PREMIO TESI “S.I.P.I. 2010” Dimostrazione immunoistochimica dei

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PREMIO TESI “S.I.P.I. 2010”
Dimostrazione immunoistochimica dei recettori CD35
e CD16 in branzino (Dicentrarchus labrax)#
Immunohistochemical demonstration of CD35 and CD16
receptors in sea bass (Dicentrarchus labrax)
Daniele Passone 1*, Chiara Bulfon 2, Donatella Volpatti 2
1
Corso di laurea in Biotecnologie Medico-Veterinarie, Università di Udine;
2
Dipartimento di Scienze Animali, Università di Udine.
______________________________
SUMMARY - A crucial role in the phagocytosis activation can be attributed to the membrane receptors for
complement and immunoglobulin Fc. In mammals four types of receptors for C3 have been identified, namely
CR1, CR2, CR3 e CR4. CR1 (CD35) is expressed by neutrophils, eosinophils and some B and T sub-populations.
It promotes the link and the phagocytosis of particles opsonised by C3b and C4b fractions. FcRγ (CD16) is
expressed by several hemopoietic cells (macrophages and lymphocytes) and its role is fundamental for the
cellular immune response mediated by immunoglobulins. Investigations dealing with the identification of these
receptors in teleosts are recent and concern a limited number of species: rainbow trout, catfish, carp, zebrafish.
These researches are mainly finalised to evaluate aspects of CR1 and FcR phylogenesis, as well as
structural/functional homologies with mammalians. From the literature there is no evidence of investigations
dedicated to the identification of CR1 and FcR in marine species, and also there are no data regarding the
immunohistochemical localization of cells presenting these CDs. The present thesis was aimed to the
demonstrations of CD16-like and CD35-like immune-receptors in tissues of sea bass (Dicentrarchus labrax) at
different developing stages.
Histological sections obtained from tissue specimens collected from sea bass fingerlings/juveniles were submitted
to immunohistochemical analysis by using the following antibodies: goat polyclonal to CD35 (CR1); rabbit
polyclonal to CD16 (FcR). The reaction was developed by ABComplex peroxidase and DAB. As a result of the
antibodies employed, even if specific for mammalian receptors, allowed the detection of cell populations in
different tissues, and also the chronology of appearance was described. In synthesis, CD16 was detectable in
thymus, gills and skin starting from 50 dph (days post hatching), and in the digestive system starting from 90 dph.
CD35 was detectable in several organs (thymus, gills, pancreas, skin, stomach, gut) starting from 47 dph, and
later in spleen, pyloric caeca and liver. Moreover the morphology of CD16+ and CD35+ cells colonizing
various tissues was described, allowing the discrimination of at least three different cell populations: CD16+
cells, morphologically similar to macrophages or dendritic (APCs) cells, with non granular cytoplasm;
CD35+ cells, morphologically similar to macrophages or dendritic cells (APCs), with non granular
cytoplasm; CD35+ cells, morphologically similar to eosinophilic granulocytes or EGCs, with granular
cytoplasm. These populations were particularly consistent in thymus (among the primary lymphoid organs), skin
and digestive tract (mucosae associate lymphoid tissue). Based on their morphology and specific localization,
it was possible to provide some hypothesis concerning their role as phagocytes and antigen presenting cells.
# - Sintesi della tesi: “Parametri di valutazione della risposta immunitaria in branzino (D. labrax) sottoposto a vaccinazione”.
Key words: Sea bass; Dicentrarchus labrax; CD35 (CR1); CD16 (FcRγIII); Immunohistochemistry;
Phagocytosis.
______________________________
* Corresponding Author: c/o D.I.A.L., Università degli Studi di Udine, Via Sondrio - 33100 Udine.
E-mail: [email protected]
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INTRODUZIONE
Lo studio del sistema immunitario dei pesci risulta interessante per ottenere una più precisa
conoscenza del suo coinvolgimento nella prevenzione delle malattie infettive, ma anche dal
punto di vista filogenetico, in quanto i pesci sono gli animali che per primi, nella scala
evolutiva, mostrano aspetti di risposta immunitaria innata ed adattativa assimilabile a quella
dei vertebrati superiori.
