DNA - Ente Nazionale Risi

Laboratorio di Biologia Molecolare
Creato nel 2006 con la finalità di effettuare Selezione Assistita con i Marcatori
molecolari (SAM) quale supporto ai programmi di breeding tradizionale e di
rispondere a specifiche esigenze della filiera
STRUMENTAZIONE PRESENTE NEL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE
Preparazione del campione:
 mulino per materiale verde e piccole
quantità di seme
 mulino per la macinazione dei
campioni sottoposti ad analisi OGM




Estrazione del DNA:
bagnomaria
bilance
centrifughe
camere da vuoto
Amplificazione PCR:
 Real-Time PCR
 PCR con gradient
Rilevazione dei prodotti PCR:
 celle elettroforetiche
 sistema di acquisizione ed analisi
dell’immagine
 Real-Time PCR
Gestione e dispensazione dei campioni:
 sistema robotico
Stoccaggio dei campioni e dei reagenti:
 frigoriferi
 congelatori – 20°C
 ultracongelatori – 80°C
ATTIVITÀ DEL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE
La biologia molecolare è un ramo della biologia che studia ed interpreta a livello molecolare i fenomeni biologici, considerando la struttura, le proprietà
e le reazioni delle molecole chimiche di cui gli organismi viventi sono costituiti.
Essa comprende le tecniche che consentono la rilevazione, l'analisi, la manipolazione, l'amplificazione (PCR) e la copia (clonaggio) degli acidi nucleici.
L'acido desossiribonucleico (DNA) è un acido nucleico che contiene le informazioni
genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per
lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.
Nel sistema dell'espressione genica cellulare sono
identificabili tre punti che rappresentano la direzione
fondamentale del flusso di informazione genetica,
partendo dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine:
• L'informazione genetica è conservata nel DNA, che
può essere duplicato nella propagazione
dell'informazione,
• Il DNA, per essere espresso nella cellula, viene
trascritto sotto forma di RNA,
• L'RNA viene tradotto in proteine, concepite come
la forma "operativa" e terminale delle informazioni
contenute nel genoma.
La struttura della doppia elica del DNA fu scoperta nel 1953 da James Watson e
Francis Crick. Hanno ottenuto il Premio Nobel nel 1962.
Il DNA è costituito da due catene dette eliche, ciascuna delle quali è costituita da
delle unità base, chiamate nucleotidi, a sua volta costituiti da uno zucchero, una
base azotata (adenina, guanina, citosina, timina) e un gruppo fosfato. Le due eliche
sono tenute insieme attraverso dei legami tra le diverse basi azotate, in questo
modo la struttura del DNA assume la forma di un lungo nastro.
Il DNA è complessato in strutture chiamate cromosomi.
LE FASI DI UN’ANALISI MOLECOLARE
ESTRAZIONE DEL DNA
DNA
TRASCRIZIONE
RNA
TRADUZIONE
PROTEINE
La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, comunemente
nota con l’acronimo PCR) è una tecnica di biologia molecolare che consente la
moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si
conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione
mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di
materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.
Molecola
iniziale
di DNA
La PCR fa in una provetta ciò che ogni cellula del nostro corpo fa ogni giorno,
producendo miliardi di copie esatte del nostro DNA, amplificandolo milioni di
volte.
Tale metodica fu ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il
premio Nobel per la chimica (1993).
Provetta contenente:
1
2
4
8
Numero di molecole di DNA
PRINCIPIO DELLA REAL-TIME PCR
Denaturazione per scindere la
doppia elica del DNA. I due
filamenti di cui essa è
composta sono liberi.
