E’ virtualmente possibile esprimere geni in sistemi di ogni tipo utilizzando
vettori di espressione appropriati, in funzione di esigenze specifiche
I più diffusi:
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Cellule di lievito
Cellule di insetto/sistemi virali
Cellule vegetali
Cellule di mammifero in coltura
La sequenza segnale di 24 aa è rimossa
quando la proteina raggiunge il RER,
con conseguente formazione della
proinsulina.
Nel Golgi sono poi rimossi 33 aa
(connecting sequence) e si instaurano i
legami S-S tra le catene A e B (forma
attiva dell’insulina).
Insulina era ottenuta dal pancreas bovino o porcino
(usati dal 1922)
(3-5 kg di tessuto pancreatico per paziente per anno)
Insulina bovina differisce dall’insulina umana per 3 aminoacidi
Insulina porcina differisce dall’insulina umana per 1 aminoacido
Tali differenze determinano una risposta allergica
L’insulina umana è preferita ed è più sicura
Il gene codificante la proinsulina è stato clonato in un
opportuno plasmide ed espresso in E.coli
L’espressione in E.coli porta alla formazione di corpi di
inclusione ricchi di insulina
Isolamento di insulina dai corpi di inclusione
è un procedimento lungo e costoso
1978: sintesi dei geni codificanti le catene A e B e clonaggio in 2
vettori di espressione.
Aggiunta di una sequenza codificante un peptide leader di 24 aa
all’estremità 5’.
I due costrutti sono adoperati per trasformare cellule di E.coli.
Purificazione delle catene A e B e formazione dei ponti disolfurici
in provetta.
Ampiamente studiato
Facilità di crescita
Vantaggi economici ed “etici”
Le strategie elaborate potrebbero
essere applicabili, in linea di
principio, a tutti i sistemi
Caratteristiche biologico-molecolari che influenzano la produzione di
proteine ricombinanti:
• Natura delle sequenze promotrici e di arresto della trascrizione
• Forza del sito di legame per il ribosoma
• Numero di copie del gene clonato
• Localizzazione cellulare della proteina estranea
• Efficienza della traduzione nell’organismo ospite
• Stabilità intrinseca della proteina estranea nella cellula ospite
Non esiste un’unica strategia che assicuri la massima espressione di ogni
gene clonato.
La maggior parte dei geni clonati possiede proprietà molecolari peculiari,
le quali impongono di investire tempo e lavoro considerevoli prima di
riuscire a trovare un insieme di condizioni specifico, atto a garantire livelli
di espressione accettabili.
CARATTERISTICHE GENERALI
Un vettore per l’espressione eterologa deve contenere i seguenti
elementi:
Origine di replicazione
Marker di selezione
Promotore
Terminatori di trascrizione
Codoni di terminazione della traduzione
Multiple cloning sites
Elementi genetici specifici per determinate applicazioni:
Sequenze segnale per secrezione
Sequenze geniche codificanti partners di fusione
Sequenze geniche codificanti peptidi utili per l’isolamento
Un livello di espressione elevato e costante del gene clonato
spesso risulta nocivo per la cellula ospite
• Drenaggio di energia
• Funzioni essenziali per la cellula ospite sono compromesse
• Perdita del plasmide
Si utilizzano promotori forti e regolabili
Se nel mezzo di coltura manca il lattosio,
il promotore lac di E.coli è represso,
cioè spento, dalla proteina repressore lac,
la quale impedisce la trascrizione
dell’operone lac
L’induzione o l’accensione del promotore
lac
si
ottiene
aggiungendo
al
mezzo lattosio o un suo analogo
(isopropil-β-D-tiogalattopiranoside, IPTG)
Entrambe le sostanze impediscono che il
repressore lac si leghi all’operatore lac,
consentendo perciò la trascrizione
La trascrizione dell’operone lac è regolata anche dal legame della proteina
di attivazione da catabolita (CAP) alla regione del promotore
Legandosi al promotore, la CAP ne accresce l’affinità per l’enzima RNA
polimerasi, determinando un incremento della trascrizione dei geni a valle
del promotore
L’interazione della proteina CAP con il cAMP determina un incremento della
sua affinità per il promotore → l’elevata concentrazione intracellulare di
cAMP (segnale di carenza energetica) può determinare elevati livelli di
trascrizione dei geni a valle del promotore lac
Nei vettori di espressione plasmidici è generalmente presente il promotore
lacUV5, variante del promotore lac, che contiene una sequenza nucleotidica
alterata nella regione -10 ed è più forte del promotore lac presente in natura
Il promotore trp è regolato negativamente dal complesso triptofano-proteina
repressore di trp, che si lega all’operatore trp ed impedisce che l’operone trp
sia trascritto. L’attivazione del promotore trp si ottiene o allontanando il
triptofano o aggiungendo al mezzo di coltura acido 3-indolacrilico.