Nei mammiferi, l’attività di fagocitosi è principalmente prerogativa dei fagociti
mononucleati e dei neutrofili. Al momento, le popolazioni cellulari coinvolte in tale funzione
non sono state completamente definite nelle specie ittiche, data l’evidente eterogeneità
morfologica dei leucociti (granulociti in particolare) e la mancanza di specifici marcatori di
superficie (Sepulcre et al., 2002).
Un ruolo cruciale nel promuovere la fagocitosi può essere attribuito ai recettori di
membrana cellulare specifici per il complemento (CR) e per la porzione Fc delle
immunoglobuline (FcR), i quali possono essere esposti simultaneamente sulla membrana
delle cellule fagocitarie, dove agiscono in modo sinergico (Tizard, 1996a).
Nei mammiferi sono stati identificati quattro tipi di recettori per il C3, rispettivamente
CR1, CR2, CR3 e CR4. CR1 (CD35), con peso molecolare pari a 160-250 kDa, risulta
espresso da eritrociti, granulociti neutrofili ed eosinofili, da alcune sottopopolazioni di
linfociti B e T, cellule dendritiche, cellule di Kupffer (Khera & Das, 2009). Esso promuove il
legame e la fagocitosi di particelle rivestite dalle frazioni complementari C3b e C4b (Nakao
et al., 2003; van Lookeren Campagne et al., 2007). La sua principale funzione consiste nel
legare gli immunocomplessi alla superficie degli eritrociti, consentendone la veicolazione e
l’eliminazione a livello del fegato (van Lookeren Campagne et al., 2007).
I recettori per la frazione Fc sono specifici per differenti catene pesanti degli anticorpi (ad
esempio FcRγ per le IgG). Tre diversi FcRγ sono stati descritti nei mammiferi: FcRγI
(CD64); FcRγII (CD32); FcRγIII (CD16) (Tamm & Schmidt, 1996; Tizard, 1996b).
Quest’ultimo risulta espresso da numerose cellule di origine emopoietica (macrofagi,
granulociti, cellule natural killer, linfociti T) e il suo ruolo appare determinante nella risposta
immunitaria mediata da anticorpi (rimozione di immunocomplessi o di particelle opsonizzate
mediante fagocitosi) (Morrison & Nowak, 2002). Si tratta di un recettore a bassa affinità per
gli anticorpi, con peso molecolare pari a 50-65 kDa (Tizard, 1996b).
Gli studi riguardanti l’identificazione di tali recettori nei teleostei sono relativamente
recenti e riguardano solo alcune specie ittiche di acqua dolce (trota iridea, pesce gatto, carpa,
zebrafish). Essi sono prevalentemente finalizzati a valutare aspetti di conservazione
filogenetica di tali molecole, cosi come il grado di omologia strutturale/funzionale con i
corrispondenti recettori dei mammiferi.
L’espressione di CRs è stata valutata in trota iridea e carpa. Nella trota iridea la presenza di
un recettore per il complemento è stata ipotizzata, su base funzionale, sulla superficie degli
eritrociti. Si suppone che, similmente al CR1 presente sugli eritrociti umani, possa assolvere
all’eliminazione degli immunocomplessi opsonizzati dal complemento (Schraml et al.,
2006). Un recettore per il C3a è stato caratterizzato, sempre in trota iridea, valutando l’alto
grado di omologia con il medesimo recettore dei mammiferi (Boshra et al., 2005). Nella
carpa è stata evidenziata l’espressione di recettori CR3-like da parte di monociti/macrofagi e
granulociti localizzati nel rene anteriore (Nakao et al., 2003).
