_Step_Interval
(Intervallo passaggio tensione)
Data_Delay_Time (Tempo di ritardo dati)
Run_Voltage (Tensione analisi)
Run_Time (Tempo di analisi)
9
10
11
12
Valore
Intervallo
60
6500
5,0
15,0
180
3,0
12,0**
20
int 18…65 °C
6500…38000 passaggi
int 0…2000 uAmp
0…15 kVolt
1…1000 s
1…15 kVolt
1…600 s
1…100 nk
15
1…60 s
60
15,0
1200
1…3600 s
0…15 kVolt
300…14000 s
** Portare il tempo di iniezione a 36 secondi per l’analisi del DNA estratto da gocce di sangue essiccate
su carta da filtro.
Nota – Il “tempo di analisi” necessario varia a seconda della temperatura ambiente del luogo in cui è
stato installato l’analizzatore genetico. Per maggiori informazioni sulla creazione di moduli di
analisi, consultare il Manuale dell’operatore dell’analizzatore genetico Applied Biosystems 3130.
Creare il protocollo CF-EU2 nell Protocol Manager (editor dei protocolli) e assicurarsi che siano
selezionate le seguenti voci:
•
Type (Tipo): Regolare
•
Run Module (Modulo di analisi): CF-EU2 (vedere modulo di analisi sopra)
•
Dye Set (Set colori): G5
Per analizzare i campioni, creare una scheda campioni utilizzando il Plate Manager (editor della piastra);
assicurarsi che sia stato selezionato il protocollo per CF-EU2v1 adatto al protocollo dello strumento
(vedere sopra).
Nota – Per maggiori informazioni sulla configurazione, sul funzionamento e sulla risoluzione dei problemi
dello strumento, consultare il Manuale dell’operatore dell’analizzatore genetico Applied Biosystems
3130.
Strumenti ABI 3500
È necessario creare un Instument Protocol (protocollo dello strumento) per CF-EU2 che possa essere
usato successivamente per ogni sessione analitica CF-EU2v1.
Creare il Instument Protocol (protocollo dello strumento) per CF-EU2 attraverso la libreria dei protocolli
dello strumento 3500. Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci.
•
Run Module (Modulo di analisi): FragmentAnalysis50_POP7.
•
Immettere le impostazioni illustrate in dettaglio nella figura seguente.
CF2EUBYIT 002
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**
** Portare il tempo di iniezione a 36 secondi per l’analisi del DNA estratto da gocce di sangue essiccate
su carta da filtro.
Per analizzare i campioni, creare una piastra campione facendo clic su ‘Create Plate from Template’
(crea piastra da modello) nel ‘Dashboard’; assicurarsi che sia stato assegnato il protocollo dello
strumento corretto per CF-EU2v1 (vedere sopra).
Scheda campione impostata per GeneMarker
Il software GeneMarker consente il confronto diretto tra i dati A e B dello stesso individuo. Per facilitare
questo confronto è importante che la denominazione del file di output dei dati non elaborati (FSA) sia
coerente per tutti i campioni e le miscele. La scheda campione deve contenere il nome del campione
univoco per ogni campioni analizzato seguito dal suffisso _A o _B a seconda delle miscela che sarà
analizzata. Se nel nome FSA si deve includere l’ID piastra occorre usare ogni volta un formato fisso, ad
esempio CFEU2 GGMMAAAA.
Sullo strumento 3130, occorre configurare i parametri per “Results Destination” (destinazione risultati) in
modo che il nome del file FSA includa il nome del campione, ad esempio CFEU2
GGMMAAAA_1234,5_A_A01.
CF2EUBYIT 002
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Sullo strumento 3500, occorre impostare la convenzione del nome file in modo che il nome del file FSA
comprenda il nome del campione, ad esempio CFEU2 GGMMAAAA_1234,5_A_A01.
Interpretazione dei risultati
Durante l’acquisizione dei dati, sull’elettroferogramma dei dati non elaborati si osservano frammenti di
PCR sotto forma di picchi di colore blu (mutante) o verde (wild-type). Un individuo possiede due copie del
gene CFTR. Qualora queste copie presentino la stessa sequenza per un dato sito, un individuo viene
descritto come omozigote per questo sito. Qualora le copie presentino una sequenza diversa per un dato
sito, un individuo viene descritto come eterozigote per questo sito.
