Stretta correlazione tra Fisiologia
vegetale e Biotecnologie vegetali
Contributo della fisiologia vegetale
La conoscenza dei processi fisiologici che regolano
la crescita e lo sviluppo della pianta consente un
intervento Biotec mirato per la selezione e
manipolazione di uno specifico carattere di interesse
Contributo delle biotecnologie vegetali
Es: per la verifica in planta del ruolo svolto da
specifiche componenti (mediante la produzione di
piante transgeniche)
Importanza della Fisiologia vegetale e Biotecnologie vegetali
nel
Miglioramento genetico delle piante coltivate
per produrre varietà con migliorate caratteristiche qualiquantitative e più ecocompatibili
(es. più produttive, qualitativamente superiori, più
resistenti (quindi utilizzo di meno sostanze chimiche per il
controllo dei patogeni)
Biotecnologia
L’uso di organismi o parti di essi
per la produzione di prodotti
utili
La Biotecnologia ha origini molto antiche
Processi fermentativi di cibi e bevande
6000 a.C. i Sumeri e Babilonesi producevano birra
4000 a.C.
-gli Egiziani producevano pane lievitato
-il vino era già conosciuto nei paesi del Vicino Oriente
-diverse specie di ‘muffe’ venivano usate per produrre
formaggio
La capacità dei microrganismi di causare
processi di fermentazione fu dimostrata da
Pasteur fra il 1857 e il 1876 e quindi fu
possibile effettuare un controllo più
consapevole ed efficiente delle fermentazioni
Produzione biotecnologica di farmaci
-negli anni ’40, furono introdotte tecnologie per la
coltura massiva di organismi microbici in condizioni
sterili per la produzione di antibiotici (es. penicillina),
vaccini, enzimi ecc.
L’agricoltura biologica usa prodotti Biotec?
Produzione biotecnologica di pesticidi
-es: produzione su larga scala del Bacillus thuringensis
come insetticida contro la piralide del mais
Biotecnologie e Piante coltivate
Non c’è niente di “naturale” in
quello che coltiviamo o alleviamo
indipendentemente dagli OGM
Foresta amazzonica
Azienda agraria
• Trattare con antiparassitari
• Irrigare
• Concimare
Qualche altra evidenza…………………
Pomodoro coltivato
(NON OGM)
Pomodoro
selvatico
(naturale)
(circa 1 cm )
Mais
coltivato
(NON OGM)
Mais
selvatico
(Naturale)
Quindi, possiamo discutere su quale tipo di
agricoltura vogliamo ma essa resta sempre,
in qualsiasi regime la si conduca, una
pratica “artificiale”.
Come si è arrivati a questo?
Attraverso la domesticazione e il
miglioramento genetico
10.000-13.000 a.c.
Domesticazione delle piante e animali
Cacciatore-raccoglitore
Allevatore-agricoltore
L’uomo primitivo – Professione:allevatoreagricoltore- cominciò a selezionare le piante che
più gli piacevano e presentavano delle
caratteristiche utili alla loro raccolta
Esempio di domesticazione da parte dei
nostri antenati primitivi
Spiga di grano
selvatico non matura
Spiga di grano
selvatico matura
In
condizioni
naturali
Oh, guarda una
spiga che non
disarticola!
Che bello ho
trovato un
MUTANTE!!!
Uomo primitivo: Allevatore/agricoltore
Ottimo: potremmo
raccogliere 100
semi tutti insieme!
Esempio di domesticazione operato dai
nostri antenati primitivi:
Spiga di
grano matura
disarticolata
Spiga di
grano matura
che non
disarticola
Un chiaro esempio dell’azione dell’uomo sulle piante
selvatiche
Domesticazione
Frumento
selvatico
Frumento
selvatico
mutante
Dopo una lunga fase in cui l’uomo ha
operato come semplice selezionatore
della variabilità naturale intorno al
XVII-XVIII secolo ha iniziato a
‘combinare’ in modo controllato la
variabilità.