Il promotore tac è stato realizzato in vitro e comprende la regione -10 (cioè 10
coppie di nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione) del promotore
lac e la regione -35 del promotore trp.
Anche il
promotore
tac
è represso dal repressore lac
dall’aggiunta di lattosio o di IPTG.
ed attivato
Il promotore pL è un promotore del batteriofago λ
E’ controllato dalla proteina repressore cI del batteriofago λ
Per regolare la trascrizione diretta da pL si utilizza generalmente un
mutante termosensibile del repressore cI, denominato cI857
Le cellule in possesso del repressore termosensibile sono fatte
crescere ad una temperatura di 28-30°C, temperatura alla quale il
repressore cI impedisce la trascrizione diretta dal promotore pL
Quando la coltura cellulare ha raggiunto lo stadio di crescita
desiderato (fase log intermedia), si innalza la temperatura a 42°C,
ciò che inattiva il repressore termosensibile cI e consente che la
trascrizione abbia luogo
cI857
X
Gene di interesse
Se si innalza la temperatura
il repressore cI857 (termolabile) si inattiva
→ attivazione della trascrizione
Il promotore del batteriofago T7 è riconosciuto dalla RNA polimerasi del fago
Per servirsi di questo promotore si inserisce il gene della RNA polimerasi T7
nel cromosoma batterico, sotto il controllo del promotre tac
La trascrizione diretta da entrambi i promotori (T7 e tac) è indotta
dall’aggiunta di IPTG
In tali condizioni la polimerasi è prodotta ed il gene clonato è trascritto e
tradotto
Tra il momento in cui è indotta la trascrizione del gene della polimerasi T7 e
quello in cui è trascritto il gene bersaglio si verifica spesso un ritardo di
circa un’ora
Per trarre vantaggio dalla forza del promotore T7 è stata messa a punto una
serie di plasmidi detti vettori pET
Gli elevati livelli di espressione di questo sistema a cascata hanno spesso
reso necessaria l’introduzione nella cellula ospite di un altro plasmide, detto
pLysS, contenente il gene del lisozima del fago T7, che è in grado, legandosi
alla RNA polimerasi T7, di inattivarla
L’RNA polimerasi del fago T7 è così attiva e selettiva che il prodotto proteico
desiderato può costituire più del 50% delle proteine cellulari totali dopo
poche ore di induzione
I livelli di espressione possono essere ridotti diminuendo la concentrazione
di induttore
La riduzione dei livelli di espressione può incrementare la resa di proteina
di interesse in forma solubile
Il legame della proteina di attivazione da catabolita (CAP) alla regione del
promotore dipende dai livelli cellulari di cAMP
I livelli di cAMP sono fortemente influenzati dalla fonte di carbonio
presente nel mezzo di crescita
In presenza di glucosio i livelli di cAMP sono bassi ed il livello di
trascrizione sarà basso, dal momento che si osserverà una riduzione
dell’affinità della proteina CAP per il promotore
Quando il glucosio è assente e la cellula è forzata ad utilizzare una fonte
di carbonio alternativa, ad es. glicerolo, i livelli di cAMP aumentano e la
conseguente formazione del complesso CAP/cAMP attiva la trascrizione
a partire dal promotore lac
Dunque l’induzione completa dell’operone lac è raggiunta solo in
presenza sia dell’induttore sia di elevati livelli di cAMP
L’induttore IPTG lega il repressore, riducendo la sua affinità per l’operatore
lac, con conseguente attivazione della trascrizione
Quando i livelli di cAMP sono sufficientemente elevati, ad es. in assenza di
glucosio, il complesso CAP/cAMP che si forma lega immediatamente la
regione a monte del promotore, attivando ulteriormente la trascrizione
In presenza di glucosio, il complesso CAP/cAMP non si forma e la
trascrizione è ridotta (repressione da catabolita)