Al termine dell’acquisizione dei dati, i frammenti di PCR per CF-EU2v1 devono essere classificati in
ordine di grandezza a fronte del size standard GS600v2 LIZ utilizzando il software di analisi dei
frammenti.
La Guida al software di analisi Elucigene CF-EU2v1 contiene ulteriori linee guida dettagliate per le
impostazioni del software, l’analisi e l’interpretazione. Le procedure della guida al software di
analisi sono disponibili per GeneMapper e GeneMarker sul sito web di Elucigene Diagnostics:
www.elucigene.com/products
Dai risultati della miscela A (mutante) è possibile stabilire se un individuo presenta una mutazione,
evidenziata dalla presenza di un picco blu. La miscela mutante contiene anche i primer per l’allele F508
normale, quindi tramite questa miscela è possibile stabilire se un individuo risulta normale per F508 (solo
picco verde), omozigote per F508del (solo picco blu) o eterozigote per F508del (picco blu e verde).
Se si osserva qualunque altra mutazione, è possibile analizzare i risultati della miscela B (wild-type) per
stabilire lo stato omozigote o eterozigote. La presenza di un picco verde per il particolare allele nella
miscela wild-type indica che l’individuo è eterozigote e l’assenza del picco verde indica che l’individuo è
omozigote per la particolare mutazione.
In entrambe le miscele sono inclusi marker STR ipervariabili (rossi). Questo consente il confronto tra il
campione amplificato con la miscela mutante e il campione amplificato con la miscela wild-type per
ridurre il rischio di mescolamento dei campioni; un profilo STR diverso in ciascuna delle due miscele
indica un mescolamento dei campioni. L’assenza di questi marker STR indica un campione non riuscito.
La presenza dei marker STR a livelli RFU molto bassi indica un campione debole che deve essere
analizzato con cautela.
Nota: Per maggiori informazioni, consultare la Guida alla risoluzione dei problemi.
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Marker rilevati
La tabella in basso riepiloga i marker rilevati con la miscela CF-EU2v1. I marker sono elencati in base
all’intervallo dell’entità di prodotto di PCR osservato.
Marker rilevati
Marker
(N. picco)
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
CF2EUBYIT 002
Marker
R347H
R347P
2789+5G>A
3120+1G>A
711+1G>T
R334W
I507del
F508del
3849+10KbC>T
1677delTA
1078delT
V520F
L206W
W1282X
R560T
2347delG
Q890X
R553X
G551D
S549R(T>G)*
S549N
M1101K
G542X
3905insT
Y1092X(C>A)
S1251N
444delA
1811+1.6kbA>G
1717-1G>A
R117H
R117C
N1303K
Y122X
394delTT
G85E
R1066C
1898+1G>A
W846X
2184delA
D1152H
CFTRdel2,3
P67L
2143delT
E60X
3659delC
3272-26A>G
621+1G>T
Sep-2014
Intervallo di dimensioni del
prodotto in bp (dati 3130/POP7)
110.5-116.5
117-123
124-130
132.5-138.5
141.5-147.5
147.5-154
156-162.5
163-169
172-178
180-188.5
193-199
206-211.5
215-220
224.5-230.5
234.5-240.5
242-246
250-252
255.5-261.5
265-267
267.5-269.5
275-280
282-288
289-295.5
297-303.5
308-314
315-321
323-326
332-338
341.5-347.5
349-355
357-360
360-366.5
367-373
377-383
384-390
391-397
398.5-404.5
406-411
413-418
423-429
433-439
439.5-445.5
446-450.5
453.5-460.5
461-465.5
470-476
485.5-491.5
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N. marker
48
49
50
5T**
7T
9T
Intervallo di dimensioni del
prodotto in bp (dati 3130/POP7)
496-503
506-512
516.5-524.5
110-130
140-160
175-195
Marker
A455E
R1162X
R1158X
IVS8-5T
IVS8-7T
IVS8-9T
*S549R(T>G)
Il picco 20 è presente solo nella miscela A.
