controllo interno di idoneità del DNA estratto

DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
DK100
PRINCIPIO DELLA METODICA
EL I Te c hG r o up S.p . A.
C.so Svizzera, 185
10149 Torino ITALY
Uffici: Tel. +39-011 976 19 Fax +39-011 936 76 11
E. mail: [email protected]
sito WEB: www.elitechgroup.com
DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
-20°C
La procedura prevede l'impiego del DECK, utilizzato come diluente dell'enzima Taq DNA polimerasi,
nella fase di allestimento dell'amplificazione. Il DECK aggiunto alla reazione di amplificazione per il
parametro in analisi fornisce gli oligonucleotidi di innesco per la coamplificazione (controllo interno) della
regione promotore e 5' UTR del gene umano della beta Globina.
Nel caso del DNA estratto da campioni biologici cellulari la regione di interesse del gene umano della
beta Globina è fornita dal DNA genomico delle cellule del campione stesso.
Nel caso del DNA estratto da campioni biologici non cellulari è fornita dal «CPE-DNA - Internal
Control».
La presenza del prodotto specifico della reazione di amplificazione del gene umano della beta
Globina indica l'idoneità del campione in cui non è stato rilevato il parametro in analisi e la correttezza
dell'esecuzione dell'estrazione e dell'amplificazione.
Il DECK inoltre permette di verificare visivamente l'aggiunta dell'enzima DNA polimerasi termostabile
diluito alla miscela di amplificazione grazie alla sua colorazione e di caricare direttamente il prodotto della
reazione di amplificazione su gel di agaroso grazie alle sue caratteristiche di densità e di colorazione.
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DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
SOMMARIO
Il prodotto fornisce la miscela di controllo interno DECK per l'amplificazione, aliquotata in quattro
provette e pronta all'uso.
USO PREVISTO
PRINCIPIO DELLA METODICA
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO
MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO
ALTRI PRODOTTI RICHIESTI
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
CAMPIONI E CONTROLLI
PROCEDURA
LIMITI DELLA PROCEDURA
CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI
PROBLEMI E SOLUZIONI
LEGENDA DEI SIMBOLI
pag. 1
pag. 2
pag. 2
pag. 2
pag. 2
pag. 3
pag. 3
pag. 4
pag. 5
pag. 8
pag. 9
pag. 11
pag. 12
Il prodotto consente di effettuare il controllo di idoneità in 100 reazioni di amplificazione totali (100
single round o 50 nested), controlli positivi e negativi compresi, utilizzandone 5 µL per reazione.
MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO
Componente
DECK
Descrizione
miscela di controllo
Quantità
Composizione
Etichettatura
4 x 200 µL
Oligonucleotidi,
TRIS base, TRIS cloridrato,
saccaroso, Blu Bromofenolo,
Xilencianolo FF
-
MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO
USO PREVISTO
Il prodotto «DECK» è un sistema di controllo interno di idoneità del DNA estratto da campioni
biologici per saggi qualitativi di amplificazione degli acidi nucleici della serie «oligomix Alert kit» di
ELITechGroup S.p.A.
Il DECK inoltre permette di controllare e facilitare l'esecuzione delle procedure analitiche nei saggi
qualitativi di amplificazione degli acidi nucleici.
- Cappa a flusso laminare.
- Guanti monouso in lattice o simili.
- Microcentrifuga da banco (12.000 - 14.000 RPM).
- Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µL, 2-20 µL, 5-50 µL).
- Termostato programmabile (thermal - cycler).
Il prodotto trova impiego nell'identificazione dei campioni idonei, cioè dei campioni che non hanno
inibito il saggio qualitativo di amplificazione degli acidi nucleici, in una sessione di analisi.