Il profago λDE3 codificante la RNA polimerasi T7 è posto sotto il controllo del
promotore L8-UV5, che ha 3 mutazioni puntiformi che lo distinguono dal
promotore lac wild type
Due mutazioni puntiformi nella regione -10 determinano un aumento di forza
del promotore ed una riduzione della sua dipendenza dalla stimolazione
CAP/cAMP
La terza mutazione è localizzata nel sito di legame al complesso CAP/cAMP e
determina una riduzione dell’affinità per tale complesso → tale mutazione
riduce, ma non elimina la sensibilità alla repressione da catabolita
L’effetto delle 3 mutazioni è la creazione di un promotore più forte, ma meno
sensibile all’effetto del glucosio, ciò che consente una forte induzione
dell’espressione della RNA polimerasi da parte dell’IPTG in presenza di
glucosio
Sebbene i promotori lac e L8-UV5 siano repressi in assenza di induttore,
entrambi mostrano una certa attività basale
Nel caso dei lisogeni λDE3, l’espressione di una piccola quota di RNA
polimerasi T7 può provocare problemi se il gene clonato nel vettore pET
codifica una proteina tossica per la cellula ospite → per tale motivo
ulteriori meccanismi di controllo sono costruiti nei vettori pET e negli
organismi ospiti
I vettori con un promotore “T7lac” hanno un promotore T7 seguito da
una sequenza operatore lac
In questi vettori il repressore si lega all’operatore, riducendo la
trascrizione da parte di eventuali molecole di RNA polimerasi T7 che
possono essere espresse in assenza di induttore
Un altro meccanismo di controllo è fornito dall’utilizzo di ospiti batterici
contenenti il plasmide pLysS, che esprime il lisozima T7, una proteina
che lega ed inibisce la RNA polimerasi T7
La necessità di adoperare tali meccanismi di regolazione aggiuntivi
dipende dal tipo di proteina ricombinante che si desidera esprimere → le
proteine più tossiche per le cellule batteriche sono quelle che richiedono
meccanismi di regolazione aggiuntivi
Sebbene il promotore L8-UV5 sia meno sensibile all’attivazione da parte del
complesso CAP/cAMP rispetto al promotore wild type, è stata riscontrata
una riduzione significativa della trascrizione basale in presenza di glucosio
Tale fenomeno risulta importante soprattutto quando gli ospiti batterici,
trasformati con un vettore di espressione pET e non dotati del plasmide
pLysS, sono fatti crescere fino a raggiungere la fase stazionaria
E’ stato infatti osservato che durante la fase stazionaria l’espressione
basale è massima
L’aggiunta di glucosio alla concentrazione finale di 0.5-1.0% al mezzo di
coltura LB previene l’incremento della trascrizione basale osservato in
colture batteriche che raggiungono la fase stazionaria
Uno svantaggio dell’utilizzo del glucosio risiede nel fatto che, dopo una
fase iniziale di crescita rapida, i prodotti del catabolismo del glucosio
determineranno una diminuzione del pH del mezzo di coltura, con
conseguente riduzione della densità cellulare nella fase stazionaria
E’ stato osservato che una forte induzione della trascrizione del gene della
RNA polimerasi T7 può essere ottenuta in presenza di glucosio
Bisogna comunque ricordare che i livelli più elevati di induzione sono
attesi quando il glucosio è assente ed i livelli di cAMP sono elevati
Le condizioni ottimali (inibizione stringente della trascrizione basale ed alti
livelli di espressione indotta) possono essere raggiunte facendo crescere
le cellule batteriche in presenza di glucosio per poi utilizzare un mezzo di
coltura privo di glucosio al momento dell’induzione
I ceppi batterici lisogeni per λDE3, trasformati con i vettori pET, possono
essere fatti crescere in una varietà di mezzi di coltura se le proteine