- il DNA da replicare,
- i desossiribonucleotidi trifosfati (A, T, G, C),
- gli ioni magnesio,
- i primers,
- la TAQ polimerasi
Matrice: materiale verde, sementi di riso e riso
(greggio, semigreggio, lavorato)
I quattro primi cicli della PCR
Vantaggio: possono essere utilizzate piccole quantità
di materiale
Le fasi dell’estrazione del DNA:
2- Amplificazione Real-Time PCR
o PCR
1- Lisi cellulare per liberare il DNA dai nuclei e dalle
proteine istoniche ed inattivare le nucleasi cellulari
(macinazione e trattamento chimico-termico)
2- Purificazione del DNA per separare il DNA dalle
componenti cellulari (proteine, lipidi, polisaccaridi) e
dalle sostanze interferenti
4- Analisi
dei risultati
3- Precipitazione del DNA per concentrare,
desalificare e recuperare il DNA in forma solida
4- Lavaggio del DNA per rimuovere i sali in eccesso
3- Elettroforesi
Fingerprinting
BREEDING
ASSISTITO
Osservazioni del
genotipo
(uso di marcatori
molecolari)
NUOVE
VARIETA’
Il fingerprinting
del DNA (o
impronta
genetica) è una
tecnica che
permette
l’identificazione
individuale a
livello
molecolare,
analizzando le
caratteristiche
uniche del DNA
di un individuo,
rendendolo
riconoscibile e
rintracciabile
Scudo
Arsenal
Giano
Gladio
Aiace
CR LB1
Thaibonnet
Eolo
Sprint
Atlante
Titano
Libero
SIS R215
Apollo
Cadet
Gange
Fragrance
Ellebi
Asso
Artiglio
Tejo
Savio
Lido
Eurosis
Ercole
Koral
Elba
Ariete
Flipper
Delfino
Nembo
Tea
Loto
Luxor
Carmen
Augusto
Rodeo
Elio
Selenio
Perla
0
Aroma
Contenuto di amilosio
L’ascomicete Pyricularia grisea (Cooke) Saccardo è l’agente patogeno
responsabile del brusone, la più grave patologia fungina del riso.
L’identificazione di geni di resistenza in grado di contrastare il patogeno è
un valido strumento da considerare nei programmi di breeding.
I geni di resistenza Pi-ta, Pi-b, Pi-kh e Pi-z conferiscono completa o
parziale resistenza ai ceppi di Pyricularia grisea presenti in Italia.
L’inserimento, mediante incrocio, di uno o più geni Pi (gene pyramiding)
consente l’ottenimento di varietà con resistenza ad ampio spettro al
patogeno, evitando i trattamenti fungicidi.
Specifici marcatori molecolari strettamente associati ai geni Pi
permettono di distinguere i genotipi resistenti e suscettibili.
La 2-acetil-1-pirrolina (2AP) è una delle molecole aromatiche
responsabile del aroma del riso ed è prodotta da tutti i genotipi di riso.
L’enzima Betaina Aldeide Deidrogenasi (BAD2) è coinvolto nel
metabolismo della 2-acetil-1-pirrolina in quanto è in grado di degradare
quest’ultima. Nelle varietà aromatiche, il gene recessivo che codifica per
la BAD2 presenta una delezione di 8 bp, risultando non funzionale.
L’amido di riso è composto da amilosio e amilopectina. Il contenuto di
amilosio, fattore importante della qualità dell’amido, è controllato dal
gene waxy che codifica per l’enzima amido sintasi legata ai granuli (GBSS).
Questo gene presenta dei SNP (Polimorfismi a Singolo Nucleotide) che
sono correlati con il contenuto di amilosio. In particolare gli SNP1 e SNP4
presentano dei polimorfismi, indipendenti dall’interazione genotipoambiente, in grado di classificare i genotipi in 4 gruppi in base al loro
contenuto di amilosio.
0.2
Castelmochi
a
Analisi di fingerprinting
condotta su 72 varietà
italiane con 24 SSR
Amplificazione PCR con RM224 per il gene di resistenza Pi-kh. M: 50 bp;
A, B, D: Controlli interni negativi; C: Controllo interno positivo. I campioni
5 e 6 (Libero, Arsenal) posseggono il gene Pi-kh. I campioni 1, 2, 3, 4, 7
(Albatros, Carmen, Eolo, Scirocco, Ambra) non presentano il gene.