La presenza di recettori FcR-like è stata descritta in pesce gatto (Schen et al., 2003;
Stafford et al., 2006a; 2006b), zebrafish (Yoder et al., 2007) e carpa (Fujiki et al., 2000;
Morrison & Nowak, 2002; Rombout et al., 2008). FcR identificato nel pesce gatto risulta
filogeneticamente e strutturalmente correlato al recettore dei mammiferi e presente in vivo
sia come proteina solubile che come frazione intracellulare dei neutrofili e linfociti (Stafford
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et al., 2006b). Un altro studio condotto in pesce gatto fornisce l’evidenza che alcune cellule
NK legano in superficie le IgM, tramite un recettore FcR-like di 64 kDa, acquisendo
attitudini di cellule ADCC (Schen et al., 2003). FcR clonato nella carpa ha dimostrato
similitudine approssimativamente del 40% nella composizione aminoacidica rispetto al
corrispondente recettore umano e risulta espresso da leucociti del rene anteriore e peritoneali
(Fujiki et al., 2000).
Dalla letteratura consultata al momento della stesura della tesi non emergono dati
riguardanti l’identificazione di CR e FcR in specie ittiche d’acqua salata, così come non sono
state contemplate tecniche di marcatura delle cellule che esprimono questi CD utilizzando
anticorpi, al fine di abbinare la descrizione morfologica delle stesse ad una loro possibile
attività fagocitaria.
La presente indagine ha lo scopo di descrivere, avvalendosi di una tecnica
immunoistochimica, la presenza di immuno-recettori CD16 e CD35 in popolazioni cellulari
di natura emopoietica localizzate in vari tessuti di branzino (Dicentrarchus labrax), ponendo
particolare attenzione alla cronologia di comparsa di cellule immunopositive negli stadi
larvali e giovanili di questa specie.
MATERIALI E METODI
Pesci e campionamento
I soggetti utilizzati nella presente indagine sono stati prelevati nel corso di una prova
sperimentale di vaccinazione contro la vibriosi (progetto PRIN 2006). La sperimentazione è
stata condotta presso l’allevamento ittico Valle del Lovo (Carlino, Udine), nel quale i
soggetti sono stati stabulati in vasche di vetroresina con acqua marina ed alimentati con
mangime secco commerciale. Larve, avannotti e giovanili appartenenti ad un gruppo di
controllo non vaccinato, sono stati prelevati ad intervalli di tempo compresi tra 8 a 290
giorni post-schiusa (dph). I soggetti in toto e gli organi, prelevati previa soppressione
mediante un’overdose di anestetico (MS-222), sono stati fissati in formalina neutra
tamponata al 10% oppure in soluzione Bouin (overnight a +4°C) e quindi post-fissati con
alcool etilico al 70%.
Istologia e immunoistochimica (IHC)
I campioni sono stati processati secondo protocollo istologico standard. Le sezioni ottenute
al microtomo, di spessore pari a 5 µm, sono state raccolte su vetrini poli-lisinati e colorate
con Ematossilina-Eosina, o sottoposte ad una metodica immunoistochimica finalizzata alla
localizzazione tissutale delle molecole CD35 e CD16. Alcune prove preliminari sono state
dedicate alla valutazione del più adeguato metodo di fissazione (formalina tamponata o
soluzione di Bouin), delle diluizioni e dei tempi di incubazione ottimali per l’utilizzo dei due
anticorpi su tessuto di pesce. I due anticorpi hanno dimostrato di reagire solo sui campioni
fissati in Bouin, pertanto solo questi sono stati destinati alla valutazione mediante IHC.
In breve, la metodica messa a punto ed applicata ha previsto: inibizione delle perossidasi
endogene con H2O2 (30 minuti); pre-incubazione delle sezioni con siero normale di capra o
coniglio (a seconda della specie in cui l’anticorpo secondario era stato sviluppato) diluito
1:20 (30 minuti); incubazione per 2 ore con anticorpo primario policlonale anti CD35 (CR1)
da capra – recettore per C3b e C4b (Santa Cruz Biotechnology), oppure policlonale anti
CD16 (FcRγIII) da coniglio – recettore per porzione Fc delle immunoglobuline G (Santa
Cruz Biotechnology). Entrambi gli anticorpi sono stati utilizzati alla diluizione 1:30, dedotta
da prove preliminari. La rivelazione è stata condotta mediante incubazione con anticorpo
policlonale anti immunoglobuline di capra o coniglio, coniugato con biotina (Dako) per 30
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minuti, complesso avidina-biotina-perossidasi (ABC Vector Vectastain) (30 minuti) e
substrato diaminobenzidina (DAB) (7 minuti). La controcolorazione è stata realizzata
mediante Ematossilina di Mayer e in alternativa Ematossilina-Eosina. Come controllo
negativo sono state utilizzate sezioni istologiche in cui l’anticorpo primario è stato omesso
oppure sostituito con un anticorpo diretto contro epitopi che non erano presenti nella sezione,
sviluppato in capra o coniglio. I preparati sono stati analizzati mediante microscopia ottica.