ricombinanti espresse non sono tossiche
E’ preferibile adoperare sia un vettore pET dotato di un promotore T7lac sia
ospiti batterici dotati del plasmide pLysS nel caso in cui le proteine
ricombinanti siano potenzialmente tossiche per la cellula batterica ospite
In generale è preferibile che un ceppo lisogeno per λDE3, trasformato con
un plasmide pET contenente il gene di interesse, non raggiunga la fase
stazionaria
In caso contrario è preferibile aggiungere glucosio 0.5-1.0% al mezzo di
coltura, in modo da ridurre la trascrizione basale
Una strategia alternativa, adatta all’espressione di geni i cui prodotti sono
molto tossici per la cellula ospite, consiste nell’introduzione della RNA
polimerasi T7 mediante infezione con il batteriofago CE6
CE6 è un fago λ ricombinante contenente il gene della RNA polimerasi
sotto il controllo del promotore pL e del repressore termosensibile cI857
Quando il fago CE6 infetta un determinato ospite, l’RNA polimerasi
di nuova sintesi trascrive il DNA bersaglio in maniera così attiva che il
normale sviluppo del fago non può procedere
Sebbene tale metodo sia meno conveniente dell’induzione del lisogeno
DE3, è preferibile in quei casi in cui il prodotto proteico ricombinante è
troppo tossico per essere mantenuto in altro modo
Nessuna molecola di RNA polimerasi T7 è presente nella cellula prima
dell’infezione, ciò che consente di esprimere in questo modo un
qualunque DNA bersaglio clonato sotto il controllo di un promotore T7
Produzione di Proteine Ricombinanti
pET-22b(+)
Il gene della proteina repressore ed il promotore corrispondente possono
essere collocati in due plasmidi distinti, i quali mantengano nella cellula
un numero di copie diverso
Una simile disposizione mantiene la proporzione appropriata tra proteina
repressore e promotore
Di solito il gene repressore è collocato su un plasmide a basso numero di
copie (da 1 a 8 copie per cellula), mentre la sequenza del promotore si
inserisce in un plasmide ad elevato numero di copie (da 30 a 100 copie
per cellula)
Alternativamente il gene della proteina repressore può essere trasportato
come singolo gene nel DNA cromosomiale, disposizione che mantiene
bassi i livelli della proteina repressore
Nei sistemi che fanno uso del promotore lac, una forma variante del gene
lacI (lacIq) produce livelli molto maggiori del repressore lac, facendo
perciò diminuire la trascrizione del gene clonato in assenza di induttore
Plasmidi/cellula
Plasmide
28ºC
42ºC
Promotore pL
pKN402
82
521
NO
pPLc2833
38
42
SI
pCP3
60
713
SI
Repressore cI termosensibile
integrato nella cellula ospite
Inserendo il gene della DNA ligasi T4 nel plasmide pCP3, circa il 20% delle
proteine cellulari prodotte a 42ºC risulta costituito da DNA ligasi T4
In generale il livello dell’espressione genica è proporzionale al numero di
copie del gene trascritto nella cellula ospite → aumentando il numero di
copie del plasmide si verificherà l’aumento concomitante della proteina
sintetizzata dal gene clonato
Oltre al gene clonato, però, il plasmide contiene altri geni trascritti
L’incremento del numero di copie determina una deviazione delle risorse
della cellula verso la produzione delle proteine codificate dal plasmide,
comprimendo le attività metaboliche della stessa cellula ospite
La strategia alternativa consiste nel clonare più copie del gene in esame
in un plasmide a basso numero di copie, anziché clonarne una sola copia
in un plasmide ad elevato numero di copie
Il problema tecnico è quello di creare serie in tandem di un gene con le
sequenze sempre orientate nel modo giusto per essere trascritte e
tradotte
Per risolvere il problema si può ricorrere all’enzima di restrizione AvaI ed