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DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
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DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
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Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare
ALTRI PRODOTTI RICHIESTI
I reagenti per l'estrazione del DNA dai campioni da analizzare, per il controllo positivo di estrazione,
per l'amplificazione, per il controllo positivo di amplificazione e per la rivelazione del DNA amplificato non
sono inclusi in questo prodotto. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l’impiego dei seguenti prodotti
accessori di ELITechGroup S.p.A.:
«EXTRAcell» (codice EXTD02), kit di estrazione del DNA da campioni cellulari;
«EXTRAgen» (codice EXTG01), kit di estrazione degli acidi nucleici da campioni non cellulari;
«CPE-DNA - Internal Control» (codice CTREXTG), controllo positivo di estrazione di DNA
plasmidico per sistemi di estrazione del DNA da campioni non cellulari;
«DNA pol. 2U / µL» (codici ER40, ER140), enzima DNA polimerasi termostabile per l'amplificazione
degli acidi nucleici; il prodotto ER40 consente di effettuare 25 reazioni, il prodotto ER140 consente di
effettuare 100 reazioni.
«DNA pol. 5U / µL» (codici EP40, EP110), enzima DNA polimerasi termostabile ad attivazione
termica per l'amplificazione degli acidi nucleici; il prodotto EP40 consente di effettuare 10 reazioni, il
prodotto EP110 consente di effettuare 40 reazioni.
serie «OligoMIX Alert kit», kit di amplificazione del DNA estratto da campioni biologici;
serie «Positive Control», controlli positivi di amplificazione di DNA plasmidico;
«ELECTROPHORESIS 2» (codice EPH02), rivelazione del DNA amplificato per elettroforesi su gel
di agaroso.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la
rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in
particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni
da parte di prodotti di amplificazione.
E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione
e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione
nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione.
E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle
reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire
camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per
l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione.
I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere
manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere
aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a
questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per
aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA.
I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per
l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette
utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del
tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere
sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA.
I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione
nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di
amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso.
Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti
Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro.
Il DECK presenta i seguenti consigli di prudenza (S):
S 23-25. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi.
Avvertenze e precauzioni generali
Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti
infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale
che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30
minuti oppure trattato in autoclave a 121°C per un' ora prima di essere smaltito.
Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero in
grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o
aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale
monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere
neutralizzati prima dell'eliminazione.
Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi o la faccia.
Non pipettare a bocca alcuna soluzione.
Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro.
Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti.
Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti.
Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio.
Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio.
Rispettare la data di scadenza del prodotto.
Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore.
Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi.
Non utilizzare reagenti provenienti da prodotti di altri produttori.
CAMPIONI E CONTROLLI
Campioni
Il materiale da utilizzare con questo prodotto deve essere costituito da DNA estratto da campioni
biologici.
Il sistema di estrazione del DNA dal campione di partenza deve fornire DNA idoneo all'uso in
reazioni di amplificazione.
Quando si impiegano campioni biologici cellulari si consiglia di non immettere nella reazione di
amplificazione con i 5 µL di DNA estratto una quantità di DNA genomico superiore a quella corrispondente a
circa 150.000 cellule (circa 1 µg), per evitare la comparsa di prodotti aspecifici di amplificazione e possibili
fenomeni di inibizione.
Si consiglia di allestire più aliquote dei campioni da conservare congelate in modo da non sottoporle
a cicli di congelamento / scongelamento ripetuti.
Le istruzioni per l'eventuale pretrattamento del campione clinico e per l'estrazione del DNA sono
contenute nei Manuali di istruzioni per l'uso di «EXTRAcell» e di «EXTRAgen».
Sostanze interferenti
Il DNA estratto dal campione di partenza non deve contenere eparina, mucoproteine o emoglobina
per evitare fenomeni di inibizione e la comparsa di frequenti risultati non validi.
Non sono disponibili dati riguardo eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci antivirali,
chemioterapici o immunosopressori.
Nota bene: Per quanto riguarda i Positive Control e i Controlli di qualità fare riferimento al manuale di
istruzioni per l'uso del saggio per il parametro in analisi.
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DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
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DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
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A titolo di esempio, è riportata di seguito una figura schematica che rappresenta il risultato della
separazione elettroforetica di una sessione amplificazione in cui sono stati analizzati quattro campioni. La
reazione di amplificazione per il parametro in analisi presenta un prodotto specifico di 110 bp.