Complessivamente sono stati analizzati preparati istologici ottenuti da almeno 5 soggetti per
ciascun campionamento (8, 17, 21, 25, 29, 40, 47, 50, 60, 70, 90, 95, 165, 230, 290 giorni
post schiusa).
RISULTATI
La valutazione dei preparati sottoposti ad analisi immunoistochimica ha consentito di
evidenziare, nella maggior parte degli organi esaminati, la presenza di popolazioni cellulari
positive per i marcatori CD16 e CD35. Le tabelle 1 e 2 riassumono la cronologia di
comparsa di tali cellule, nell’intervallo di tempo compreso fra 8 e 290 giorni post-schiusa.
CD16
Cellule positive per CD16 (FcRγIII) sono evidenziabili a partire dall’età di 50 giorni, a
livello del timo e delle branchie. La comparsa è più tardiva (dai 90 ai 165 giorni) nel tratto
gastro-enterico, nella milza e nel rene. I rimanenti organi esaminati non presentavano cellule
positive per il recettore CD16 (rene, fegato, pancreas, cute) (Tabella 1).
CD16
Organo
Giorni post-schiusa
8
17
21
25
29
40
47
50
60
70
90
95
165 230 290
timo
milza
rene
branchie
fegato
pancreas
cute
stomaco
ciechi
intestino
Tabella 1 - Tempo (giorni post-schiusa) di comparsa di cellule CD16+ negli organi di branzino.
Table 1 - Timing (days post-hatching, dph) of CD16+ cells appearance in sea bass organs.
Per quanto concerne la distribuzione e la morfologia delle cellule CD16+ che colonizzano i
vari organi le informazioni sono di seguito sintetizzate. A livello del timo esse risultano poco
numerose, localizzate prevalentemente nella zona midollare, dotate di positività
citoplasmatica non molto intensa e con aspetto interdigitante (Figura 1) che le rende
assimilabili a cellule presentanti l’antigene. Nella milza e nelle branchie le cellule CD16+
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sono rare, dotate di positività citoplasmatica intensa, citoplasma non granulare. Nella milza
sono sparse nel parenchima, mentre nelle branchie occupano l’epitelio delle lamelle
secondarie. Rare cellule CD16+ dotate di positività citoplasmatica molto intensa, con
citoplasma non granulare, colonizzano il tratto gastro-enterico. La loro localizzazione è
prevalentemente sub-epiteliale e intra-epiteliale (Figura 2), la morfologia le rende
assimilabili a macrofagi.
CD35
Cellule positive per CD35 (CR1) sono evidenziabili a partire da 21/25 giorni post-schiusa,
in fegato, pancreas, cute e stomaco. La loro presenza risulta evidente in tutto il tratto gastroenterico entro 60 giorni post-schiusa. Nel timo e nelle branchie esse compaiono a partire da
47 giorni post-schiusa, mentre nella milza esse appaiono a 90 giorni post-schiusa (Tabella 2).
CD35
Organo
Giorni post-schiusa
8
17
21
25
29
40
47
50
60
70
90
95
165 230 290
timo
milza
rene
branchie
fegato
pancreas
cute
stomaco
ciechi
intestino
Tabella 2 - Tempo (giorni post-schiusa) di comparsa di cellule CD35+ negli organi di branzino.
Table 2 - Timing (days post-hatching, dph) of CD35+ cells appearance in sea bass organs.