al suo sito di riconoscimento sul DNA
In seguito al taglio, il trattamento con la DNA polimerasi I consente di
riempire le estremità coesive
Un sito di riconoscimento per EcoRI è poi saldato alle estremità nette
Il gene, munito di segnali di inizio e di arresto, è clonato in un sito EcoRI
Il gene è poi separato dal plasmide digerendo con AvaI
In questo modo l’inserto di DNA non avrà estremità coesive identiche
Durante la reazione catalizzata dalla DNA ligasi i segmenti potranno
congiungersi secondo un unico orientamento
AvaI
In alternativa è possibile utilizzare adattatori direzionali sintetici = brevi
sequenze di oligodeossiribonucleotidi aggiunte alle estremità del DNA
di un plasmide linearizzato ed al frammento di DNA contenente il gene
Durante la reazione di ligasi i segmenti di DNA saranno orientati in un
solo verso
Tale strategia non risulta limitata dal requisito che dal gene bersaglio
siano assenti i siti AvaI ed EcoRI
Nella pratica l’espressione dei geni dell’interferone si accentua
realmente in proporzione al numero di copie di geni in tandem, almeno
fino a quattro copie del gene per ogni plasmide
Le copie dei geni in tandem risultano talvolta instabili a livello del DNA
e, nel corso della crescita, alcune di esse, o anche tutte, possono
essere eliminate dal plasmide
Nell’mRNA dei procarioti è presente un sito di inizio della traduzione
definito sito di attacco del ribosoma (sequenza di Shine-Dalgarno)
Si tratta di una sequenza di 6-8 nucleotidi (ad esempio UAAGGAGG),
posta nell’mRNA, in grado di appaiarsi con una sequenza
complementare situata nella componente RNA della subunità
ribosomiale minore
Quanto più forte è il legame dell’mRNA con l’RNA ribosomiale tanto
maggiore è l’efficienza dell’inizio della traduzione
Sono stati progettati numerosi vettori di espressione in E.coli atti
ad assicurare che l’mRNA del gene clonato contenga un sito di
attacco forte per il ribosoma
Per ciascun gene clonato è importante stabilire che il sito di legame del
ribosoma sia ubicato adeguatamente e che la struttura secondaria
dell’mRNA non ne impedisca l’accesso al ribosoma
Sono stati elaborati numerosi vettori che incorporano sia i segnali
trascrizionali sia i segnali traduzionali per l’espressione eterologa di geni
eucariotici in E.coli
pKK233-2
• Marcatore selezionabile Ampr
• Il promotore tac
• Il sito di attacco del ribosoma di lacZ
• Un codone di inizio ATG collocato 8
nucleotidi a valle
• I codoni di arresto (terminatori) della
trascrizione T1 e T2 del batteriofago λ
Si inserisce il gene clonato in un sito NcoI,
PstI o HindIII posto tra il sito di legame
del ribosoma ed i codoni di arresto della
trascrizione
Se il gene clonato non si trova nella stessa
cornice di lettura del codone di inizio ATG
si possono effettuare piccoli adattamenti
per correggere la cornice di lettura
Al termine dell’induzione e della trascrizione,
l’mRNA del gene clonato è tradotto in maniera
efficiente
Le sequenze nucleotidiche che codificano gli
aminoacidi nella regione N-terminale della
proteina bersaglio variano da un gene all’altro
e non è dunque possibile progettare un
vettore che sopprima in tutti i casi la
possibilità che l’mRNA si ripieghi su se
stesso
I vettori di espressione descritti sono punti di
partenza per ottimizzare l’inizio della
traduzione
L’enzima glutatione-tio-transferasi (GST) da Schistosoma japonicum è una
proteina altamente solubile
E’ stato dimostrato che la fusione di una proteina ricombinante all’enzima
GST determina un incremento della solubilità del prodotto chimerico
durante la fase di iperespressione
La presenza della GST inoltre facilita la purificazione delle proteine