PROCEDURA
Impostazione del ciclo termico
(Da eseguire nell'area di amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione)
Pesi
Controllo
Molecolari positivo
Prima di iniziare la sessione è necessario:
- verificare sul manuale di istruzioni per l'uso del saggio per il parametro in analisi che il ciclo termico
della reazione di amplificazione preveda una temperatura di ibridazione degli oligonucleotidi di
innesco (annealing) compresa tra 50°C e 60°C ;
- impostare sul thermal - cycler il ciclo termico della reazione di amplificazione.
Controllo
negativo
Campione Campione Campione
idoneo
idoneo
idoneo
Campione
positivo
positivo
negativo non idoneo
Pozzetti
1380 bp
Allestimento dell'amplificazione
(Da eseguire nell'area di estrazione / allestimento della reazione di amplificazione)
517 bp
Prima di iniziare la sessione è necessario:
- verificare sul manuale di istruzioni per l'uso del saggio per il parametro in analisi che il prodotto
specifico della reazione di amplificazione abbia dimensioni inferiori a 500 bp in modo da poter
essere risolto nella fase di rivelazione elettroforetica su gel di agaroso;
- scongelare una provetta di DECK, mescolare per inversione, centrifugare per 5 secondi per
riportare sul fondo il contenuto e tenerla in ghiaccio.
- prelevare l’enzima DNA polimerasi termostabile (non fornita nel prodotto), centrifugarlo per 5
secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerlo in ghiaccio;
- diluire l’enzima DNA polimerasi termostabile (non fornita nel prodotto) con il DECK come descritto
nel manuale di istruzioni per l'uso del saggio per il parametro in analisi. Preparare un volume di
enzima diluito sufficiente per tutte le reazioni previste (controlli compresi) più una, per avere un
margine di sicurezza. L’enzima diluito non può essere conservato.
● Aggiungere a ciascuna provetta di amplificazione 5 µL dell'enzima DNA polimerasi termostabile diluito
con il DECK.
Nota bene: L'aggiunta dell'enzima DNA polimerasi termostabile diluito alla miscela di amplificazione può
essere verificata visivamente grazie alla colorazione blu del DECK.
Nota bene: Quando il saggio prevede l'esecuzione di due successive reazioni di amplificazione (nested) il
DECK deve essere utilizzato per la diluizione dell'enzima DNA polimerasi termostabile sia nell'allestimento
della prima amplificazione sia nell'allestimento della seconda amplificazione.
Allestimento della rivelazione elettroforetica su gel di agaroso
(Da eseguire nell'area di amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione)
600 bp
456 bp
600 bp
396 bp
247 bp
75 bp
65 bp
110 bp
110 bp
110 bp
46 bp
Con il DECK, i campioni idonei nei quali è assente il prodotto di amplificazione del parametro in
analisi presentano comunque il prodotto di amplificazione del gene umano della beta Globina di dimensioni
di circa 600 bp.
Con il DECK, i campioni idonei nei quali è presente il prodotto di amplificazione del parametro in
analisi (positivi) non presentano sempre il prodotto di amplificazione del gene umano della beta Globina.
Infatti la reazione di amplificazione a bassa efficienza del gene umano della beta Globina con il DECK può
essere annullata dalla competizione con la reazione di amplificazione ad alta efficienza del parametro in
analisi.
E' assolutamente necessario convalidare la specificità del prodotto della reazione di amplificazione
di un campione confrontando la sua migrazione su gel con la migrazione di un marker di peso molecolare.
L'eventuale presenza di prodotti aspecifici della reazione di amplificazione non ha alcun significato
per quanto riguarda la ricerca del DNA del gene umano della beta Globina con il DECK.
Il prodotto specifico della seconda amplificazione può essere rivelato ed identificato mediante
separazione elettroforetica utilizzando un gel d'agaroso al 4% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone
TAE 1x (20 mM TRIS base, 20 mM TRIS acetato, 1 mM EDTA disodico), come nel prodotto
«ELECTROPHORESIS 2».
