16/03/15
Una caratteristica fondamentale degli organismi
viventi è l’alto grado di CONTROLLO esercitato in
quasi tutti i loro processi.
Ogni organismo è in grado di rispondere a
modificazioni ambientali, di mantenere
comunicazioni intra- ed extracellulari e di seguire
un ordinato programma di crescita e sviluppo
mediante una grande varietà di meccanismi di
regolazione.
La regolazione viene esercitata ad ogni livello nei
sistemi biologici: dal controllo dell’espressione
genica al controllo delle velocità di reazione degli
enzimi.
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Coordinazione di numerosi processi metabolici
CONTROLLO
DELLA
DISPONIBILITA’
quantità
DELL’ENZIMA
CONTROLLO AL
LIVELLO DEL
SUBSTRATO
CONTROLLO
NEI VARI
DISTRETTI
CELLULARI
CONTROLLO
DELL’ATTIVITA’
ENZIMATICA
CONTROLLO
IMMEDIATO
ISOZIMI O
ISOENZIMI
Sintesi e
Degradazione
Alterazioni
strutturali
che
coinvolgono
il sito attivo
Variazioni nella
concentrazione
del substrato
MODULATORI
EFFETTORI ALLOSTERICI
L’analogia tra la cellula vivente e una
fabbrica è particolarmente appropriata se si
considera il ruolo degli enzimi. La cellula ha
infatti a disposizione certe materie prime
(substrati) e deve ottenere specifici prodotti
a partire da queste.
I macchinari nella cellula deputati a questa
funzione sono gli enzimi che si trovano
spesso disposti in “catene di montaggio”
in modo da eseguire in sequenza le fasi
necessarie di una determinata via
metabolica.
Tuttavia un complesso industriale efficiente non può essere tale se ogni
sua macchina viene fatta funzionare alla massima velocità. Prodotti
intermedi si accumulerebbero in alcune linee della catena di montaggio e
alcune parti del prodotto finito sarebbero prodotte in largo eccesso.
Risulta chiaro quindi il ruolo fondamentale della coordinazione e
regolazione delle attività enzimatiche.
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Più alta è la concentrazione di substrato e più rapidamente
avviene al reazione enzimatica (fino alla saturazione
dell’enzima), al contrario, alte concentrazioni di prodotto
tendono a inibire la trasformazione del substrato, in questo
caso il prodotto può agire da inibitore competitivo.
Glucosio + ATP
glucosio-6-P + ADP
Tuttavia il controllo a livello del substrato non è sufficiente
per la regolazione di molte vie metaboliche, in altre
situazioni è indispensabile che l’enzima sia regolato da
alcune sostanze completamente diverse dal substrato o dal
proprio prodotto.
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In ogni sistema enzimatico, in cui vi sia una sequenza di
reazioni catalizzate da diversi enzimi (il prodotto del primo
enzima diventa il substrato del secondo), vi è almeno un
enzima che influenza in modo determinante la velocità
complessiva in quanto
CATALIZZA LA REAZIONE PIU’ LENTA.
Enzima 1
A
Enzima 3
Enzima 2
B
C
D
Enzima 4
E
Inoltre, in generale, il primo enzima della sequenza metabolica è
un enzima regolatore, in questo modo si evita di sottrarre
metaboliti e energia ad altre sequenze di reazioni importanti.
La cellula può controllare la formazione del prodotto
finale tramite attivazione o inibizione di un passaggio
della via metabolica. Il sistema più efficiente è quello di
agire sul primo passaggio.
Enzima 1
A
Enzima 2
B
C
Enzima 3
D
Enzima 4
E
La trasformazioni di A in B viene quindi controllata da E:
questo processo è chiamato feedback o, più
precisamente feedback negativo in quanto un aumento
della concentrazione di E ha come conseguenza una
diminuzione della sua velocità di formazione.
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Enzima
1
A
O
B
Enzima
2
C
D
O
B
C
E
Feedback negativo
D
A
Enzima
4
Enzima
3
E
F
G
L
M
N
O O
O
O
K
O
Feedback positivo
INIBIZIONE E ATTIVAZIONE DUE FENOMENI ESSENZIALI PER LA
REGOLAZIONE DEL METABOLISMO
Il termine allosterico deriva dal greco (allos=altro; stereo=
spazio, forma) e significa che gli enzimi così definiti
possono assumere altre conformazioni indotte dal legame di
opportuni modulatori.