Sono di questo periodo i numerosi
incroci inter- e intra-specifici con lo
scopo principale di studiare le funzioni
del polline e ovulo (es: Josef Gottlieb
Kolreuter nel 1760 produsse un ibrido
tra la Nicotiana paniculata e N. rustica).
Verso la fine del 1800…..
Scoperta da
parte di Mendel
delle leggi
dell’ereditabilità
In seguito a ciò è stato possibile effettuare
degli incroci in modo più consapevole ed
efficiente
Nasce così la disciplina nota come
Miglioramento genetico
che ha come obiettivo quello di
sviluppare varietà sempre più idonee a
soddisfare le esigenze dell’uomo
Un chiaro esempio dell’azione dell’uomo sulle piante
selvatiche
Miglioramento
genetico
Domesticazione
Frumento
selvatico
Frumento
selvatico
mutante
Frumento
coltivato
Esempio di ibrido interspecifico artificiale: Triticale
Segale x Grano = Triticale
Segale
Grano
Esempio di ibrido interspecifico artificiale: Mapo
Origine: incrocio tra il mandarino Avana ed il pompelmo Duncan ottenuto da F.
Russo presso l'Istituto Sperimentale per l'agricoltura di Acireale, Italia
1953 Altra fondamentale
scoperta…………..
28 febbraio 1953: la scoperta della doppia elica del
DNA da parte di James Watson and Francis Crick
“credo di aver scoperto il segreto della vita“
(Crick, nell'Eagle Pub di Cambridge)
Tutti gli esseri viventi
hanno il DNA formato
dalle stesse 4 basi
A:T
G:C
.
DNA
Nell’uomo la molecola di DNA è
lunga circa 2 m (circa 9
miliardi di basi) e contiene
circa 30.000-40.000 geni
La conoscenza che il DNA è
il materiale ereditario ha
portato allo sviluppo di nuove
tecnologie di Miglioramento
genetico: tecniche di
mutagenesi
•Uso di radiazioni per causare mutazioni
casuali
Raggi X, g
In agricoltura per sviluppare nuove varietà …………
Raggi g
Es: Cariossidi di
frumento
irradiate con
raggi gamma
Progenie
genotipo selezionato
Varietà di grano
standard
Mutante 2
Mutante 3
Mutante 1
L’uomo da semplice selezionatore e
successivamente ‘combinatore’ della
variabilità naturale diventa
l’artefice della produzione di nuova
variabilità su cui operare per la
selezione di caratteri utili
(anche se gli incroci inter-specifici avevano
già rappresentato di fatto i primi tentativi di
produrre nuova variabilità)
Il grano duro Creso
e' stato ottenuto da
un incrocio tra una
varieta' messicana, la
Cymmit, e una
italiana, la Cappelli, la
quale e' stata
precedentemente
sottoposta a
bombardamento con
raggi X (è stato usato
il mutante di Cappelli
Cp B144).
In generale, circa 2000 varietà coltivate
derivano da questo trattamento
Intorno agli anni ’70
le tecniche di coltura in vitro
hanno evidenziato che..
Da una singola cellula vegetale possiamo
ottenere una pianta intera
Uso dei fitormoni
Sviluppate una serie di tecniche per
produrre nuova variabilità e con essa nuove
varietà
•
•
•
•
•
Colture cellulari
Variazione Somaclonale
Colture aploidi
Semi Artificiali
Ibridi Interspecifici
– Embryo Rescue
– Fusione dei
Protoplasti
(ibridazione somatica)
• Micropropagazione
Esempio di varietà derivata da
variazione somaclonale
Quindi, tramite tecniche di incrocio, mutagenesi,
colture in vitro sono state ottenute un incredibile
numero di varietà differenti.