Nota bene: Il DECK elimina la necessità di preparare il prodotto della reazione di amplificazione mediante
l'aggiunta di un tampone di caricamento grazie alla sua densità e colorazione.
● Prelevare 15 µL di prodotto della reazione di amplificazione e trasferirli direttamente in un pozzetto del
gel di agaroso.
Il prodotto specifico della amplificazione del gene della beta Globina ha dimensioni di circa 600 bp.
Nota bene: La corsa elettroforetica deve essere eseguita in modo da risolvere il prodotto specifico della
reazione di amplificazione del parametro in analisi dal prodotto specifico del gene umano della beta Globina.
Nota bene: Il prodotto della reazione di amplificazione è in grado di contaminare i saggi successivi.
Confinare il prodotto della reazione di amplificazione residuo e gli scarti prodotti nella fase di rivelazione.
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controllo interno di idoneità del DNA estratto
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DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
Interpretazione dei risultati
LIMITI DELLA PROCEDURA
I risultati delle reazioni di amplificazione per il parametro di interesse e per il gene della beta Globina
con il DECK sono utilizzati per valutare la presenza del DNA del parametro di interesse come descritto nella
tabella seguente:
Amplificazione del campione
Prodotto specifico
parametro in analisi
DK100
Idoneità del
campione
Risultato del
saggio
DNA del
parametro in
analisi
ASSENTE
non idoneo
non valido
-
PRESENTE
idoneo
valido, negativo
NON RIVELATO
ASSENTE
idoneo*
valido, positivo
PRESENTE
PRESENTE
idoneo
valido, positivo
PRESENTE
Prodotto specifico
DECK
ASSENTE
PRESENTE
Se nella reazione di un campione, sono assenti sia il prodotto specifico di amplificazione del
parametro di interesse sia quello del gene umano della beta Globina del DECK, si sono verificati problemi
nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o assente) o nella fase di estrazione (assenza di
DNA o presenza di inibitori) che possono causare risultati falsi negativi.
Il campione non è idoneo, il saggio non è valido e deve essere ripetuto a partire dall’estrazione di un
nuovo campione.
Per quanto riguarda i risultati ottenuti per il parametro in analisi fare riferimento al relativo manuale di
istruzioni per l'uso saggio.
*Nota bene: Quando nella reazione di amplificazione è presente il prodotto specifico del parametro di
interesse, il prodotto specifico del gene umano della beta Globina può risultare assente. Infatti la reazione di
amplificazione a bassa efficienza del gene umano della beta Globina del DECK può essere annullata dalla
competizione con la reazione di amplificazione ad alta efficienza del parametro di interesse. In questo caso il
campione è comunque idoneo e il risultato positivo del saggio è valido.
Questo prodotto può essere utilizzato soltanto con saggi qualitativi di amplificazione degli acidi
nucleici il cui prodotto specifico sia una molecola di DNA di dimensioni inferiori a 500 bp e la cui temperatura
di ibridazione degli oligonucleotidi di innesco sia compresa tra 50°C e 60°C.
Utilizzare con questo prodotto soltanto il DNA estratto da campioni umani.
Non utilizzare con questo prodotto il DNA estratto da campioni eparinati: l'eparina inibisce la
reazione di amplificazione degli acidi nucleici e causa risultati non validi.
Non utilizzare con questo prodotto DNA estratto contaminato da mucoproteine o emoglobina: le
mucoproteine o l'emoglobina inibisce la reazione di amplificazione degli acidi nucleici e può causare risultati
non validi.
Non sono disponibili dati riguardo eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci antivirali,
chemioterapici o immunosopressori.
I risultati ottenuti con questo prodotto dipendono dalla corretta raccolta, trasporto, conservazione e
preparazione dei campioni; per evitare risultati errati è quindi necessario porre particolare cura durante
queste fasi e seguire attentamente le istruzioni fornite con i prodotti per l'estrazione degli acidi nucleici.