** Dimensioni alleli 5T
Marker
5T (9)
5T (10)
5T (11)
5T (12)
5T (13)
Intervallo di
dimensioni del
prodotto in bp (dati
3130/POP7)
117.25 – 118.75
119.25 – 120.75
121.25 – 122.75
123.25 – 124.75
125.25 – 126.75
NOTA – Le entità dei marker possono variare in base allo strumento e al polimero utilizzati.
Esempi di interpretazione
I507del
Data la posizione della delezione I507del nel gene CFTR è possibile rilevare la presenza di questo
marker tramite una variazione di 3 bp nella dimensione del picco F508del e del picco specifico mutante
I507del.
Laddove sia presente un singolo allelo mutante, si osserverà il picco mutante I507del come picco celeste
a circa 159 bp. Si osserverà la presenza di un picco wild-type per F508, ma a un’altezza di picco pari
all’incirca la metà di quella normalmente associata a un genotipo wild-type omozigote; questo viene
osservato come un picco verde a circa 167 bp. Si osserverà anche un altro picco verde a circa 164 bp.
Campione eterozigote I507del
Un campione I507del/F508del produrrà un picco WT F508del verde spostato all’incirca a 164 bp (3 bp in
meno rispetto alla norma), un picco M F508del celeste a 166 bp e un picco M I507del celeste all’incirca a
159 bp.
Un campione I507del/I507del produrrà un picco blu all’incirca a 159 bp e un singolo picco verde all’incirca
a 164 bp (3 bp in meno rispetto al picco F508del normale osservato quando non è presente I507del).
CF2EUBYIT 002
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F508del
La presenza di una mutazione F508del impedisce l’azione del primer I507del WT. Quindi un individuo
omozigote per F508del non presenterà un piccolo I507del WP nella miscela WT (vedere in basso).
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per F508del un picco I507del
WT di altezza ridotta e 2 picchi distanti 3 bp l’uno dall’altro nelle posizioni 10 e 12 nella miscela WT
(vedere sotto).
Inserimenti e delezioni
Per come è stato concepito il kit CF-EU2v1, la presenza di inserzioni o delezioni tra due primer opposti
darà luogo a cambiamenti nelle dimensioni in tutti gli ampliconi prodotti tra questi due primer. Pertanto,
oltre alle 50 mutazioni rilevate dal kit CF-EU2v1, ogni inserzione e delezione nell’ambito delle sequenze
bersaglio può essere rilevata dal cambiamento nelle dimensioni attese degli ampliconi nella miscela di
wild-type (B). Questi sono stati classificati e sono disponibili in un documento separato sul sito web di
Elucigene Diagnostics:
www.elucigene.com/products
Di seguito sono riportati esempi di inserzioni e delezioni rilevate dal kit e il loro impatto sul profilo della
miscela B:
F508del/1677delTA
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per le mutazioni
F508del/1677delTA due picchi distanti 1 bp l’uno dall’altro nella posizione 12 (V520F WT).
V520F
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote sarà osservato un picco wild-type di altezza ridotta
nella posizione 10 (1677delTA WT) per la mutazione V520F poiché questa impedisce l’azione del primer
1677delTA WT. I picchi 10 e 12 non saranno presenti nei risultati di un individuo omozigote per la
mutazione V520F.
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394delTT
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione 394delTT due
picchi distanti 2 bp l’uno dall’altro nelle posizioni 35 (G85E WT), 42 (P67L WT) e 44 (E60X WT). Nei
risultati di un individuo omozigote per la mutazione 394delTT il picco 34 non sarà presente e i picchi 35,
42 e 44 presenteranno l’altezza prevista ma spostati di 2 bp e di dimensioni inferiori a quelle previste.
F508del/CFTRdele2,3
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione CFTRdele2,3
picchi di altezza ridotta nelle posizioni 34 (394delTT), 35 (G85E WT), 41 (CFTRdele2,3 WT), 42 (P67L
WT) e 44 (E60X WT). I picchi 34, 35, 41, 42 e 44 non saranno presenti nei risultati di un individuo
omozigote per la mutazione CFTRdele2,3.