Esempio: pomodoro
Intorno agli anni ’70, si sviluppano …
Le tecniche del DNA ricombinante
(ingegneria genetica)
Trasformazione genetica: produzione di piante
geneticamente modificate
Gene
inserito
Gene di interesse
+
DNA donatore
DNA di una
cellula
vegetale
Rigenerazione
della pianta
intera (Pianta
geneticamente
modificataOGM)
Metodi di
trasformazione genetica
per inserire il gene di
interesse nella pianta
In conclusione……………….
•le tecniche del DNA ricombinante
(ingegneria genetica) non sono altro che
un ulteriore strumento per produrre
prodotti utili all’uomo
•Esse rappresentano il risultato delle attuali
conoscenze biologiche
Riassumendo…….
•L’agricoltura non è nata in seguito ad un processo di
selezione naturale ma è una ‘invenzione’ dell’uomo
•Le piante coltivate non sono il risultato della selezione
naturale ma della selezione artificiale operata dall’uomo
•Le piante coltivate derivano da mutanti naturali
sottoposti al processo di miglioramento genetico o da
mutanti prodotti dall’uomo sulla base delle tecniche di
miglioramento genetico
•Le tecniche del miglioramento genetico si basano sulle
conoscenze biologiche
•Le tecniche del DNA ricombinate sono metodologie
del miglioramento genetico. Esse si basano sulle più
attuali conoscenze biologiche
Produzione di piante transgeniche:
Passaggi essenziali
Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un
plasmide)
Preparazione di un costrutto per la trasformazione
genetica
Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale
(Trasformazione genetica)
Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di
selezione)
Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)
Produzione di piante transgeniche:
Passaggi essenziali
Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un
plasmide)
Preparazione di un costrutto per la trasformazione
genetica
Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale
(Trasformazione genetica)
Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di
selezione)
Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)
Produzione di piante transgeniche:
caratteristiche essenziali di un costrutto genico
“gene di interesse”
gDNA
Promotore
gDNA
Transgene specifico
Es. 1) CaMV 35S (343 bp)
2) Ubiquitina di mais (1992 bp)
Terminatore
Es. NOS
Produzione di piante transgeniche:
Passaggi essenziali
Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un
plasmide)
Preparazione di un costrutto per la trasformazione
genetica
Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale
(Trasformazione genetica)
Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di
selezione)
Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)
Metodi di trasformazione
Biologico (Agrobacterium): dicotiledoni
Fisico (Biolistico): Monocotiledoni
•Elettroporazione
•Fusione con liposomi
•Microiniezione
•Vettori virali: solo per trasformazioni transienti
Metodo Fisico: trasformazione diretta
Bombardamento o metodo biolistico (microprojectile or particle bombardment). Questa tecnica si basa
sull’uso di un bombardatore (“particle gun” or “gene gun”). Il costrutto viene precipitato su particelle d’oro
che vengono ‘sparate’ nel tessuto vegetale. Nella amggior parte dei casi si osserva espressione transiente
(il DNA non si integra nel genoma ma viene trascritto finchè non viene degradato). In una piccola
percentuale di cellule il costrutto si integra nel DNA genomico e quindi si ha l’espressione stabile. Uno dei
principali limiti di questa tecnica è che spesso si ha l’integrazione di copie multiple del transgene.
Disco di rottura
Valvola della pressione
Disco con le particelle d’oro
ricoperte di DNA
Piastra di arresto
Linea per il vuoto
Linea del gas
Camera del vuoto
Campione va qui
Metodo biologico
Agrobacterium tumephaciens
Possiede un megaplasmide in aggiunta al suo DNA
cromosomico
Agrobacterium spp sono batteri del suolo Gram (-)
responsabili di numerose malattie delle piante
A. tumefaciens - crown gall disease – galla del colletto
rose
A. rhizogenes - hairy root disease- radici pelose
Meno studiato ma molto simile all’ A. tumefaciens
grapevine
A volte il
tumore può
essere molto
esteso!