ricombinanti grazie all’utilizzo di cromatografie che sfruttano l’elevata
affinità della GST per il glutatione ridotto (GSH)
Tra la GST e la proteina ricombinante è generalmente interposto un sito di
riconoscimento per una proteasi specifica, ciò che consente la
separazione della proteina di interesse dalla GST nel corso della
procedura di purificazione
35
Le proteine di fusione sono caratterizzate dalla presenza della GST
all’estremità N-terminale mentre la proteina ricombinante di interesse è
localizzata all’estremità C-terminale
In seguito all’induzione dell’espressione, la proteina chimerica si
accumula nel citoplasma della cellula batterica ospite
La GST è una proteina di 26.000 Da che può essere espressa n E.coli
nella sua forma enzimaticamente attiva
La GST conserva la sua attività enzimatica nei costrutti chimerici e può
andare incontro a dimerizzazioni simili a quelle osservate in natura
36
Mappa dei 10 vettori pGEX contenenti
la sequenza codificante la GST
37
Glutatione S-transferasi come partner di fusione
C
N
GST
Proteina
(220 aa)
Le GSTs costituiscono una classe di enzimi
che utilizzano il glutatione ridotto come
substrato per inattivare piccole molecole
tossiche.
Sito di taglio per proteasi
Glutatione
Data l’elevata affinità della GST per il suo
substrato, le proteine chimeriche contenenti la
GST possono essere isolate mediante
cromatografia di affinità. La fase stazionaria è
costituita da una matrice di agarosio su cui è
immobilizzato il glutatione ridotto. L’eluizione
delle proteine contenenti la GST è eseguita in
presenza di un eccesso di glutatione ridotto
in forma libera.
Proteina GST
resina
Eluizione con un
eccesso di GSH
38
ESTRATTO
PROTEICO
GLUTATIONE
IMMOBILIZZATO
RIMUOVO IL
SOVRANATANTE
CONTENENTE LE
PROTEINE NON
LEGATE
CENTRIFUGAZIONE
+ LAVAGGI CON TAMPONE FOSFATO
39
Produzione di un polipeptide fibrillogenico ricombinante
220
L-V-P-R-G S
GST
Sito
di taglio della
trombina
[1-93]ApoA-I
WESTERN BLOT
SDS-PAGE
100
60
45
36 kDa
30
20
12
GST
G S
10 kDa
8
[1-93]ApoA-I
40
La Maltose-Binding Protein (MBP) è una proteina periplasmatica codificata
dal gene mal E di E.coli
Si tratta di un componente del sistema batterico di trasporto del
maltosio
Come nel caso della GST, è stato dimostrato che la fusione di una
proteina ricombinante alla MBP determina un incremento della
solubilità del prodotto chimerico durante la fase di iperespressione
La MBP presenta il vantaggio di essere codificata dal gene mal E di E.coli
→ i codoni e la struttura secondaria dell’mRNA dovrebbero essere
idonei a garantire un’espressione efficiente nell’ospite batterico
Il confronto tra GST e MBP, per quanto riguarda gli effetti sulla solubilità
del partner di fusione, non è mai stato effettuato a parità di condizioni,
quali ceppo ospite, tipo di vettore, lunghezza del dominio di connessione
tra i due componenti del costrutto chimerico
41
Vettori di espressione contenenti la sequenza codificante MBP
• I vettori contengono il promotore
tac
• La sequenza codificante il sito di
riconoscimento per il fattore Xa
è adiacente al primo sito di
restrizione del polylinker
• Il vettore pMAL-p2 contiene il
peptide segnale della MBP → la
proteina di fusione è esportata
nello spazio periplasmico
VANTAGGI:
Isolamento della proteina di
fusione mediante shock
osmotico
Ridotta
esposizione
a
proteasi
Favorita la formazione dei
ponti
disolfurici
della
proteina di interesse
• Non tutte le proteine di fusione
sono trasportate in maniera
efficiente nel periplasma
42
Proteina di fusione
Promotore
tac
gene
malE
pMAL
MBP
Proteina di
interesse
cDNA
di interesse
In questo caso la cromatografia sfrutta
l’elevata affinità della MBP per il
maltosio.