Per quanto concerne la distribuzione e la morfologia delle cellule CD35+ che colonizzano i
vari organi, le informazioni sono di seguito sintetizzate. Nel fegato sono dotate di
localizzazione e morfologia che le rendono assimilabili a cellule di Kuppfer (Figura 3). Nel
timo il numero di cellule positive è decisamente consistente ed esse possono essere attribuite
a due distinte popolazioni, per localizzazione e morfologia. La prima popolazione colonizza
la capsula e le trabecole capsulari, talvolta migrando verso la zona corticale o l’epitelio
faringeo (Figura 4). Si tratta di cellule con citoplasma abbondante, granulare, intensamente
positivo, nucleo in genere eccentrico. Alcune sono in fase di degranulazione. La seconda
popolazione risulta localizzata nella midollare del timo. Si tratta di cellule di aspetto
interdigitante, con citoplasma intensamente positivo, non granulare, simili a cellule
presentanti l’antigene (Figura 5). Le cellule che risultano positive nell’ambito dell’apparato
gastro-enterico sono localizzate prevalentemente nella lamina propria e solo alcune
occupano una posizione sub- o intra-epiteliale. Esse presentano citoplasma granulare,
intensamente positivo e nucleo leggermente eccentrico. Le stesse caratteristiche sono
osservabili nelle cellule CD35+ localizzate alla base delle lamelle branchiali primarie e nel
tessuto connettivo lasso presente in vari distretti organici. L’applicazione della colorazione
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di contrasto con Ematossilina-Eosina, dopo lo sviluppo della reazione IHC con DAB,
consente di evidenziare che solo una parte delle cellule contenenti granuli citoplasmatici
intensamente acidofili, localizzate nella capsula del timo (Figura 6), nelle branchie, nel tratto
gastro-enterico, nel connettivo lasso e nella cute risulta CD35+. La procedura IHC ha inoltre
consentito di evidenziare positività al marcatore CD35 anche da parte degli eritrociti, sempre
a livello citoplasmatico (immagine non mostrata).
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
La produzione di anticorpi mono e policlonali, da utilizzare a fini diagnostici, risulta
particolarmente costosa e per tale motivo essi risultano commercialmente disponibili solo per
un numero limitato di specie, prevalentemente mammiferi. Pertanto l’identificazione di
anticorpi cross-reattivi rappresenta un valido contributo per l’attività dei ricercatori che
desiderano studiare l’immunità in specie animali di minore interesse. Alcuni studi si sono già
prefissi come obiettivo principale la valutazione della cross-reattività di pannelli anticorpali
destinati allo studio del sistema immunitario dell’uomo, evidenziando la limitata, ma non per
questo meno promettente, possibilità di utilizzare alcuni markers (CD in particolare) in
specie animali filogeneticamente molto distanti dai primati (Cook et al., 2001; Conrad et al.,
2007; Fisher & Koellner, 2007).
La presente tesi ha avuto come obiettivo quello di valutare la possibilità di impiego di due
marcatori cellulari destinati all’identificazione di immuno-recettori nei mammiferi, su
tessuto di pesce. Nei mammiferi, i fagociti (ed in particolare i granulociti neutrofili)
esprimono sulla loro superficie sia recettori per il complemento che per il frammento Fc
delle Ig ed è stata dimostrata una sinergia tra CR1 e FcRγIII nel promuovere la fagocitosi
(Boshra et al., 2006).
L’impiego di marcatori per CR1 e FcRγIII umani su tessuti fissati in soluzione Bouin ha
consentito la localizzazione di antigeni CD16-like e CD35-like in varie cellule del sistema
immunitario del branzino, suggerendo una potenziale omologia tra le molecole recettoriali
del pesce e quelle del mammifero. La presenza di tali recettori, la morfologia, le affinità
tintoriali e la localizzazione delle cellule immunopositive, suggeriscono un loro possibile
coinvolgimento nell’attività di fagocitosi e di presentazione dell’antigene.