La metodica di amplificazione nested degli acidi nucleici utilizzata in questo prodotto, a causa della
sua elevata sensibilità analitica, è soggetta a contaminazione da parte di campioni clinici positivi per i
parametri di interesse, dei controlli positivi e degli stessi prodotti della reazione di amplificazione. Le
contaminazioni portano a risultati falsi positivi. Le modalità di realizzazione del prodotto sono in grado di
limitare le contaminazioni; tuttavia questi fenomeni possono essere evitati solo con una buona pratica delle
tecniche di laboratorio e seguendo attentamente le istruzioni fornite in questo manuale.
Questo prodotto richiede personale addestrato per le procedure di biologia molecolare, come
l'estrazione, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici per evitare risultati errati.
Questo prodotto richiede aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione
e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi.
Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle
reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati
falsi positivi.
Come per qualunque altro dispositivo diagnostico, esiste un rischio residuo di ottenere risultati falsi
positivi e falsi negativi con questo prodotto. Questo rischio residuo non può essere eliminato o ridotto
ulteriormente. Questo rischio residuo in situazioni particolari, come le diagnosi di urgenza, può contribuire a
decisioni errate con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente.
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controllo interno di idoneità del DNA estratto
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Rivelazione di inibizione
CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI
La capacità di rivelare la presenza di inibitori del DECK permette di identificare i campioni non
idonei, cioè i saggi di amplificazione che sono stati inibiti e sono non validi.
Sensibilità analitica: gene umano della beta Globina
La sensibilità analitica del DECK permette di identificare la presenza di circa 3.000 molecole di DNA
bersaglio, corrispondenti a circa 10 ng di DNA genomico umano, corrispondenti a circa 1.500 cellule, nei 5
µL di DNA estratto aggiunti alla reazione di amplificazione.
La sensibilità analitica del DECK è stata verificata, per esempio, con il prodotto di ELITechGroup
S.p.A. «CMV early» utilizzando come materiale di riferimento calibrato del DNA genomico umano la cui
concentrazione iniziale è stata misurata spettrofotometricamente.
Un campione con una concentrazione di 10 ng di DNA genomico in 5 µL è stato impiegato in 10
replicati per eseguire la procedura di amplificazione. Tutti i campioni sono risultati positivi per il gene umano
della beta Globina come illustrato nella tabella seguente.
Campioni
N
positivi DECK
negativi DECK
10 ng DNA genomico
10
10
0
Sensibilità analitica: parametro in analisi
La sensibilità analitica del saggio qualitativo di amplificazione degli acidi nucleici del parametro di
interesse non è modificata dall'uso del DECK e rimane di circa 10 molecole di DNA bersaglio nei 5 µL di
DNA estratto aggiunti alla reazione di amplificazione.
La reazione di amplificazione del gene umano della beta Globina del DECK è stata calibrata in modo
da avere una bassa efficienza per evitare che possa competere con la reazione di amplificazione ad alta
efficienza del parametro di interesse.
La compatibilità del DECK è stata verificata, per esempio, con il prodotto di ELITechGroup S.p.A.
«CMV early» utilizzando come materiale di riferimento calibrato del DNA genomico umano e un DNA
plasmidico, contenente il prodotto di amplificazione, le cui concentrazioni iniziali sono state misurate
spettrofotometricamente.
Un campione con una concentrazione di 10 copie di DNA plasmidico e 500 ng di DNA genomico in
5 µL è stato impiegato in 10 replicati per eseguire la procedura di amplificazione. Tutti i campioni sono
risultati positivi per CMV come illustrato nella tabella seguente.
Campioni
N
10 copie DNA plasmidico + 500 ng DNA
10
genomico
DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
positivi CMV
negativi CMV
10
0
La reazione di amplificazione del gene umano della beta Globina del DECK è stata calibrata in modo
da avere una bassa efficienza e da risultare quindi molto sensibile all'inibizione da parte di sostanze
interferenti eventualmente presenti nel DNA estratto.
La capacità di rivelare la presenza di inibitori del DECK è stata verificata, per esempio, con il
prodotto di ELITechGroup S.p.A. «CMV early» utilizzando come materiale di riferimento calibrato del DNA
genomico umano e un DNA plasmidico, contenente il prodotto di amplificazione, le cui concentrazioni iniziali
sono state misurate spettrofotometricamente.
