Mutazioni dinamiche

Le mutazioni 4
Lezione 13
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MUTAZIONI DINAMICHE
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MEMENTO
La cosidetta patologia molecolare ha come fine quello di
spiegare se e come un particolare allele sia collegabile ad un
fenotipo clinico, quindi ci si domanda: la mutazione che
effetto ha sulla quantita', qualita', funzione del prodotto?
cosi' si tenta di spiegare perche' sia o meno patogenetica
ormai vi saranno chiare le difficolta' che si incontrano e la
portata della sfida per comprendere il funzionamento del
genoma umano: le malattie genetiche sono il risultato di un
complesso network di interazioni, ma costituiscono il fulcro
per lo studio delle funzioni.
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&Insorgenza tardiva
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Anticipazione
L alcuni fenotipi a trasmissione autosomica dominante
diventano piu’ gravi nelle generazioni successive perche?
M
espansione di triplette: tipo di mutazione
individuata nel 1990
&Corea di Hunghinton, X fragile, Distrofia Miotonica
L premutazione : stato che aumenta il rischio di trasmettere
il fenotipo patologico. Il rischio non e’ piu’ quantizzabile in
termini probabilistici
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Schema di mutazioni dinamiche
Mutazione
completa,
range di
mutazione
Premutazione
Normale
CGG 1000
GAA900
CTG 3000
CGG
GAA
CTG
CGG
280
CGG
CGG
CGG 200
GAA
GAA
GAA
CGG 60
CGG
52
GAA
GAA
CGG
6
GAA
GAA
5’UTR
esone
X-fragile
200
CTG
CTG
CTG
GAA 22
GAA
CGG
CGG
CGG
CTG
GAA
CTG 50
CTG
CTG
CTG
7
introne
CTG
CTG
esone
introne
Atassia di
Friedrich
Mutazione
completa,
range di
mutazione
CAG 121
Premutazione
CAG 35
CGG 25
CAG
CGG
Normale
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
esone 3’UTR
Distrofia
miotonica
CGG 75
CAG
CGG
36
CGG
10
CGG
CGG
49
7
Esone ORF
Corea di Huntington
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37
3
Atassia spinocerebellare 1
Mutazioni dinamiche – effetto fondatore
Dal momento che le ripetizioni del range di normalità NON aumentano di
numero dopo replicazione, da dove sono nati gli alleli instabili?
EFFETTO FONDATORE: Eccezionalmente, in uno o pochi individui, si sono
verificati degli errori nella trascrizione, producendo degli alleli con un
numero di ripetizioni aumentato, che sono stati ereditati nelle successive
generazioni, producendo un pool di alleli instabili presenti oggi nella
popolazione
Per molte delle mutazioni dinamiche l ’effetto fondatore è stato dimostrato
Questo effetto fondatore si riconosce anche nell ’assenza o maggior
frequenza di alcune di queste patologie in certe aree geografiche
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Mutazioni dinamiche meccanismo
dell ’instabilità
Perché oltre una certa lunghezza compare il fenomeno dell ’instabilità?
La presenza di un aumentato numero di ripetizioni provoca, nel DNA, la
formazione di strutture alternative , assenti quando il numero di ripetizioni è
nel range di normalità
Queste strutture causano problemi sia nei processi di trascrizione (slippage
della polimerasi), sia probabilmente nei meccanismi di riparazione del DNA
La conseguenza ultima è la tendenza all ’incremento numerico delle
ripetizioni dopo replicazione (sia mitotica che meiotica!)
Per lo stesso principio, sono possibili anche le contrazioni di ripetizioni , ma per
la maggior parte delle patologie le espansioni sono favorite
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Mutazioni dinamiche
strutture alternative del DNA
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Mutazioni dinamiche
espansioni e contrazioni
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Mutazioni dinamiche
principi generali delle mutazioni dinamiche
INSTABILITÀ MITOTICA: determina la presenza di
espansioni di grandezze differenti all’interno dello stesso
tessuto e tra tessuti differenti. Produce dunque un
mosaicismo tissutale
INSTABILITÀ MEIOTICA: determina la trasmissione alle
generazioni successive di una espansione di diversa
ampiezza. E’alla base del meccanismo
dell ’anticipazione
TRASMISSIONE PATERNA O MATERNA: in alcune
patologie, si possono avere espansioni o contrazioni del
numero di ripetizioni a seconda che l’allele mutato sia
trasmesso dal padre o dalla madre
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Mutazioni dinamiche
Localizzazione delle espansioni
Perché un aumento nel numero di sequenze ripetute causa una patologia?