Tra la MBP e la proteina ricombinante
è generalmente interposto un sito di
riconoscimento per una proteasi
specifica.
Resina
Maltosio
legato
Eluizione
Isolamento della proteina di fusione
43
C
N
Proteina di fusione
Tag
Proteina
Sito di taglio per proteasi
44
Un tratto di istidine ripetute è in grado di legare con elevata affinità un
certo numero di metalli di transizione
E’ stato dimostrato che una proteina che presenta un tratto esposto di
6 residui di istidina (His)6 è in grado di legare con elevata affinità una
resina caricata con ioni divalenti di metalli di transizione (nickel o
cobalto)
Il tratto (His)6 deve essere localizzato in una regione esposta e
relativamente flessibile della proteina, generalmente all’estremità N- o
C- terminale
Può risultare utile la presenza di uno o due residui di Gly tra la
sequenza (His)6 ed il resto della proteina → siti unici di riconoscimento
per proteasi possono essere inseriti e consentire la rimozione del tratto
(His)6 al termine della procedura di purificazione
45
Il clonaggio può essere effettuato in maniera tale che il tratto (His)6 risulti
localizzato all’estremità N- o C-terminale della proteina ricombinante di
interesse.
46
Le proteine dotate del tag (His)6 possono essere convenientemente
purificate mediane cromatografia di affinità su metalli chelati o
immobilizzati (IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromatography)
Si adopera una resina a cui sono legati ioni divalenti di metalli di
transizione grazie alla presenza di gruppi funzionali chelanti
Il ligando chelante può essere acido iminodiacetico (IDA) oppure
acido nitrilotriacetico (NTA)
Lo ione metallico è legato alla resina lasciando liberi alcuni (in
genere due) siti di coordinazione del metallo, in modo che esso
possa stabilire legami con la proteina dotata di (His)6
L’anello imidazolico della catena laterale dell’istidina è in grado di
stabilire legami di coordinazione con ioni divalenti di metalli
pesanti, quali Ni2+, Zn2+, Cu2+ e Co2+
La cromatografia può anche essere effettuata in condizioni
denaturanti, in presenza di detergenti o di agenti denaturanti, senza
che venga alterata la capacità di legame
47
Fase stazionaria
E’ mostrato un nuovo chelante
tetradentato che crea con gli ioni
dei metalli di transizione un legame
molto forte. Ciò evita il distacco del
metallo dal gel di affinità ed aumenta
la capacità di legame di questo per
le proteine marcate con il tag (His)6.
Proteina con tratto (His)6
legata alla resina
48
49
La tioredossina di E.coli (trxA) è una proteina implicata in numerose
funzioni cellulari, quali la riduzione dei ponti disolfurici ed il
metabolismo del solfato
TrxA è anche un cofattore della DNA polimerasi del fago T7 ed è
coinvolta nell’assemblaggio del fago T7 e di altri fagi filamentosi
La proteina è stata espressa in maniera stabile e ad elevati livelli in
diverse condizioni sperimentali
Si tratta di una proteina citoplasmatica estremamente solubile
E’ stata adoperata come partner di fusione di diverse citochine e
fattori di crescita di mammifero → trxA era localizzata all’estremità Nterminale dei costrutti chimerici
Le proteine fuse alla trxA risultavano estremamente solubili nel
citoplasma di E.coli in diverse condizioni sperimentali
Oltre ad essere solubile, trxA ha dimensioni ridotte (109 aa; 11.675
Da), una stabilità termica intrinseca ed è localizzata sul lato
citoplasmatico delle zone di adesione tra la membrana cellulare
interna ed esterna
50
51
La sequenza codificante trxA è localizzata a
monte delle sequenze codoficanti His·tag ed
S·tag.