Gli enzimi allosterici sono proteine oligomeriche costituite
da diverse subunità e con parecchi siti attivi. Le interazioni
allosteriche (cooperative) avvengono quando il legame di
un ligando ad un sito specifico viene influenzato dal legame
di un altro ligando, detto effettore o modulatore, a livello di
siti diversi nella proteina.
Se i ligandi sono identici l ’ effetto viene definito
omotropico, mentre se i ligandi sono diversi, viene detto
eterotropico. Questi effetti possono essere sia positivi che
negativi a seconda che il ligando aumenti o diminuisca
l’affinità del legame alla proteina.
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Gli enzimi non allosterici hanno un andamento iperbolico delle
curve di V in funzione di [S].
Gli enzimi allosterici che legano il substrato in modo
cooperativo danno curve di tipo sigmoide. A basse
concentrazioni di [S] l’enzima si comporta come se avesse una
debole capacità di legame (KM elevata), all’aumentare di [S]
viene indotto un aumento di quantità di substrato legato e quindi
l’efficienza catalitica dell’enzima.
Effetto
Omoallosterico
Estremo
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16/03/15
Come l’emoglobina, l’enzima
allosterico presenta una curva
sigmoidale. Ma se per l’emoglobina la
curva spiega sia l’efficienza di legame
che di rilascio dell’ossigeno, per
l’enzima allosterico, rende più
efficace il controllo al livello del
substrato
Nelle curve che descrivono l’andamento delle
velocità iniziali di reazione (V0) in funzione di [S] di
un enzima allosterico, il valore di concentrazione di
substrato a cui si ha una velocità pari a metà della
Vmax viene definito [S]0.5 o K0.5.
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Gli Enzimi allosterici possono presentare diversi tipi di
regolazione.
Gli effettori eterotropici
possono agire in due modi
diversi:
Effettori eteroallosterici
positivi: determinano un
aumento della cooperatività
di legame del substrato.
Effettori eteroallosterici
negativi: determinano una
diminuzione della
cooperatività di legame del
substrato.
Sono stati sviluppati diversi modelli allo scopo di
descrivere i meccanismi molecolari mediante i quali
viene modulata l’attività delle proteine allosteriche.
Il modello più noto per descrivere il legame
cooperativo di un ligande ad una proteina è il modello
simmetrico dell’allosterismo, sviluppato nel 1965 da
J. Monod, J. Whyman e J.P. Changeaux (detto MWC).
In questo modello l’enzima deve esistere solo in
due conformazioni, una ad alta affinità e una a
bassa affinità. In assenza di substrato praticamente
tutte le molecole sono nella forma a bassa affinità.
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una proteina allosterica è un
oligomero costituito da protomeri
(subunità) simmetricamente correlati;
ogni protomero può esistere in due
stati conformazionali, chiamati T
(tensed) e R (relaxed) in EQUILIBRIO
TRA LORO;
- Il legame del ligando sposta
l’equilibrio in favore di R.
-il cambiamento conformazionale è
concertato perché è esclusa la
formazione di specie intermedie con
parte delle subunità a bassa e alta
affinità.
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Nel modello simmetrico dell’allosterismo gli effettori
omotropici (substrato) ed eterotropici (attivatori) positivi
si legano preferenzialmente alla forma R stabilizzandola,
mentre gli effettori eterotropici negativi (inibitori) si
legano allo stato T rendendolo più stabile.
T
R
Il modello simmetrico fornisce una ragionevole
razionalizzazione delle proprietà di legame del ligando in
parecchie proteine ed enzimi. Vi sono però diverse valide
obiezioni a questo modello:
1) E’ difficile credere che la simmetria oligomerica sia
invariabilmente conservata in tutte le proteine a seguito
del legame del ligando;
2) Il modello può descrivere solo effetti omotropici positivi,
ma non quelli negativi.
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Koshland, Nemethy e Filmer nel 1966 proposero un modello
confermato in molti enzimi mediante analisi ai raggi X.