Introgressione del transgene in linee più
produttive (mediante incrocio)
DNA pianta
EVENTI OGM RISO
Riso
Inserimento del costrutto nelle cellule
vegetali
Analisi e scelta delle piante trasformate
(linee transgeniche)
Terminatore
(NOS)
PCR evento-specifica
Preparazione del costrutto di DNA
1- Scelta del gene di interesse
2- Apertura del plasmide
3 e 4- Inserimento del gene di interesse
5- Costrutto pronto
Totipotenza: capacità di una singola cellula
vegetale di riprodurre una pianta intera
Gene di interesse inserito
PCR di Screening
Come si crea un OGM?
Inserimento del costrutto
nelle cellule vegetali
Metodo
biolistico
(particle gun)
Metodo biologico
(Agrobacterium
tumefaciens)
LLrice06
LLrice601
Llrice604
LLrice62
Bt63
KMD1rice
KeFeng6 rice
Huahui-1
Tarom molaii + cry1Ab
Golden Rice 2
Altri…
Aromatico
Amplificazione PCR per il gene Pi-ta con
le primer combination YL153 /YL154 (a)
e YL183 /YL87 (b). M: 100 bp.
Controlli 1: Tequing, 2: Nipponbare
Campioni 3: Venere, 4: Artiglio, 5: Eolo
a
COSTRUTTO OGM
Promotore
(CaMV35S)
Accumulo
2AP
Eterozigote
b
RISO OGM
DNA pianta
Gene BAD2
non funzionale
Degradazione
2AP
Riso
non aromatico
Riso
aromatico
Marcatori molecolari disegnati sul gene BAD2 permettono di distinguere
tra genotipi aromatici, non aromatici ed eterozigoti. L’eterozigosi indica
che il genotipo non è aromatico (breeding) o che si tratta di miscela di
varietà aromatiche e non (prodotto alimentare).
a
OGM (Organismo Geneticamente Modificato): Organismo il cui
materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si
verifica in natura con l’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica
naturale. (Dir. 2001/18/CE)
Gene BAD2
funzionale
Marte
Ambra
Scirocco
Creso
Balilla
Samba
S. Andrea
Brio
Padano (Bahia)
Bravo
Opale
Vialone Nano
Roma
Volano
Arborio
Ulisse
Tosca
Bianca
Baldo
Galileo
Poseidone
Karnak
Carnaroli
Argo
Carnise precoce
Carnise
Albatros
Venere
Artemide
 Varietà convenzionali
 Resistenza a patogeni fungini
 Varietà per usi speciali
(produzione di farine, pasta o birra; waxy)
Geni di resistenza a P. grisea
Cripto
Arpa
Centauro
Differenti tipologie di varietà:
 Varietà con tecnologia Clearfield®
 Lungo B - Lungo A - Medio - Tondo
 Aromatici o tipo Basmati
http://users.ugent.be/~avierstr/
Origine
Promotore
Gene inserito
Terminatore
USA
USA
USA
USA
Cina
Cina
Cina
Cina
Iran
IRRI
CaMV35S
CaMV35S
CaMV35S
CaMV35S
ract-1
CaMV35S
CaMV35S
ract-1
PEPC
?
?
bar (tolleranza al glufosinato)
bar (tolleranza al glufosinato)
bar (tolleranza al glufosinato)
bar (tolleranza al glufosinato)
cry1Ab-Ac (resistenza ai lepidotteri)
cry1Ab (resistenza ai lepidotteri)
cry1Ac + Cp Ti (resistenza agli insetti)
cry1Ab-Ac (resistenza ai lepidotteri)
cry1Ab (resistenza ai lepidotteri)
psy + crt1 (produzione di b-carotene)
35S
NOS
NOS
35S
NOS
NOS
NOS
NOS
35S
?
?