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444delA
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione 444delA due
picchi distanti 1 bp l’uno dall’altro nelle posizioni 30 (R117H WT), 31 (R117C WT), 33 (Y122X WT) e 47
(621+1 WT). Nei risultati di un individuo omozigote per la mutazione 444delA il picco 27 non sarà
presente e i picchi 30, 31, 33 e 47 presenteranno l’altezza prevista ma spostati di 1 bp e di dimensioni
inferiori a quelle previste.
2347delG
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione 2347delG due
picchi distanti 1 bp l’uno dall’altro nelle posizioni 39 (2184delA WT) e 43 (2143delT WT). Nei risultati di un
individuo omozigote per la mutazione 2347delG il picco 16 non sarà presente e i picchi 39 e 43
presenteranno l’altezza prevista ma spostati di 1 bp e di dimensioni inferiori a quelle previste.
3905insT
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione 3905insT due
picchi distanti 1 bp l’uno dall’altro nella posizione 26 (S1251N WT). Nei risultati di un individuo omozigote
per la mutazione 3905insT il picco 24 non sarà presente e il picco 26 presenterà l’altezza prevista ma
spostato di 1 bp e di dimensioni superiori a quelle previste.
CF2EUBYIT 002
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R1158X
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote sarà osservata per la mutazione R1158X
un’altezza di picco ridotta nella posizione 49 (R1162X WT). Il picco 49 non sarà presente nei risultati di
un individuo omozigote per la mutazione R1158X.
Polimorfismo rs4148721 (delAT) nell’introne 22
Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote per il polimorfismo rs4148721 (delezione di AT)
nell’introne 22 saranno osservati due picchi distanti 2 bp l’uno dall’altro nelle posizioni 45 (3659delC WT),
49 (R1162X WT) e 50 (R1158X WT). Nei risultati di un individuo omozigote per il polimorfismo rs4148721
i picchi 45, 49 e 50 presenteranno l’altezza prevista ma spostati di 2 bp e di dimensioni inferiori a quelle
previste.
Altre osservazioni
V520F – Polimorfismo 1584G>A nell’esone 12
1584G>A è stato identificato come un polimorfismo che interferisce con l’amplificazione del mutante
V520F e della sequenza wild-type. In un individuo eterozigote per il polimorfismo 1584G>A, si osserverà
un’altezza ridotta del picco in posizione 12 (V520F). In un individuo omozigote per il polimorfismo
1584G>A, il picco 12 cadrà al di fuori della miscela B. Un individuo eterozigote per la mutazione F508del
ed eterozigote per la mutazione 1584G>A mostrerà un solo picco 12 nella miscela B anziché i due picchi
attesi in posizione 12 che si vedono normalmente in un eterozigote F508del (vedere esempio sotto). In un
individuo eterozigote per la mutazione V520F e per il polimorfismo 1584G>A sullo stesso allele, il picco
12 cadrà al di fuori della miscela A; tale risultato non è ancora stato osservato e si tratta probabilmente di
una combinazione rara.
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Reattività crociata
Durante lo sviluppo del test, è stato fatto tutto il possibile per evitare che la presenza di altri polimorfismi e
mutazioni segnalati nel gene CFTR interferisse con il funzionamento del test.
La mutazione rara R1283M è stata analizzata per reattività crociata e non è stata rilevata dal kit
Elucigene CF-EU2v1. Inoltre, sono stati rilevati dal test i seguenti polimorfismi: 1655T/G (F508C),
1651A/G.
L’analisi di mutazioni e polimorfismi noti nel gene CFTR ha evidenziato i seguenti effetti sui risultati del kit
Elucigene CF-EU2v1:
1. Il primer mutante G551D nella miscela A rileverà anche la mutazione S549RT>G. Questa verrà
marcata dal software di analisi come picco 20. La miscela B non presenterà un corrispondente picco
wild-type.
2. Il primer mutante 2184delA nella miscela A produrrà reattività crociata con la sequenza di DNA
mutante 2183AA>G generando un picco mutante nella posizione 2184delA.
3. Il primer mutante 1078delT nella miscela A produrrà reattività crociata con la sequenza di DNA
mutante F316L generando un picco mutante nella posizione 1078delT.