Essi adottarono l’ipotesi dell’adattamento indotto per spiegare
gli effetti allosterici. Nel modello sequenziale il legame del
substrato induce una modificazione conformazionale in un
protomero (subunità); le interazioni cooperative derivano dagli
effetti che queste variazioni conformazionali hanno sulle subunità
vicine. L’affinità dell’enzima per il legame del substrato varia con
il numero di molecole di substrato legate, passando attraverso
una serie di forme intermedie ad affinità diversa.
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16/03/15
Il modello simmetrico (MWC) IMPLICITAMENTE assume il
modello si Fischer a “chiave serratura” per il legame dei
ligandi. In questo modello i siti di legame vengono considerati
rigidi e complementari come forma al loro ligando.
Nell ’ ipotesi dell ’ adattamento indotto (sequenziale), più
sofisticata, si postula invece che un’interazione flessibile tra
substrato e enzima induca una modificazione conformazionale
dell’enzima stesso (trasmessa attraverso l’interfaccia tra le
subunità) che porta ad un aumento graduale
della
affinità
dell’enzima
per il
substrato.
Un ottimo esempio di regolazione allosterica dell’attività
enzimatica è dato dall’enzima aspartato transcarbamilasi
(ATCasi). Esso catalizza la prima tappa della biosintesi delle
pirimidine ed è un enzima che presenta una inibizione a
feedback negativo.
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16/03/15
Questo enzima possiede un
legame omotropico di tipo
cooperativo positivo per
entrambi i suoi substrati
(aspartato e carbamil
fosfato). Inoltre, l’ATCasi
v i e n e i n i b i t a
eterotropicamente dalla
citidina trifosfato (CTP), un
nucleotide pirimidinico,
mentre viene attivata
eterotropicamente dall’ATP.
D
A
B
C
O
E
F
CTP
L
M
ATP
O
K
L’ATCasi di E.coli ha una
composizione in subunità di tipo
C6R6 dove C ed R sono
rispettivamente le subunità
catalitiche e regolatrici.
Le subunità catalitiche sono
organizzate in due trimeri (C3) e
dissociate mantengono l’attività ma
presentano curve di saturazione da
substrato iperboliche non
cooperative. Pertanto, solo
nell’enzima in forma nativa si
manifesta l’attività allosterica e le
subunità regolatrici modulano
l’attività delle subunità catalitiche.
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16/03/15
come predetto
dalla teoria
dell’allosterismo,
l’attivatore ATP si
l
e
g
a
preferenzialment
e a l l a AT C a s i
attiva (stato R ad
alta affinità per il
substrato),
mentre l’inibitore
CTP si lega alla
forma inattiva
dell’enzima
(stato T o a bassa
affinità per il
substrato.
Utilizzando l’analogo bisubstrato (PALA) non reattivo che
si lega saldamente all’ATCasi nella conformazione R, ma
non a quella T, è stato possibile studiare la struttura ai
raggi X della proteina nei due stati e conoscere le
differenze conformazionali responsabili della
modulazione allosterica.
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16/03/15
Sito
catalitico
Sito regolatore
ATCasi: conformazione T
ATCasi: conformazione R
TUTTE LE VIE METABOLICHE SONO SOGGETTE A
COMPLESSI CONTROLLI A FEEDBACK DOVE NELLA
QUASI TOTALITA’ DEI CASI VENGONO ADOPERATI
ENZIMI ALLOSTERICI MULTIPLI
Gli organismi viventi sono in grado, tramite gli
enzimi allosterici, di regolare il METABOLISMO in
modo fine e diversificato.
Tuttavia questo tipo di regolazione NON
BASTA per tutte le esigenze dell’organismo
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16/03/15
Come in una fabbrica che chiude
un settore il cui prodotto finale in
quel momento non è
commerciabile, per riaprirlo in un
secondo momento
commercialmente più conveniente,
così esistono alcune vie
metaboliche (settori)
del metabolismo (fabbrica) che devono essere chiuse o aperte
in momenti opportuni.
QUALI SONO QUESTE VIE?
QUANDO DEVONO ESSERE
APERTE O ESSERE CHIUSE?
COME VENGONO APERTE O
CHIUSE?