I recettori CD16 e CD35 sono risultati presenti prevalentemente in cellule che colonizzano
Figura 1 - Timo, 230 giorni, IHC per CD16. Cellule debolmente positive localizzate nella zona midollare
(freccia) (400 X). Figura 2 - Ciechi pilorici, 165 giorni, IHC per CD16. Numerose cellule CD16+ localizzate
prevalentemente nella zona sub-epiteliale (400 X). Figura 3 - Fegato, 21 giorni, IHC per CD35. Cellule positive
diffuse nel parenchima epatico (1000 X). Figura 4 - Timo, 165 giorni, IHC per CD35. Cellule positive, localizzate
nelle trabecole connettivali (freccia) e in fase di migrazione (asterischi) (200 X). Figura 5 - Timo, 165 giorni, IHC
per CD35. Cellule positive localizzate nella zona midollare (freccia) (1000 X). Figura 6 - Timo, 165 giorni, IHC
per CD35 e contro-colorazione con Ematossilina-Eosina. In corrispondenza di una trabecola connettivale si
notano due popolazioni di cellule contenenti granuli acidofili (asterisco e frecce), di cui una intensamente positiva
alla marcatura con CD35 (asterisco) (1000 X).
Figure 1 - Thymus, 230 dph. IHC for CD16. Slight positivity of cells in the medulla (arrow) (400x). Figure 2 pyloric caeca, 165 dph. IHC for CD16. Numerous CD16+ cells colonising the sub-epithelial layer (400x).
Figure 3 - Liver, 21 dph. IHC for CD35. Positive cells in the liver parenchyma (1000x). Figure 4 - Thymus, 165
dph. IHC for CD35. Positive cells in the connective trabeculae (arrow) and in migration phase (asterisks) (200x).
Figure 5 - Thymus, 165 dph. IHC for CD35. Positive cells in the medulla (arrow) (1000x). Figure 6 - Thymus,
165 dph. IHC for CD35 and counterstain with Haematoxylin-Eosin. In the connective trabeculae two distinct
populations of cells containing acidophilic granules are detectable (asterisk and arrows), one of these is
positively labelled with CD35 antibody (asterisk) (1000x).
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i distretti con funzione linfoemopoietica (timo) e le mucose (tratto gastro-enterico e
branchie). Tuttavia la positività immunoistochimica non consente una precisa
discriminazione tra popolazioni cellulari ed è peraltro noto che anche nei mammiferi
differenti popolazioni cellulari possono esprimere lo stesso marcatore.
Il contributo fornito da questa indagine è stata la descrizione cronologica della comparsa di
cellule CD16+ e CD35+. Le prime sono state evidenziate a partire da 50 giorni di età nel
timo e nelle branchie e a partire dal 90° giorno di vita nel tratto gastro-enterico. Le seconde
erano evidenti in pancreas, cute e apparato digerente tra i 21 e i 25 giorni di vita e
successivamente (47 giorni) in timo e branchie. L’espressione più tardiva di recettori per le
immunoglobuline (FcR) rispetto ai recettori per il complemento (CR1) sembra seguire la
logica della cronologia di comparsa dei sistemi di difesa mediati dal complemento e dagli
anticorpi nei teleostei. E’ noto infatti che cellule Ig positive compaiono nel branzino ai
seguenti tempi post-schiusa: rene e milza, 45 giorni; timo e intestino, 90 giorni (Rombout
et al., 2005). Il sistema del complemento non è stato ancora studiato a fondo in questa
specie, ma sono disponibili contributi bibliografici che illustrano la sua comparsa in varie
specie di teleostei, in tempi decisamente più precoci rispetto a quella degli anticorpi, ad
esempio a partire da 5 giorni post-schiusa (C3) in halibut (Magnadottir et al., 2005).
A fronte delle osservazioni condotte, un risultato non atteso e per ora difficile da spiegare
riguarda il limitato numero di cellule immunopositive (per entrambi i marcatori) nel rene,
organo nel quale risultano numerose le popolazioni cellulari che si ritiene debbano esprimere
tali recettori. Una possibile ipotesi, non supportata da evidenze bibliografiche, è che in
questo distretto siano presenti in prevalenza popolazioni linfatiche non ancora
funzionalmente mature o totalmente differenziate.