Agrobacterium
e
Ingegneria Genetia vegetale
Osservazioni chiave
Il T-DNA è permanentemente incorporato nel genoma
della cellula ospite
Nessuno dei geni codificati dal T-DNA sono necessari
per questo;
Soltanto i bordi del T-DNA e le funzioni vir sono
necessari
Bordo di sinistra, LB
Bordo di destra, RB
Solo le due estremità – circa 25 basi ciascuna - sono necessarie
per il trasferimento e l’integrazione del T-DNA
Operativamente per la trasformazione sono necessari:
• Il gene di interesse (comprendente anche promotore e
terminatore) posto tra il LB e RB
• Geni Vir
Questi due componenti devono essere presenti nell’A.
tumefaciens per poter trasferire il gene di interesse
Plasmide Ti
Gene di interesse
T-DNA
LB
RB
E
D
C
G
B
A
vir
Plasmide Ti
ori
Plasmide molto
grande: circa 200 Kbp
•Sistema del Vettore binario
Gene di interesse
T-DNA
E
LB
D
C
G
B
A
RB
vir
Plasmide Ti helper
Plasmide Ti
ori
ori
•Sistema del
Vettore binario
Fig. 15.6 Watson et al DNA ricombinante
Produzione di piante transgeniche:
Passaggi essenziali
Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un
plasmide)
Preparazione di un costrutto per la trasformazione
genetica
Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale
(Trasformazione genetica)
Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di
selezione)
Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)
La necessità di usare i marcatori di selezione è dovuta
al fatto che:
Soltanto una piccola frazione delle cellule ospiti
subisce la trasformazione
Funzione del marcatore di selezione
Quindi, si usano condizioni di coltivazione in
cui le cellule trasformate sopravvivono, mentre le cellule non
trasformate muoino = pressione selettiva
Capsula di Petri contenente terreno di coltura per la
selezione (negativa) di piante trasformate (es. canamicina,
erbicida)
Produzione di piante transgeniche:
Passaggi essenziali
Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un
plasmide)
Preparazione di un costrutto per la trasformazione
genetica
Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale
(Trasformazione genetica)
Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di
selezione)
Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)
Rigenerazione
Il rapporto auxina
/citochinina
regola la
morfogenesi nelle
colture di tessuti
Piante e tessuti usati per la trasformazione
La scelta del tessuto dipende dalla specie
Il tessuto deve essere capace di generare callo (tessuto
indifferenziato) da cui si potrà rigenerare la pianta intera
Alcuni tessuti che si sono riscontrati trasformabili in
più piante sono:
•Embrioni immaturi
•Dischi fogliari
•Meristemi apicali
Es. I fiori di Arabidopsis possono essere semplicemente immersi in
una soluzione contenente il costrutto genico (Floral dip
transformation)
Metodo fisico
Metodo biologico
http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/genetransfer.html
Cosa è stato fatto...
Approvate per la commercializzazione
negli USA: 12 specie di piante
coltivate
Mais
patata
Cotone
Pomodoro
riso
zucchine
Soia
Barbabietola
lino
Papaya
Cicoria
colza
Sono stati modificati 6 caratteri
Resistenza agli erbicidi
Resistenza agli insetti (Bt)
Resistenza ai virus
Ritardo nella maturazione dei frutti
Alterazione nel contenuto in olii
Controllo nella produzione del polline
2010 – Aumento nel contenuto in amilopectina
Europa
Unico evento autorizzato in EU è il mais Bt MON810 (coltivato in
Spagna)
Resistenza agli insetti
Mais resistente alla
piralide (Ostrinia
nubilalis) tramite la
proteina Bt
Esempio di:
•Unica pianta transgenica coltivata in Europa
•Implementazione dell’espressione
Ciclo vitale della piralide: ciclo annuale
Ciclo vitale della piralide: danni della pianta