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16/03/15
VIE METABOLICHE CHE DEVONO ESSERE
O
COMPLETAMENTE APERTE
O
COMPLETAMENTE CHIUSE
enzimi che sono completamente attivi o inattivi fino a che non
vengono trasformati da una modificazione covalente che li
rende capaci di funzionare o smettere di funzionare
LA REVERSIBILITA’ E’ DETERMINATA
DA REAZIONI INVERSE
MODIFICAZIONE
COVALENTE
REVERSIBILE
MODIFICAZIONE
COVALENTE
IRREVERSIBILE
La regolazione da legame covalente è dovuta ad enzimi che
catalizzano la formazione o la rotture di legami covalenti.
In alcune circostanze la variazione covalente può essere
considerata come un INTERRUTTORE MOLECOLARE che
può aprire o chiudere un’attività enzimatica e quindi, in
alcuni casi, una via metabolica.
La fosforilazione è un esempio molto comune di
modificazione covalente, altri esempi molto importanti sono
la rottura di un legame peptidico e la formazione di un ponte
disolfuro.
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16/03/15
L’attività di molti canali di membrana, enzimi e altre proteine
bersaglio è regolata mediante fosforilazione.
I diretti responsabili delle fosforilazioni sono enzimi detti
proteina chinasi. Ognuno di questi enzimi catalizza il
trasferimento di un gruppo fosforico dall’ATP a un gruppo
PROTEINA
ossidrilico di una
catena lateraleCHINASI
di serina, di una treonina o di
una tirosina di una proteina bersaglio (substrato della
chinasi).
Il distacco idrolitico del gruppo fosforico dalla proteina
fosforilata viene catalizzato da un enzima noto con il nome di
proteina fosfatasi. Una proteina bersaglio (substrato) può
essere ripetutamente fosforilata e defosforilata.
PROTEINA FOSFATASI
Le chinasi e le
fosfatasi sono
catalizzatori
altamente
selettivi: la
fosforilazione di
catene laterali di
AA diverse,
all’interno della
stessa proteina
bersaglio,
avviene ad opera
di chinasi
differenti.
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16/03/15
La forma attivata della
glicogeno fosforilasi,
nella glicogenolisi,
opera la rimozione dei
residui di glucosio dai
depositi di glicogeno,
scindendo e
fosforilando il residuo
all’estremità non
riducente delle catene
di glicogeno. Il
glucosio-1-fosfato che
si libera diventa
disponibile come fonte
di energia per le
cellule.
Nel muscolo scheletrico la glicogeno fosforilasi è un dimero
contenente due catene polipeptidiche identiche di 97,4
Kdalton. Esiste in due forme : una fosforilasi a , fosforilata
sulla serina 14, attiva e una fosforilasi b, non fosforilata e
meno attiva. L ’ attivazione mediante fosforilazione è
catalizzata da una fosforilasi b chinasi, che trasferisce il
gruppo fosforico dall’ATP ai due residui di serina . La
disattivazione è provocata da una specifica fosforilasi
sfosfatasi
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16/03/15
Due forme di glicogeno fosforilasi
FOSFORILASI b CHINASI
ADP
ATP
fosforilasi b
dimero inattivo
fosforilasi a
dimero attivo
Aggiunge un fosfato alla
serina 14 della fosforilasi b
FOSFATASI
Catalizza la rimozione del fosfato
IDROLISI
La conversione della glicogeno fosforilasi dalla forma
inattiva (b) a quella attiva (a) è in realtà l’ultimo evento di
una serie di reazioni che hanno inizio quando la superficie
della cellula viene raggiunta da uno specifico ormone,
l’ADRENALINA.
In una sequenza di reazioni note come regolazione a
cascata, il segnale dato da una singola molecola ormonale
che prende contatto con la superficie cellulare viene
AMPLIFICATO per trasformare molte molecole di
fosforilasi b in fosforilasi a.