4. Il primer mutante R347P nella miscela A produrrà reattività crociata con la sequenza di DNA mutante
R347H generando un picco mutante nella posizione R347P di altezza ridotta rispetto al vero picco
R347P.
5. La presenza del polimorfismo F508C (1655T>G) causerà la riduzione dell’altezza del picco I507del
nella miscela B di CF-EU2v1.
6. La presenza di R117H causerà la riduzione dell’altezza del picco R117C nella miscela B di CF-EU2v1.
In un campione omozigote per R117H il picco R117C sarà assente.
7. La presenza di G85E causerà la riduzione dell’altezza del picco 394delTT nella miscela B di CFEU2v1. In un campione omozigote per G85E il picco 394delTT sarà assente.
8. Talvolta si può osservare un piccolissimo picco artefatto nella posizione I507del dei risultati di un
F508del eterozigote e in particolare in un campione omozigote F508del.
9. Le seguenti mutazioni, per le quali non è stata verificata la reattività crociata per mancata disponibilità
di campioni pertinenti, possono interferire con il funzionamento del test: R117P, R117L, 1717-2A>G,
621+2T>C, 621+2T>G, R553G, R553Q, R347L, I506T, I506S, I506V e la rara combinazione di I507del
con il polimorfismo 1651A/G.
Caratteristiche dell’esecuzione del test
Centodieci campioni di DNA estratto da sangue intero liquido (trattato con EDTA) sono stati analizzati in
cieco utilizzando Elucigene CF-EU2v1. Cinque campioni non hanno prodotto risultati dopo la PCR a
causa della bassa concentrazione di DNA (inferiore a 1,5 ng/μl). Di quelli che hanno prodotto risultati
interpretabili 96 erano normali, 5 erano eterozigoti per F508del, 1 era eterozigote per 1717-1G>A, 1 era
eterozigote per G551D, 1 era eterozigote per 621+1G>T, 1 era eterozigote per G542X e 1 era eterozigote
composto per G542X/F508del.
Novantuno campioni di DNA estratto da gocce di sangue essiccate su carta da filtro sono stati analizzati
in cieco utilizzando Elucigene CF-EU2v1. Per cinque campioni l’amplificazione non è riuscita. Dei
campioni amplificati, 20 non hanno soddisfatto i criteri di analisi per l’interpretazione dopo essere stati
iniettati per 12 secondi in un analizzatore genetico 3500; tutti i campioni che non hanno prodotto risultati
erano correlati a una bassa concentrazione di DNA (inferiore a 1,5 ng/μl). I 20 campioni che non hanno
prodotto risultati sono stati nuovamente iniettati nell’analizzatore genetico 3500 per 36 secondi e
analizzati; 7 campioni non hanno soddisfatto i criteri di analisi per l’interpretazione. Dei 79 campioni che
hanno fornito risultati interpretabili, 38 erano normali, 5 erano eterozigoti per F508del, 3 erano eterozigoti
per G551D, 3 erano eterozigoti per W1282X, 2 erano eterozigoti per D1152H e 2 erano eterozigoti per
G542X.
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Elucigene® CF-EU2v1 Istruzioni per l’uso
Sono stati individuati anche quattro eterozigoti composti: 3120+1G>A/F508del, R117H/F508del,
R1162X/F508del e R553X/F508del. Inoltre, i seguenti campioni eterozigoti sono stati osservati una sola
volta: E60X, G85E, 394delTT, Y122X, 621+1G>T, 1078delT, R334W, R347P, A455E, I507del, 17171G>A, R553X, 1811+1.6kbA>G, 1898+1G>A, 2184delA, W846X, 3272-26A>G, Y1092X, 3659delC,
3849+10kbC>T, S1251N e N1303K.
Quarantasei campioni di DNA, rappresentativi di tutte le 50 mutazioni, rilevati dal kit CF-EU2v1 sono stati
amplificati in cinque momenti diversi. Tutti i campioni hanno prodotto i risultati attesi senza falsi negativi o
falsi positivi, dimostrando una specificità e una sensibilità dal punto di vista clinico del 100%.
