07/01/2015
Alfa-complementazione
Se il Multiple cloning site viene posizionato all’interno della sequenza codificante
per il peptide a della b-galattosidasi, in caso di inserzione di un frammento di
DNA estraneo, il peptide a non verrà più prodotto.
Questo porta ad una mancata ricostituzione di una b-galattosidasi attiva, con
conseguente fenotipo bianco su piastre addizionate con X-gal.
Controllo della correttezza
del costrutto
Markers
Vettore
Inserto
Esercizio x esame:
disegno primers
Formula standard (per oligo > 15 nt)
Tm= 64.9 °C + 41°C x (n (G+C)-16.4)
N
Esempio: TAATACGACTCACTATAGGG
(20 nt, G+C=8, A+T=12)
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07/01/2015
Vettori di ultima generazione permettono di
superare il clonaggio con nucleasi di restrizione
5’
3’-A
Gene d’interesse (prodotto PCR)
Plac
A-3’
5’
Vettori di ultima generazione permettono di
superare il clonaggio con nucleasi di restrizione e
l’utilizzo della ligasi......
....e dove la reazione di ligazione è catalizzata da
una DNA-topoisomerasi
La DNA-topoisomerasi I introduce e richiude tagli a singola elica in una molecola
di DNA (superavvolto)
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07/01/2015
Tre criteri fondamentali per la produzione di
proteine eterologhe
Espressione ad alto livello, affidabile e stabile
del gene di interesse (livello DNA/RNA)
La proteina prodotta deve mantenere la
propria attività biologica in E. coli (livello
struttura/ conformazione della proteina)
La proteina deve essere facilmente re-isolata
dal rimanente materiale cellulare
Tre criteri fondamentali per la produzione di
proteine eterologhe
Espressione ad alto livello, affidabile e stabile
del gene di interesse (livello DNA/RNA)
La proteina prodotta deve mantenere la
propria attività biologica in E. coli (livello
struttura/ conformazione della proteina)
La proteina deve essere facilmente re-isolata
dal rimanente materiale cellulare
Cosa occorre per l’espressione ad alto
livello di una proteina nella cellula?
Trascrizione/traduzione/stabilità
Promotore forte (trascrizione)
Presenza di segnali per il riconoscimento
dell’mRNA da parte dei ribosomi
(traduzione)
Assenza di proteasi specifiche (stabilità)
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07/01/2015
Il “Promotore perfetto” (?)
UP element
-35
Ext.
-10
D +1
AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattAn
4-6nt
14nt
4-6nt
17nt
Riconosciuto dalla subunità a Riconosciuti dalla subunità s
+1
5-7 nt
An....nAGGAGGnn..nnATG~ ORF (gene di interesse)-TAAnnnnn Term.
(Ribosome Binding Site/
SD box (Shine-Dalgarno)
Terminatore
di trascrizione
Produzione di proteine eterologhe
Domanda:
Un sistema “spinto al massimo”, cioè alto livello
di trascrizione unito ad un alto livello di
traduzione è il meglio che si possa avere per la
produzione di proteine eterologhe?
Risposta: NO
Problemi di “tossicità” di proteine eterologhe, e
della loro conformazione corretta
Tossicità di proteine eterologhe
nell’ospite Escherichia coli
Peso sul bilancio energetico della cellula
batterica
Interazione “erronea” con componenti cellulari:
Legame al DNA
Danno al DNA
Stress ossidativo
Interazione/sequestro di altre proteine essenziali
Induzione di sistemi di risposta allo stress
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07/01/2015
Induzione di un promotore:
un modo di superare problemi di tossicità
Induzione
Crescita non inibita
Crescita bloccata e/o
lisi cellulare
Produzione di proteina
(unità arbitrarie)
Crescita rallentata
Induzione di un promotore:
un modo di superare problemi di tossicità
Induzione
Crescita non inibita
Crescita rallentata
Crescita bloccata e/o
lisi cellulare
Crescita di un ceppo che esprime una
proteina tossica da un promotore costitutivo
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