Esistono differenti meccanismi molecolari alla base delle diverse patologie
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Mutazioni dinamiche
Classificazione molecolare
Espansioni in porzioni codificanti (esoniche) del gene:
• Poliglutamine (Corea di Huntington, malattia di Kennedy,
SCAs)
• Polialanine (Oloprosencefalia, sinpolidattilia, hand-footgenital syndrome)
Espansioni in porzioni non codificanti del gene:
•
•
•
•
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Promotore (Epilessia progressiva mioclonica)
5’-UTR (Sindrome dell’X-fragile, SCA12)
Introne (Atassia di Friedrich, Distrofia miotonica di tipo 2)
3’-UTR (Distrofia miotonica di tipo 1, SCA8)
Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile
Come si spiega il paradosso di Sherman?
La sindrome dell ’X-fragile è stata la prima patologia da espansione di triplette
riconosciuta (1991).
Il gene responsabile è FMR1 che mappa sul cromosoma Xq27.3
La tripletta responsabile è CGG, situata nella porzione 5 ’-UTR
L ’espansione di questa tripletta è causa del 99% dei casi di FRAXA
Valori normali: < 44 repeats
Gray zone: 45-54 repeats
Premutazione : 55-200 repeats
Mutazione: > 200 repeats
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Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile
Soluzione del paradosso di Sherman:
Nel passaggio da una generazione all ’altra, soprattutto per trasmissione
materna, il numero di triplette tende ad aumentare > normalmente, i maschi figli
di portatrici avranno un numero di triplette più elevato rispetto alle madri
Ø Oltre le 200 ripetizioni: affetti
Ø Inferiore a 200 ripetizioni : clinicamente sani
Se l’aumento resta nell ’ambito della premutazione, i maschi che ricevono
l’allele premutato lo trasmetteranno mediamente invariato alle figlie
Le loro figlie avranno quindi un numero maggiore di ripetizioni rispetto alle nonne
>aumentato rischio di salto oltre le 200 ripetizioni = aumentato rischio di figli con
ritardo mentale rispetto alle nonne (effetto di posizione nell ’albero genealogico)
Oggi possiamo quantificare meglio il rischio di avere un figlio con ritardo mentale :
Ø Triplette inferiori a 55: rischio pari a 0
Ø Triplette superiori a 100: rischio pari al 100%
Ø Valori intermedi: il rischio cresce esponenzialmente
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Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile
Come nella distrofia miotonica,
l’espansione è localizzata in una
porzione del gene non tradotta
Diversamente da questa e ’una
patologia da silenziamento genico
perche ’
Il gene e’ composto di 17 esoni ed
e’ lungo 38 Kb.All’interno del
primo esone al 5’UTR e’ presente
una serie di CGG.Nella popolazione
questa regione e’ polimorfica:
varia da 7 a 52 ripetizioni: l’allele
piu’ comune e’ quello di 30
(effetto fondatore).
Quando il numero delle triplette
supera 230 l’intera regione viene
ipermetilata aggiungendo un gruppo
metilico a C su entrambe le eliche
M il promotore del gene viene inattivato e FRM1 diviene silente
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e la cromatina non riesce a condensare correttamente
Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile
riassumendo
*La tripletta CGG si trova vicina al promotore del gene FMR1 in una zona ricca di
CpG islands
*Un’espansione
oltre i 200 repeats causa il richiamo di specifiche proteine che
metilano le citosine del promotore del gene FMR1> MODIFICA EPIGENETICA
*La proteina FMRP è importante nello sviluppo neuronale e dei dendriti. Se il gene
è silenziato > APLOINSUFFICIENZA
*Nei maschi, non si avrà alcun prodotto proteico (emizigoti) > affetti
*Nelle femmine, il prodotto presente dipende da quale cromosoma X è inattivato >
affette se è maggiormente inattivo il cromosoma X normale, altrimenti sane
(mosaicismo di metilazione )
*Ecco perché la frequenza delle femmine affette è minore
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Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile
riassumendo
Ridefininizione di mutazione patologica: è definita come
corrisponde all ’allele con oltre 200 triplette metilate
full mutation ,
Casi particolari (rari):
Mosaicismo di lunghezza (normale/premutato; premutato/full mutato;
normale/mutato) > fenotipo variabile
Mosaicismo di metilazione
>fenotipo variabile
(alleli con > 200 triplette metilati e non metilati)
1% dei pazienti non presenta espansione di triplette : mutazioni puntiformi,
delezione del gene
Perché i maschi affetti non hanno figlie affette?