Inoltre risulta peculiare il riscontro di cellule CD35+ nel parenchima epatico,
morfologicamente assimilabili a cellule di Kupffer, nelle larve di età variabile da 21 a 40
giorni, non più presenti negli stadi successivi. Dalla letteratura è noto che CR1 risulta
espresso dalle cellule di Kupffer umane, ma non ci sono informazioni in merito ad altre
specie (Hinglais et al., 1989; van Lookeren Campagne et al., 2007).
L’osservazione della morfologia delle cellule positive per i due recettori ha consentito
l’individuazione, in vari organi, di almeno tre popolazioni: a) cellule CD16+, simili a
macrofagi o a cellule dendritiche (cellule presentanti l’antigene) dotate di citoplasma non
granulare; b) cellule CD35+ simili a macrofagi o a cellule dendritiche (cellule presentanti
l’antigene) dotate di citoplasma non granulare; c) cellule CD35+, con citoplasma contenente
granuli acidofili, simili a granulociti eosinofili o a cellule granulari eosinofiliche. In tutti i
casi la positività era localizzata a livello citoplasmatico. E’ noto che i recettori oggetto di
studio sono espressi, con finalità funzionali, sulla membrana delle cellule, ma nel caso del
CR1 la molecola risulta prima localizzata in vescicole secretorie citoplasmatiche (dimostrate
nei neutrofili umani) che vengono traslocate al plasmalemma in corso di attivazione cellulare
(Sengelov et al., 1994). Tale meccanismo potrebbe verificarsi anche nel caso dei pesci.
L’organo che, fra tutti quelli esaminati, è risultato più interessante nello studio di tali
popolazioni è stato il timo. Infatti in tale organo sono state evidenziate tutte tre le
popolazioni, in merito alle quali possono essere fatte alcune considerazioni. Si ritiene che le
cellule di tipo macrofagico e dendritico, non granulari, localizzate nella midollare, possano
coesprimere entrambi i recettori, funzionali nel promuovere il processo di fagocitosi, previa
opsonizzazione del bersaglio con frazioni del C3 o immunoglobuline. Le cellule CD35+ con
aspetto e localizzazione diversi rispetto alle precedenti, ossia granulari, acidofile, e
localizzate nella parte più esterna dell’organo (capsula e limitrofe zone corticale ed epiteliale
faringea) possono essere facilmente assimilate a cellule granulari eosinofiliche
(EGCs)/mastociti (Reite & Evensen, 2006) oppure a granulociti eosinofili che, reclutati nel
sangue periferico, hanno raggiunto questi distretti. L’applicazione della doppia colorazione
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Ematossilina-Eosina per controcolorare le sezioni sottoposte a protocollo IHC, ha tuttavia
permesso di verificare che le cellule contenenti granuli acidofili (sospette ECGs) possono in
realtà essere distinte in due sottopopolazioni, la prima delle quali positiva al marcatore
CD35, con granuli acidofili piccoli e la seconda negativa per tale marcatore, dotata di granuli
acidofili di maggiori dimensioni. Tale distinzione morfologica e tintoriale è risultata evidente
nel timo, nel tratto digerente e nelle branchie.
Risulta prematuro attribuire ipotesi di specifiche funzionalità immunitarie alle popolazioni
cellulari oggetto di indagine, ma questa tesi rappresenta un contributo preliminare alla
conoscenza delle tecniche di marcatura e di identificazione funzionale di cellule coinvolte
nel processo di fagocitosi, in questa specie ittica. Gli aspetti che riteniamo debbano essere
approfonditi riguardano: la comprensione della limitata presenza di cellule esprimenti
recettori per le immunoglobuline e per il complemento in organi linfatici nei quali tale
riscontro risulta atteso, come il rene anteriore o la milza; la conoscenza degli epitopi che
vengono effettivamente riconosciuti dagli anticorpi commerciali utilizzati, per verificare che
l’anticorpo cross-reagente riconosca la medesima molecola recettoriale espressa nel
mammifero.
BIBLIOGRAFIA
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Tesi 1a classificata al Premio “SIPI 2010”
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