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16/03/15
La combinazione ormonerecettore attiva l’adenilato
ciclasi
ATTIVATORE ALLOSTERICO DELLE
PROTEINE CHINASI c-AMP DIPENDENTI
Serie di
attivazioni
covalenti
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16/03/15
Nei sistemi biologici molti
trasmettitori di segnali
chimici che agiscono tra
organi e tessuti diversi, come
le molecole di ORMONI,sono
presenti in CONCENTRAZIONI
MOLTO BASSE, ciò nonostante
possiedono un’elevata
attività biologica
sull’ORGANISMO BERSAGLIO
B
A
D
C
E
F
AMPLIFICAZIONE
Poiché tutti i passaggi sono catalizzati da ENZIMI e il PRODOTTO
di ogni passaggio è il CATALIZZATORE della reazione successiva,
ognuno di essi provoca un AUMENTO del RAPPORTO
PRODOTTO/CATALIZZATORE
Nel muscolo 10-10moli/gr
molecole di adrenalina
2x10-6 molecole di glucosio
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16/03/15
SISTEMA COSTITUITO DA UN ENZIMA CHE,
AGENDO SU UN SECONDO ENZIMA, NE DETERMINA
UNA MODIFICAZIONE COVALENTE
PAURA RABBIA
DEMOLIZIONE
GLICOGENO
ADRENALINA
GLUCOSIO
ATP
MUSCOLO IN FUNZIONE
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16/03/15
La regolazione della glicogeno fosforilasi non avviene solo
mediante fosforilazione, ma tale enzima viene anche modulato
allostericamente.
Questo enzima è infatti potenzialmente attivo anche quando
si trova nella forma b, forma che è fortemente inibita da
glucosio e ATP e attivata da AMP.
Se a una cellula che già possiede sufficienti riserve di glucosio
arriva un segnale (ormonale) che attiva il sistema delle
fosforilasi, l’enzima viene attivato finché quelle riserve non
siano esaurite. Anche, alti livelli di AMP , intracellulare,
significano per la cellula una bassa carica energetica e quindi
necessità di mobilitare riserve di energia.
Quindi, a bassi livelli di glucosio e ATP la fosforilasi b inizia la
demolizione del glicogeno anche in assenza di uno stimolo
ormonale necessario a convertirla nella forma a.
A basse concentrazioni di glucosio e ATP la glicogeno
fosforilasi b può iniziare la demolizione del GLICOGENO anche
in assenza di uno STIMOLO ORMONALE (adrenalina o
glucagone) necessario a convertirla nella FORMA a
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16/03/15
L’enzima chiave coinvolto nella costruzione del glicogeno, la
glicogeno sintasi, trasferisce un’unità attivata di glucosio alla
volta a una catena di glicogeno in fase di crescita.
Esso può esistere negli stati fosforilato e defosforilato. La forma
fosforilata della sintasi è inattiva in vivo, mentre la forma
defosforilata è in grado di esprimere il suo potere catalitico.
GLICOGENO SINTASI
Per la glicogeno fosforilasi è vero invece il contrario: la forma
fosforilata della proteina è quella più attiva. Per i due enzimi, il
rapporto tra forme attive e forme inattive dipende
sostanzialmente dalla concentrazione di proteina chinasi e
proteina fosfatasi attive.
GLICOGENO FOSFORILASI
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16/03/15
26
16/03/15
Molti enzimi acquistano la loro piena capacità catalitica quando
assumono la loro struttura tridimensionale caratteristica. Altri
enzimi vengono sintetizzati come precursori e successivamente
attivati mediante rottura di uno o più legami peptidici specifici.
Vi sono molti esempi di attivazione per proteolisi specifica nei
sistemi biologici:
Gli enzimi digestivi
Sono tutte sintetizzate nel pancreas
e vengono poi secrete attraverso il
dotto pancreatico nel tratto
duodenale dell’intestino tenue. Per
non danneggiare il tessuto
pancreatico, vengono prodotte
sottoforma di molecole di
dimensioni lievemente maggiori
(zimogeni: tripsinogeno,
chimotripsinogeno, proelastasi,
ecc.)
che devono essere
proteolizzate specificamente
nell ’ intestino per produrre gli
enzimi attivi.
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16/03/15
Le proteasi scindono il
legame peptidico
STIMOLO ORMONALE
generato dall’arrivo del contenuto gastrico
Sintesi PROTEASI
nel PANCREAS
ZIMOGENI proteine di dimensioni
lievemente maggiori
CATALITTICAMENTE INATTIVE
Attivazione per
proteolisi
dotto pancreatico
TRATTO DUODENALE
INTESTINO TENUE
Poiché l’attivazione della tripsina può essere autocatalitica,
il pancreas si protegge dalla digestione anche mediante la
sintesi di un forte inibitore competitivo: l ’ inibitore
pancreatico secretorio della tripsina.