Risoluzione dei problemi
Queste istruzioni per l’uso vengono fornite per garantire un rendimento ottimale del test. Gli operatori
devono attenersi alle procedure fornite. Ogni deviazione dalle procedure può dar luogo a un rendimento
non ottimale e a dati di scarsa qualità. Una Guida alla risoluzione dei problemi viene fornita su richiesta
da Elucigene Diagnostics e contiene esempi e soluzioni per alcune delle più frequenti osservazioni
relative a Elucigene CF-EU2v1, tra cui:




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

Nessun picco diagnostico o STR
Picchi diagnostici o STR deboli
Picchi di fondo/di breakthrough in eccesso
Picchi non marcati
Picchi deboli FAM (mutanti)
Profilo della miscela A non bilanciato
Profilo della miscela B non bilanciato
Picchi sdoppiati (split peaks) nel profilo della miscela B
Per ottenere una copia della Guida alla risoluzione dei problemi Elucigene CF-EU2v1, rivolgersi al gruppo
dell’assistenza tecnica:
T: +44 (0) 161 669 8122
F: +44 (0) 161 669 8129
E: [email protected]
E: [email protected]
Limiti della procedura
1.
I risultati ottenuti da questo o qualsiasi altro test diagnostico devono essere usati e interpretati solo
nel contesto del quadro clinico generale Elucigene Diagnostics non è responsabile delle eventuali
decisioni cliniche adottate.
2.
Il mancato rilevamento delle mutazioni da parte di questo kit non esclude la presenza di altre
mutazioni nel gene CFTR. È possibile che siano presenti altre mutazioni non rilevate da questo kit.
3.
La frequenza delle mutazioni varia tra popolazioni differenti. I dati sulla frequenza delle mutazioni
nelle popolazioni sono disponibili presso il Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium (6).
L’operatore che ha utilizzato questo kit è tenuto a sottolineare l’importanza di queste considerazioni nel
riportare i risultati al medico o al consulente genetico che esegue la diagnosi.
Dichiarazione di non responsabilità
I risultati di questo e degli altri test diagnostici devono essere interpretati congiuntamente agli altri dati
clinici e di laboratorio a disposizione del medico.
Questi reagenti Elucigene vengono forniti per l’esecuzione di test diagnostici in vitro.
Ulteriori dettagli per l’interpretazione dei dati sono disponibili nelle procedure descritte nella Guida al
software di analisi Elucigene CF-EU2v1:
www.elucigene.com/products
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Elucigene® CF-EU2v1 Istruzioni per l’uso
Bibliografia
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Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 1998;132:589–95.
2. De Braekeleer M, Allard C, Leblanc JP, Simard F, Aubin G. Genotype-phenotype correlation in cystic
fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation. Hum Genet. 1997;101:208–11
3. Drumm ML, Konstan MW, Schluchter MD, Handler A, Pace R, Zou F, Zariwala M, Fargo D, Xu A,
Dunn JM, Darrah RJ, Dorfman R, Sandford AJ, Corey M, Zielenski J, Durie P, Goddard K, Yankaskas
JR, Wright FA, Knowles MR. Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis. N Engl J Med.
2005;353:1443–53
4. Goss CH, Newsom SA, Schildcrout JS, Sheppard L, Kaufman JD. Effect of ambient air pollution on
pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med.
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5. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, and Tsui
LC. “Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Genetic Analysis.” Science 1989; 245 (4922): 1073-8
6. Cystic Fibrosis Mutation Database, www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app
7. Joshua D. Groman et al. Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of
the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign. Am J
Hum Genet. 2004; 74(1): 176–179.
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System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989).
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10. PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press: Section 1
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AVVISO PER L’ACQUIRENTE: LICENZA LIMITATA
I polinucleotidi marcati con coloranti VIC, NED e PET e/o il rispettivo impiego possono essere coperti da
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diritti limitati non trasferibili secondo specifiche rivendicazioni di alcuni brevetti appartenenti ad Life
Technologies Corp, che prevedono l’uso della sola quantità stabilita di prodotto esclusivamente per
procedure condotte dall’acquirente a scopo di rilevamento del/dei target nel settore della diagnostica
umana. Non sono concessi altri diritti. Per altre informazioni sull’acquisto di licenze relative ai coloranti
sopra indicati, rivolgersi al Director of Licensing, [email protected].
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