I maschi con full mutation hanno solo premutazioni negli spermatozoi per la
selezione degli spermatozoi durante lo sviluppo embrionale
Di conseguenza, le figlie di maschi affetti saranno solo premutate e mai full
mutate
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Mutazioni dinamiche – FMR1 related disorders
FMR1 -related disorders
* Il 20% delle donne con premutazione presenta Premature Ovarian Failure (POF,
esaurimento follicolare precoce)
*Circa il 20% degli uomini con premutazione presenta Fragile X ataxia/Tremor
Syndrome (FXTAS), mentre è rarissima tra le donne
Il gene FMR1 presenta quindi ETEROGENEITÀ ALLELICA
NON sono patologie da aploinsufficienza : sono probabilmente patologie RNA
mediate:Gli alleli premutati non solo non sono silenziati, ma presentano anche
un’aumentata trascrizione, per compensare il difetto di traduzione degli alleli
espansi ? accumulo di RNA
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-
Mutazioni dinamiche – Corea di Huntington –
meccanismi 1
Meccanismo patogenetico principale: tossicità da
poliglutamine
L’eccesso di glutamine nella sequenza aminoacidica impedisce
il giusto ripiegamento (folding) della proteina stessa
La proteina viene degradata ma i frammenti con le
poliglutamine si aggregano
Si formano accumuli all’interno dei nuclei dei neuroni con
guadagno di funzione ed effetto citotossico ? apoptosi e
degenerazione neuronale
Accanto a questo, ci sono altri meccanismi che contribuiscono a
determinare il fenotipo (danno mitocondriale, alterazione della
trascrizione di altri geni, alterazione del trasporto assonale)
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Mutazioni dinamiche – Corea di Huntington – meccanismi 2
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Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 1 –
classificazione molecolare
Gene responsabile: l ’espansione riguarda la tripletta da CTG e si trova
nella regione 3 ’UTR del gene DMPK che mappa sul cromosoma 19q13.3
Classificazione molecolare:
•5-36 repeats: alleli normali
•50-150 repeats: classe E1
•150 -1000 repeats: classe E2
•1000 - >4000 repeats: classe E3
La forma congenita si manifesta in genere per espansioni di classe E3,
trasmesse per via materna.
Le espansioni trasmesse dal padre tendono ad essere più stabili (presenza
sia di espansioni, sia assenza di variazione, sia rare contrazioni )
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Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 1 pedigree
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Il gene DMPK
Nei pazienti (CTG)n è espanso
Distrofia miotonica
M questo non e ’sufficiente per dire che quel gene e
’il
responsabile della malattia: bisogna individuare anche affetti con
mutazioni puntiformi.
M Nel caso di FMR1 ci sono affetti senza espansione con
mutazioni puntiformi che impediscono l ’espressione.
M si ritiene che il gene identificato sia il principale, ma non si
e’ancora compreso perche l ’espansione provochi la patologia.
Forse altera l ’espressione dei geni adiacenti. Esistono modelli
murini che sembrerebbero validare questa ipotesi.
M Ma allora bisogna ritenere DM
una sindrome da geni contigui
Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 2
Miopatia miotonica prossimale (PROMM), simile e
spesso indistinguibile a livello clinico dalla DM1
La sua frequenza non è chiara (1/50.000 circa)
Le differenze maggiori con la DM1 riguardano
• Presenza di una clinica globalmente più lieve
• Possibile presenza di crampi e algie, mai presenti
nella DM1
• Colpisce prima i muscoli prossimali
• Non è mai presente una forma congenita con
ritardo mentale
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Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 2
La patologia è determinata da un ’espansione di un tetranucleotide CCTG,
presente nel primo introne del gene ZNF9, che mappa in posizione 3q21.3
Alleli normali: 11 -26 repeats
Alleli mutati: 75 -11.000 repeats (media: 5.000 repeats)
Nonostante il grandissimo numero di ripetizioni, non è possibile effettuare
una correlazione genotipo -fenotipo
La penetranza è completa e l ’espressività è variabile
DM1 e DM2 sono un esempio di ETEROGENEITÀ GENETICA, cioè
mutazioni in geni differenti possono produrre lo stesso fenotipo
Entrambe le patologie sono dotate di grandissimo
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mosaicismo somatico
Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica –
Patologia ad RNA
Perché una
mutazione in
una regione
non
codificante
provoca una
patologia?
Patologia
dell’RNA
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Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica –
Patogenesi
Il gene DMPK è trascritto in mRNA che deve essere traslocato dal nucleo al
citoplasma per essere processato
Se è presente l ’espansione, questa sarà trascritta in RNA (CUG). In seguito
allo splicing dell ’mRNA, il messaggero contenente la ripetizione CUG
forma degli aggregati resistenti alla distruzione che rimangono
intrappolati nel nucleo
Questi aggregati interferiscono con altre proteine nucleari >
guadagno di
funzione
In particolare, gli aggregati ( “foci ”) di RNA sequestrano una classe di
proteine (MBNL1) e “spiazzano ”una seconda famiglia di proteine (CELF).
Questi due tipi di proteine sono necessari per un corretto assemblaggio dello
spliceosoma
L ’effetto finale è l ’alterazione dello splicing di altri geni, con conseguente
alterazione funzionale di diversi pathways (effetto in trans )
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