Diapositiva 1 - Docenti.unina

Biotecnologie ricombinanti
Dott.ssa Angela Arciello
Laboratorio
Studio
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BIOTECNOLOGIA MOLECOLARE
AUTORI: BERNARD R. GLICK E JACK J. PASTERNAK
CASA EDITRICE: ZANICHELLI
ANALISI DEI GENI E GENOMI
AUTORE: RICHARD J. REECE
CASA EDITRICE : EDISES
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• Proteine
di interesse biotecnologico
• Proteine di interesse terapeutico
• Proteine da utilizzare come antigeni per la
produzione di anticorpi policlonali e monoclonali
• Reagenti per la ricerca di base ed applicata
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E’ virtualmente possibile esprimere geni in sistemi di ogni tipo utilizzando
vettori di espressione appropriati, in funzione di esigenze specifiche
I più diffusi:
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Cellule di lievito
Cellule di insetto/sistemi virali
Cellule vegetali
Cellule di mammifero in coltura
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La sequenza segnale di 24 aa è rimossa
nel RER, con conseguente formazione
della proinsulina.
Nel Golgi sono poi rimossi 33 aa
(connecting sequence) e si instaurano i
legami S-S tra le catene A e B (forma
attiva dell’insulina).
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Insulina era ottenuta dal pancreas bovino o porcino
(usati dal 1922)
(3-5 kg di tessuto pancreatico per paziente per anno)
Insulina bovina differisce dall’insulina umana per 3 amminoacidi
Insulina porcina differisce dall’insulina umana per 1 amminoacido
Tali differenze determinano una risposta immunologica
L’insulina umana è preferita ed è più sicura
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Il gene codificante la proinsulina è stato clonato in un
opportuno plasmide ed espresso in E.coli
L’espressione in E.coli porta alla formazione di corpi di
inclusione ricchi di insulina
Isolamento di insulina dai corpi di inclusione
è un procedimento lungo e costoso
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1978: sintesi dei geni codificanti le catene A e B e clonaggio in 2
vettori di espressione.
I due costrutti sono adoperati per trasformare cellule di E.coli.
Purificazione delle catene A e B e formazione dei ponti disolfurici
in provetta.
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Ampiamente studiato
Facilità di crescita
Vantaggi economici ed “etici”
Le strategie elaborate potrebbero
essere applicabili, in linea di
principio, a tutti i sistemi
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Caratteristiche biologico-molecolari che influenzano la produzione di
proteine ricombinanti:
• Natura delle sequenze promotrici e di arresto della trascrizione
• Forza del sito di legame per il ribosoma
• Numero di copie del gene clonato
• Localizzazione cellulare della proteina estranea
• Efficienza della traduzione nell’organismo ospite
• Stabilità intrinseca della proteina estranea nella cellula ospite
Non esiste un’unica strategia che assicuri la massima espressione di ogni
gene clonato.
La maggior parte dei geni clonati possiede proprietà molecolari peculiari,
le quali impongono di investire tempo e lavoro considerevoli prima di
riuscire a trovare un insieme di condizioni specifico, atto a garantire livelli
di espressione accettabili.
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CARATTERISTICHE GENERALI
Un vettore per l’espressione eterologa deve contenere i seguenti
elementi:
 Origine di replicazione
 Marker di selezione
 Promotore
 Terminatori di trascrizione
 Codoni di terminazione della traduzione
 Multiple cloning sites
 Elementi genetici specifici per determinate applicazioni:
 Sequenze segnale per secrezione
 Sequenze geniche codificanti partners di fusione
 Sequenze geniche codificanti peptidi utili per l’isolamento
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