Infezioni secondarie su mais attaccata dalla piralide
Diffusione della piralide in Europa
Le piante di mais GM esprimono la proteina insetticida
del Bacillus thuringensis
Isolamento del gene Bt
Preparazione del
costrutto genico
Trasformazione
genetica
Rigenerazione
della pianta
Cultivar resistente alla piralide
Madalità di azione della proteina Bt
Maisgard (Monsanto)
Maisgard (Monsanto)
Sezione del fusto
di mais transgenico
per il gene Bt
Pianta di mais
NON
transgenica
Resistenza agli erbicidi
(carattere GM più diffuso)
bromoxynil cotone
glufosinato barbabietola, colza, mais, soia
glifosato
barbabietola, mais, cotone, soia
sulfonil urea cotone, lino
Eritrosio-4-fosfato
fosfoenolpiruvato
3-deidrochinato
3-deidroshichimato
acido scichimico 3-fosfato
fosfoenolpiruvato
EPSP sintasi
glifosato
EPSP
Corismato
Triptofano
Fenilalanina
Tirosina
Modalità d’azione delle piante di mais NK603 tolleranti al
glifosato
EPSPS: 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasi
CTP: proteina di trasporto nel cloroplasto
Qualche altro carattere manipolato………
Riso dorato – Ricco di provitamina A
Patata d’oro
AMFLORA
Patata autorizzata
alla coltivazione nel
2010, produce solo
amilopectina
I prodotti Biotech vengono
Continuamente Controllati
Scoperta
Isolamento
del gene
Trasform
azione
Sviluppo del Prodotto
Valutazione
della pianta
in serra e in
campo
Commercializzazione
Produzione
Post
Selezione
Sviluppo
Market
Market
della linea della varietà in campo
NIH-Natinal Institute of Healt
Linee guida
Es.
negli
USA
USDA - U.S. Department of Agriculture
Determina se è sicura da crescere
EPA - U.S. Environmental Protection Agency
Determina se è sicura per l’ambiente
FDA - U.S. Food and Drug Administration
Determina se è sicura come cibo
Grazie a questi controlli non ci sono
sul mercato i famosi mostri fragolapesce o pomodoro-pesce
Cosi come non è presente in
commercio la soia GE allergenica
Le piante GM sono più pericolose delle
altre piante?
No.
Dagli studi pubblicati relativi alla sicurezza
degli OGM (ca. 3.500) e dai dati ottenuti da una
serie di studi finanziati dalla Comunità Europea
durato 15 anni (70 milioni di €, 400 Centri di
ricerca pubblici coinvolti) emerge che gli OGM
non manifestano un comportamento diverso da
quello delle colture tradizionali
Principali preoccupazioni per ambiente e consumatori:
1. La diffusione di caratteri GM alle specie affini
selvatiche;
2. La diffusione della resistenza agli antibiotici nelle
popolazioni selvatiche di microrganismi;
3. Diffusione del materiale GM sulle coltivazioni
“biologiche”: es: attraverso le api (che renderebbe la
produzione biologica impossibile con l’attuale
normativa)
Limite 0.9%)
Regolamenti sulla Etichettatura degli
alimenti contenenti OGM
Stati Uniti: Concetto di alimenti OGM
sostanzialmente equivalenti ai convenzionali.
Se sostanzialmente equivalenti non c’e’
necessità di etichettamento
Europa: Alimenti contenenti >0.9% di OGM devono
essere etichettati (49/2000) (solo per
favorire la libera scelta del consumatore)
Controllo presenza OGM
negli alimenti
Si utilizza la tecnologia della reazione a catena della
DNA Polimerasi (PCR) che consente di rilevare la
presenza di OGM anche a livelli inferiori allo 0.1%
Analisi OGM sugli alimenti
Estrazione del DNA
Allestimento
della
reazione
Analisi PCR
Risultato
Conclusioni
Gli OGM offrono diversi potenziali benefici se
utilizzati appropriatamente:
• Cibo più sano
• Minore impatto ambientale
• Minori costi di produzione
La valutazione deve essere sicuramente
fatta caso per caso
Inoltre, si può sempre migliorare………..
Le piante cisgeniche: utilizzo della procedura di
trasformazione genetica per l’inserimento di geni
proveniente da piante sessualmente compatibili