Link utili:
http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm
http://www.gmo-compass.org/eng/home/
http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp
http://www.biosafetyscanner.org/
http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database
http://www.bats.ch/gmo-watch/
Non Aromatico
30.0
28.0
> 26%
26.0
22.0
< 21%
20.0
18.0
16.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
C+G
A+T
marcatori SNP1 + SNP4
Profili molecolari del gene associato al carattere aroma
Profili molecolari di due SNP del gene waxy che discriminano i genotipi in base al loro contenuto di amilosio.
b
Il Laboratorio di Biologia Molecolare effettua un’analisi di
screening OGM «Organismi geneticamente modificati
(OGM): promotore CaMV35S e Terminatore NOS. Analisi
qualitativa in Real - Time PCR ».
A partire da dicembre 2011, attraverso l’adozione di un
Sistema Qualità conforme ai requisiti della Norma UNI CEI
EN ISO/IEC 17025, la prova di screening OGM per la ricerca
del promotore CaMV35S e del terminatore NOS è
accreditata ACCREDIA.
L’analisi di screening OGM viene eseguita su tutte le partite
di seme delle varietà di cui l’ENR è costitutore prima di
essere destinate alla selezione (nuclei, pre-base, base, prima
riproduzione R1 e seconda riproduzione R2). Dopo la
selezione, vengono eseguite le analisi di screening OGM per
singolo lotto delle partite destinate ai moltiplicatori.
< 5%
waxy
14.0
A+G
b
21-26%
24.0
Sprint
Aiace
Eolo
Fragrance
Gladio
Thaibonnet
CR LB1
Artiglio
Tejo
Gange
Elio
Apollo
Cripto
Libero
Vialone Nano
Arsenal
Argo
Carnaroli
Elba
Carnise
Carnise precoce
Arpa
Poseidone
Karnak
Cadet
Padano (Bahia)
Koral
Tosca
Perla
Ercole
Scudo
Balilla
Samba
Opale
Ambra
Delfino
Flipper
Scirocco
Augusto
Ellebi
Galileo
Loto
S. Andrea
Bravo
Rodeo
Asso
Bianca
Selenio
Ariete
Marte
Arborio
Lido
Luxor
Baldo
SIS R215
Volano
Roma
Savio
Ulisse
Giano
Creso
Centauro
Venere
Carmen
Atlante
Tea
Nembo
Albatros
Brio
Artemide
Eurosis
Castelmochi
Osservazioni del
fenotipo
(morfo-fisiologiche
e merceologiche)
Un primer è un filamento di acido nucleico che serve
come punto di innesco per la replicazione del DNA.
APPLICAZIONI DEL BREEDING ASSISTITO CON I MARCATORI MOLECOLARI
BANCA DEL GERMOPLASMA
variabilità genetica
BREEDING
TRADIZIONALE
Appaiamento dei primers alle
regioni loro complementari dei
filamenti di DNA denaturati.
Estensione durante la quale la
Taq polimerasi produce un
filamento di DNA complementare
al filamento di DNA bersaglio.
Molte DNA-polimerasi non possono iniziare la sintesi di
un nuovo filamento "ex novo", ma possono solo
aggiungere nucleotidi ad un filamento pre-esistente.
5- Sospensione del DNA nella soluzione desiderata
COSTITUZIONE DI NUOVE VARIETA’
INCROCI
PCR
35 – 45 cicli
(g/100g)
didiamilosio
Contenuto
amilosio [g/100g]
Contenuto
1- Estrazione del DNA
il DNA è un’ etichetta
molecolare indelebile
che ogni campione
biologico porta con sé
dall’origine alla tavola
del consumatore
(resta presente nel
prodotto finito)
ogni materia prima/prodotto
finito è quindi classificabile
in modo univoco utilizzando
le tecnologie del DNA codice a barre del DNA
le analisi del DNA
permettono di
risalire all’origine
di un prodotto
agroalimentare
anche in assenza
di informazioni
cartacee o di altra
origine
Varietà? In miscela?
Resistente a malattie?
Semidwarf? (a)pigmentato?
Aromatico? OGM?
Contenuto di amilosio?
I marcatori molecolari
danno la risposta!
Open Day 11 Settembre 2013 – Ente Nazionale Risi – Centro Ricerche sul Riso
C+T