Siti di riconoscimento unici per proteasi
consentono la rimozione di trxA e di His·tag
(trombina) o dei tre tags (enterochinasi).
Flexible linker peptide
52
Molte proteine necessitano di formare ponti disolfurici stabili
per assumere la propria conformazione nativa → in assenza
di ponti disolfurici, tali proteine possono essere degradate o
possono accumularsi nei corpi di inclusione
Il ceppo di E.coli AD494 presenta una mutazione del gene
codificante la tioredossina reduttasi (trxB), l’enzima che
normalmente catalizza la riduzione della tioredossina (trxA)
Ciò consente la formazione di ponti disolfurici nel citoplasma
di E.coli
Tale ceppo si è rivelato particolarmente utile per l’espressione
di proteine ricombinanti solubili, contenenti ponti disolfurici
In alcuni casi si sono ottenuti ottimi risultati adoperando ceppi
di E.coli che presentavano anche una mutazione del gene gor
codificante l’enzima glutatione reduttasi
53
I ponti disolfurici che si formano nel citoplasma sono rapidamente ridotti grazie
all’azione di enzimi riducenti, quali gli enzimi tioredossina reduttasi e
glutatione reduttasi.
L’inattivazione di componenti di tale pathway dovrebbe consentire la formazione
di ponti disolfurici, rendendo il citoplasma un ambiente più ossidante.
Concettualmente l’inattivazione di entrambi i pathways (trxB e gor) dovrebbe
rendere il citoplasma di E.coli ancora più ossidante.
Un ceppo doppio mutante è stato isolato ed è risultato in grado di crescere in
condizioni di aerobiosi (ceppo FA113 o OrigamiTM).
Sono disponibili anche i ceppi Origami(DE3) e Origami(DE3)pLysS.
54
Gli enzimi della famiglia Dsb catalizzano la formazione di ponti
disolfurici nello spazio periplasmico dei batteri gram-negativi e
sono dunque necessari per il corretto ripiegamento di
numerose proteine secrete.
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La proteasi subtilisina catalizza la scissione di un singolo
legame peptidico della RNasiA, determinando la formazione
della RNasi S, composta da due frammenti strettamente
associati → il peptide S (residui 1-20 della RNasi A) e la
proteina S (residui 21-124)
Sebbene i singoli frammenti non siano dotati di attività
enzimatica, la RNasi S ha un’attività enzimatica simile a
quella della RNasi A intatta
L’elevata affinità del peptide S per la proteina S può facilitare
l’isolamenti di proteine ricombinanti fuse al peptide S
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Sito di riconoscimento per fattore Xa
Gene codificante la
β-galattosidasi
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I domini di legame alla cellulosa (CBDs: Cellulose Binding Domains)
costituiscono regioni discrete delle cellulasi
CBDs rappresentano una nuova classe di tags che possono essere
fusi all’estremità N- o C-terminale della proteina ricombinante di
interesse
E’ possibile isolare le proteine di fusione eseguendo una
cromatografia che sfrutta l’elevata affinità dei CBDs per la cellulosa
Si tratta di una procedura di purificazione economica che ha il
vantaggio di consentire l’eluizione della proteina ricombinante di
interesse in condizioni non denaturanti
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NusA è una proteina di E.coli molto solubile, espressa ad elevati livelli
NusA è stata fusa all’estremità N-terminale di numerose proteine
normalmente presenti nei corpi di inclusione
La fusione di tali proteine a NusA ha determinato un incremento della
solubilità del prodotto chimerico
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HindIII
AAG CTT ATG GTC GGC
Inserto da clonare
GTT GCG CAA GCT TCG
Vettore recipiente
GTT GCG CAA GCT TAT GGT CGG C
Non è in frame!
CGA TGG CAA GCT TAT ATG GTC GGC
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