Un campione con una concentrazione di 10 copie di DNA plasmidico e 500 ng di DNA genomico in
5 µL è stato impiegato in 3 replicati per eseguire la procedura di amplificazione con concentrazioni crescenti
di EDTA che inibisce la reazione sottraendo il magnesio, cofattore necessario per l'attività dell'enzima DNA
polimerasi termostabile. I risultati sono riassunti nella tabella seguente.
Campioni
inibitore
10 c. DNA plasmidico +
+ 500 ng DNA genomico
- (controllo)
N
3
positivi CMV
3
positivi DECK
3
esito
3 positivi CMV
10 c. DNA plasmidico +
+ 500 ng DNA genomico
0,5 mM EDTA
3
3
0
3 positivi CMV
10 c. DNA plasmidico +
+ 500 ng DNA genomico
1,0 mM EDTA
3
1
0
1 positivo CMV
2 non validi
10 c. DNA plasmidico +
+ 500 ng DNA genomico
1,5 mM EDTA
3
0
0
3 non validi
10 c. DNA plasmidico +
+ 500 ng DNA genomico
2,0 mM EDTA
3
0
0
3 non validi
Le prove di rivelazione di inibizione dimostrano che, pur essendo presenti circa 150.000 copie del
gene umano della beta Globina e solo 10 copie dello standard di DNA plasmidico, in presenza dell'inibitore
EDTA si ottengono solo risultati non validi (negativi per il DNA di CMV e negativi per il DNA del gene umano
della beta Globina) e nessun risultato falso negativo (negativo per il DNA di CMV e positivo per il DNA del
gene umano della beta Globina).
Nota bene: I dati e i risultati completi delle prove eseguite per la valutazione delle caratteristiche delle
prestazioni del prodotto sono registrati nella Sezione 7 del Fascicolo Tecnico di Prodotto "DECK",
FTP DK100.
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DECK
controllo interno di idoneità del DNA estratto
PROBLEMI E SOLUZIONI
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LEGENDA DEI SIMBOLI
Prodotto specifico di amplificazione assente nella reazione dei campioni
Numero di catalogo.
Possibili cause
Soluzioni
Errore durante la dispensazione del CPE-DNA
Eseguire con attenzione la dispensazione del CPE-DNA
Errore durante l'estrazione del DNA
Seguire con attenzione le istruzioni relative all'estrazione del
DNA.
Limite superiore di temperatura.
Campione con un numero di cellule troppo Seguire le istruzioni relative ai campioni adatti per
basso
l'estrazione del DNA.
Codice del lotto.
Seguire le istruzioni relative ai campioni adatti per
l'estrazione del DNA.
Campione non adatto
Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese).
Errore durante la dispensazione del DNA
Eseguire con attenzione la dispensazione del DNA
estratto
Dispositivo medico diagnostico in vitro.
Errore durante la dispensazione del prodotto di Prelevare e dispensare con attenzione il prodotto di prima
prima amplificazione
amplificazione nella seconda amplificazione
Errore durante la dispensazione del prodotto Caricare con attenzione il prodotto della reazione di
della reazione di amplificazione nel gel
amplificazione nel gel
Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici
diagnostici in vitro.
Enzima troppo diluito o errore durante le Ricontrollare i calcoli di diluizione, seguire con attenzione la
dispensazione degli enzimi
dispensazione dell'enzima e mescolare adeguatamente
Degradazione del CPE-DNA
Utilizzare una nuova aliquota di CPE-DNA
Errore di impostazione dei cicli termici
Controllare i cicli termici impostati sul thermal – cycler.
Contenuto sufficiente per "N" test.
CONT
Contenuto.
Attenzione, consultare le istruzioni per l’uso.
Fabbricante.
L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per l'amplificazione di sequenze di acidi nucleici al fine di fornire
servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ad un prodotto licenziato per
il "Positive Control" e per la rivelazione di ELITechGroup S.p.A.
Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto.
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