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16/03/15
Gli ZIMOGENI inattivi possono
essere una potenziale fonte di
pericolo per il PANCREAS
GRANULI DI
ZIMOGENO
vescicole
intracellulari le cui pareti sono
probabilmente resistenti alla
degradazione proteolitica
INIBITORE
PANCREATICO
INIBITORIO DELLA
TRIPSINA
Efficiente a
concentrazioni
molto basse
Due tagli proteolitici in
sequenza dividono la proteina in
tre peptidi che rimangono uniti
da ponti disolfuro
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Enzimi proteolitici che hanno in comune una serina nel
SITO ATTIVO
Proteasi della coagulazione
CALLICREINA PLASMATICA
FATTOTRE XIIa
FATTOTRE XIa
FATTOTRE IXa
FATTOTRE XII
FATTOTRE VIIa
FATTOTRE Xa
FATTOTRE IIa (trombina)
PROTEINA C ATTIVATA
TRIPSINA
CHIMOTRIPSINA
ELASTASI (pancreatica)
ENTEROCHINASI
Altre classi di proteasi
PROTEASI CISTEINICHE
PROTEASI AD ACIDO ASPARTICO
METALLO-PROTEASI
ENDOPEPTIDASI
Idrolisi dei legami peptidici
all’interno della catena
peptidica
ESOPEPTIDASI
Idrolisi dei legami peptidici
all’esterno della catena
peptidica
Test di diagnosi per stabilire la presenza di SERINA
NEL SITO ATTIVO
DIISOPROPILFOSFOFLUORURO
Reagisce soltanto con la
serina di un sito attivo
POTENTE INIBITORE
IRREVERSIBILE
Reagisce soltanto con la
serina 195 della
chimotripsina
dimostrando che questo
residuo si trova nel sito
attivo
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16/03/15
=
DIPF composto organofosforico
VELENI NERVINI
potente veleno nervino per la
sua capacità di inattivare
H 2O
l’ACETILCOLINAESTRASI,
O
enzima che catalizza l’idrolisi
dell’ACETILCOLINA:
(CH3)3N-CH2-CH2-O-C-CH3 + H2O
NEUROTRASMETTITORE
trasmette gli impulsi nervosi
Acetilcolinaesterasi
attraverso certi tipi di SINAPSI
(CH3)3N-CH2-CH2-OH +
O
C-CH3
=
HO
COMPOSTI CORRELATI
Il DIPF è talmente tossico
per l’uomo (la morte
sopravviene per incapacità
respiratoria) per essere usato
per scopi bellici come
GAS NERVINO
Malathion
La chimotripsina tripsina ed elastasi sono molto simili
Strutture primarie identiche per il 40%
Due domini contenenti estese regioni a struttura β
antiparallela
In tutte, oltre alla SERINA 195 esistono
altri due residui catalittcamente importanti: ISTIDINA
57 e l’ASPARAGINA 102 ( sepolta in una tasca
vicina) che formano una costellazione stabilizzata da
legami ad idrogeno chiamata
triade catalitica
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Ciascuna serina-proteasi mostra una preferenza per l’idrolisi di
legami peptidici adiacenti a particolari tipi di a.a.
TRIPSINA
idrolizza legami peptidici che seguono a.a. basici
LISINA, ARGININA
Tipo tripsina
CHIMOTRIPSINA
idrolizza legami peptidici che seguono a.a. con
catena laterale ingombrante idrofoba TRIPTOFANO,
FENILALANINA, TIROSINA, LEUCINA
Tipo
chimotripsina
ELASTASI
idrolizza legami peptidici che seguono a.a.con catena
Tipo elastina
laterale piccola e idrofoba
ALANINA, GLICINA, VALINA
SELETTIVITA’
PREFERENZA
La tripsina può idrolizzare legami peptidici che
seguono residui aminoacidici idrofobici
TUTTAVIA
Velocità inferiore
L’insieme delle proteasi pancreatiche e intestinali sono
in grado di digerire quasi completamente la maggior
parte delle proteine che saranno assorbite come aa. liberi
dall’epitelio intestinale
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